Name: a method for culturing embryonic c. elegans cells
Uploaded: 2013-09-21T20:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Method for Culturing Embryonic C. elegans Cells Video at JoVE.com

Stjerne (*) angiver nye eller ændrede skridt i forhold til Christensen et al. 1. 1.. Materiale Setup <ol><li> Proceduren for cellekultur kræver store mængder af æg isoleret fra gravide voksne. Grow C. elegans på 8P agarplader podet med NA22 (tilgængelig via C. elegans Genetic Consortium - CGC) bakterier til at isolere store mængder af æg. I disse plader mængden af ​​pepton anvendes er 8 gange den mængde, der normalt anvendes til NGM plade...

C. elegans er en kraftfuld model organisme til at dechifrere de genetiske pathways involveret i udvikling, adfærd og aldring. Dens bekvemmelighed stammer primært fra den lethed, hvormed det kan være genetisk manipuleret, og fra sin korte levetid. På trods af sin bekvemmelighed, C. elegans har sine begrænsninger. C. elegans celler er lille og begrænset inden for en tryksat kutikula, som begrænser anvendelsen af metoder, som kræver direkte adgang til cellerne, såsom elektrofysiologiske ...

Caenorhabditis elegans (C. elegans) er en kraftig model organisme til at undersøge de molekylære grundlag for cellulær funktion, differentiering og adfærd. Mens dens genom, metaboliske og biosynteseveje ligner hvirveldyr &#39;, dets genetiske og molekylær medgørlighed er langt større 2. Blandt dens fordele er dens størrelse og enkel anatomi, dets hurtige livscyklus (3 dage ved 25 ° C), kort levetid (2 dage) og store antal afkom (&gt; 200). På grund af sin hermafroditiske natur og kort levetid, molekylære og genetiske manipulationer er ligetil i C. elegans, herunder produktion af transgene dyr 3,4 og anvendelse af gen-knock-down teknikker såsom RNA-interferens 5.. C. elegans krop og æggeskal er gennemsigtige. Derfor celler kan let visualiseres i både voksen og foster ved hjælp af standard-mikroskopi. I de sidste 40 år, C. elegans </em&gt; samfund har skabt uvurderlige ressourcer for C. elegans forskning, herunder en stor samling af mutanter, knockouts og transgene, en detaljeret beskrivelse af anatomi og udvikling 6,7, herunder den fulde genopbygning af nervesystemet 8, og et helt genom, som er godt kommenteret og til rådighed for hele samfundet ( <a href="http://www.wormbase.com" target="_blank">www.wormbase.com</a> ). På trods af de mange fordele, har nogle eksperimentelle metoder været udfordrende i C. elegans. Disse omfatter dem, der kræver adgang til plasmamembranen af ​​cellerne og isolering af væv eller celletyper. Faktisk C. elegans væv findes inden for dets tryk hydrostatisk skelet, som ikke er let fordøjeligt ved enzymatisk behandling eller rengøringsmidler. I slutningen af 1990&#39;erne Miriam Goodman og Janet Richmond banebrydende metoder til elektrofysiologiske optagelser af C. elegansneuroner og muskelceller situ 9,10. Mens disse metoder gav os et vigtigt indblik i neuronal og muskel funktion in vivo, er de udfordrende og lave gennemløb. Var blevet udviklet alternative metoder til at studere celle funktion in vivo, for det meste især in vivo calcium imaging med genetisk indkodede calcium sensorer såsom GCamP og Cameleon 11-13. Disse metoder dog ikke tillade brug af farmakologiske værktøjer, fordi de anvendes på intakte levende dyr. Det første forsøg på dyrkning C. elegans celler in vitro i stor skala blev lavet af Laird Bloom under udarbejdelsen af sin ph.d.-afhandling 14. Desværre stødt på vanskeligheder med dårlig vedhæftning af cellerne til underlaget, dårlig celledifferentiering og overlevelse forhindrede etableringen af ​​denne tidlige protokol som en robust cellekultur metode. I 1995 offentliggjorde Edgar og kolleger en procedureat undersøge celledeling og morfogenese ved isolering og dyrkning af en enkelt C. elegans embryoner 15. Embryonale celler opnået ved spaltning af æggeskaller med en kombination af enzymatisk behandling og manuel dissociation fortsat proliferere producere op til ~ 500 celler 15. Efterfølgende Leung og medarbejdere dyrkes et lille antal blastomeres at studere tarm-morfogenese. De viste, at en in vitro isolerede E blastomer produceret polariserede tarmceller, der skabte en struktur analog med tarmlumen ved at interagere med hinanden via apikale adherens junctions 16. Buechner og kolleger også rapporteret om en lignende metode til dyrkning C. elegans embryonale celler in vitro 17. Baseret på dette tidlige arbejde, Christensen og kolleger udviklet en robust protokol til dyrkning embryonale C. elegans celler in vitro 1. Deviste, at isolerede C. elegans celler kan differentiere til forskellige celletyper og vedligeholde de funktioner, som de besidder i vivo, herunder afgivelse af celle-specifikke markører. Adskillige teknikker, der udfordrer in vivo, kan anvendes på isolerede C. elegans embryonale celler. Heriblandt elektrofysiologisk 1,18 19, billedbehandling og immunokemiske teknikker 20,21, samt isolering af specifikke celletyper fluorescerende cellesortering (FACS) til opførelse af cellespecifikke cDNA-biblioteker 22,23. Gene Knockdown teknikker såsom RNA-interferens (RNAi) kan anvendes på dyrkede C. elegans celler 1 og en hidtil ukendt metabolisk mærkning under anvendelse azido-sukker som et redskab til glycoprotein opdagelse er for nylig blevet udviklet til in vitro dyrket C. elegans celler 24. Afslutningsvis cellekultur metode udvider array of teknikker, der kan anvendes på C. elegans model i et forsøg på at dechifrere genfunktion i forbindelse med en levende organisme. Vi beskriver her protokollen for dyrkning af C. elegans embryonale celler in vitro, hvilket stort set er baseret på protokol først beskrevet af Christiansen og kolleger 1.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>REAGENTS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacto Peptone</td>
			<td>VWR International Inc.</td>
			<td>90000-382</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Difco Agar Granulated</td>
			<td>VWR International Inc.</td>
			<td>90000-784</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacto Tryptone</td>
			<td>VWR International Inc.</td>
			<td>90000-284</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacto Yeast Extract</td>
			<td>VWR International Inc.</td>
			<td>90000-724</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leibovitz's L-15 Medium (1x) Liquid</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>11415-064</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>16140-063</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-streptomycin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P4333-100ML</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chitinase from Streptomyces Griseus</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C6137-25UN</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NA22 Escherichia coli</td>
			<td>Caenorhabditis Genetics Center</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peanut Lectin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L0881-10MG</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>57903-1KG</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-(+)Glucose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>67528-1KG</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylene glycol-bis (2-aminoethylether), N,N,N',N'- tetraacidic acid (EGTA)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E0396-25G</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hepes</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H3375-500G</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cholesterol</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>57653-1KG</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P9333-500G</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C1016-500G</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M8266-100G</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgSO4</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M2643-500 g</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>K2HPO4</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P2222-500G</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P9791-500G</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOH</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S8045-500G</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KOH</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P1767-500G</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Autoclaved distilled H2O</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bleach</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>EQUIPMENT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>101-1000 &mu;l Blue Graduated Pipet Tips</td>
			<td>USA Scentific</td>
			<td>1111-2821</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 ml Sterilized Pipet Individually Wrapped</td>
			<td>USA Scentific</td>
			<td>1071-0810</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ergonomic Variable Volume (100-1000 &mu;l) Pipettor with tip ejector</td>
			<td>VWR International Inc.</td>
			<td>89079-974</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Portable Pipet Aid, Drummond</td>
			<td>VWR International Inc.</td>
			<td>53498-103</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transfer Plastic Pipet Sterile</td>
			<td>VWR International Inc.</td>
			<td>14670-114</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 ml Conical Tube</td>
			<td>USA Scentific</td>
			<td>1475-1611</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 ml Conical Tube</td>
			<td>USA Scentific</td>
			<td>1500-1811</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile 18 gauge Needles</td>
			<td>Becton, Dickinson and Co.</td>
			<td>305196</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile 10 ml Syringes</td>
			<td>Becton, Dickinson and Co.</td>
			<td>305482</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic Syringe Filters Corning 0,20 &mu;m pore size</td>
			<td>Corning</td>
			<td>431224</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acrodic 25 mm Syringe filter w/5 &mu;m versapor Membrane</td>
			<td>VWR International Inc.</td>
			<td>28144-095</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>60x15 mm Petri Dish Sterile</td>
			<td>VWR International Inc.</td>
			<td>82050-548</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100x15 mm Petri Dish Sterile</td>
			<td>VWR International Inc.</td>
			<td>82050-912</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12 mm Diameter Glass Coverslips</td>
			<td>VWR International Inc.</td>
			<td>48300-560</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clear Cell Culture Plates 24 Well Flat Bottom w/lid</td>
			<td>Thomas scientific</td>
			<td>6902A09</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #5- Fine Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11254-20</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge 5702</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>022629883</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminar Flow Hood</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted Microscope with x10 objective</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ambient air humidified Incubator</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a method for culturing embryonic c. elegans cells

C. elegans er en kraftfuld model system, hvor genetiske og molekylære teknikker er let anvendelig. Indtil for nylig selv, teknikker, der kræver direkte adgang til celler og isolering af bestemte celletyper, ikke kunne anvendes i C. elegans. Denne begrænsning skyldes det faktum, at væv er begrænset inden for en tryksat kutikula, som ikke er let fordøjeligt ved behandling med enzymer og / eller detergenter. Baseret på tidlig pioner arbejde af Laird Bloom, Christensen og kolleger 1 udviklet en robust metode til dyrkning af C. elegans embryonale celler i stor skala. Æggene isoleres fra gravide voksne ved behandling med blegemiddel / NaOH og efterfølgende behandlet med chitinase at fjerne æggeskaller. Embryonale celler dissocieres derefter ved manuel pipettering og udpladet på substrat-dækket glas i serum-berigede medier. Indenfor 24 timer isolation celler begynder at differentiere ved at ændre morfologi og ved at udtrykke celle specifikke markers. C. elegans celler dyrket under anvendelse af denne metode overleve op 2 uger in vitro og er blevet anvendt til elektrofysiologisk, immunkemiske og billedbehandling analyser såvel som de er blevet sorteret og anvendes til microarray profilering.

C. elegans dyrkede celler differentiere og udtrykke celle specifikke markører Christensen og kolleger ved hjælp af trypanblå farvning viste, at&gt; 99% af embryonale C. elegans celler overlever isolation procedure. På dag 9 og 22 efter galvanisering, 85% og 65%, henholdsvis er stadig i live 1. Isoleret embryonale C. elegans celler skal overholde et substrat for at differentiere. Celler, der undlader at overholde danne klumper, og det ikke er klart, om d...

Watch this Scientific Journal Video about A Method for Culturing Embryonic C. elegans Cells Video at JoVE.com

A Method for Culturing Embryonic C. elegans Cells Video (Video) | JoVE

Vi beskriver her en revideret protokol for storstilet kultur embryonale C. elegans celler. Embryonale C. elegans celler dyrket in vitro ved hjælp af denne metode synes at differentiere og rekapitulere ekspression af gener i en celle-specifik måde. Teknikker, der kræver direkte adgang til cellerne eller isolering af specifikke celletyper fra andre væv, kan anvendes på C. elegans dyrkede celler.

En fremgangsmåde til dyrkning Embryonale<em&gt; C. elegans</em&gt; Celler

C. elegans is a powerful model system, in which genetic and molecular techniques are easily applicable. Until recently though, techniques that require ...

Research

JoVE Journal

Biology

A Method for Culturing Embryonic C. elegans Cells

Generation of Stable Transgenic C. elegans Using Microinjection

Generation of Stable Transgenic C. elegans Using Microinjection Video (Video) | JoVE

Transgenic Caenorhabditis elegans can be readily created via microinjection of a DNA plasmid solution into the gonad 1.  The plasmid DNA rearranges to ...

Application of a C. elegans Dopamine Neuron Degeneration Assay for the Validation of Potential Parkinson's Disease Genes

Application of a C. elegans Dopamine Neuron Degeneration Assay for the Validation of Potential Parkinson's Disease Genes Video (Video) | JoVE

Improvements to the diagnosis and treatment of Parkinson's disease (PD) are dependent upon knowledge about susceptibility factors that render populations ...

Chromosomal Spread Preparation of Human Embryonic Stem Cells for Karyotyping

Chromosomal Spread Preparation of Human Embryonic Stem Cells for Karyotyping Video (Video) | JoVE

Although human embryonic stem cells (hESC) have been shown to present a stable diploid karyotype 1, many studies have reported that depending on culture ...

Generation of Transgenic C. elegans by Biolistic Transformation

Generation of Transgenic C. elegans by Biolistic Transformation Video (Video) | JoVE

The number of laboratories using the free living nematode C. elegans is rapidly growing. The popularity of this biological model is attributed to a rapid ...

The Production of C. elegans Transgenes via Recombineering with the galK Selectable Marker

The Production of C. elegans Transgenes via Recombineering with the galK Selectable Marker Video (Video) | JoVE

The creation of transgenic animals is widely utilized in C. elegans research including the use of GFP fusion proteins to study the regulation and ...

Robust Generation of Hepatocyte-like Cells from Human Embryonic Stem Cell Populations

Robust Generation of Hepatocyte-like Cells from Human Embryonic Stem Cell Populations Video (Video) | JoVE

Robust Generering af hepatocyt-lignende celler fra menneskelige embryonale stamceller populationer

Despite progress in modelling human drug toxicity, many compounds fail during clinical trials due to unpredicted side effects. The cost of clinical ...

RNAi Screening to Identify Postembryonic Phenotypes in C. elegans

RNAi Screening to Identify Postembryonic Phenotypes in C. elegans Video (Video) | JoVE

RNAi screening for at identificere Postembryonic fænotyper i C. elegans</em

C. elegans has proven to be a valuable model system for the discovery and functional characterization of many genes and gene pathways1. More sophisticated ...

Preparation of Mouse Embryonic Fibroblast Cells Suitable for Culturing Human Embryonic and Induced Pluripotent Stem Cells

Preparation of Mouse Embryonic Fibroblast Cells Suitable for Culturing Human Embryonic and Induced Pluripotent Stem Cells Video (Video) | JoVE

Udarbejdelse af muse embryonale fibroblastceller anvendes til dyrkning af menneskelige embryoner og induceret pluripotente stamceller

In general, human embryonic stem cells (hESCs) and human induced pluripotent stem cells (hiPSCs)1 can be cultured under variable conditions. However, it ...

A System for ex vivo Culturing of Embryonic Pancreas

A System for ex vivo Culturing of Embryonic Pancreas Video (Video) | JoVE

Et system til<em&gt; Ex vivo</em&gt; Dyrkning af embryonale Pancreas

The pancreas controls vital functions of our body,  including the production of digestive enzymes and regulation of blood sugar  levels1. Although in the ...

Basic Caenorhabditis elegans Methods: Synchronization and Observation

Basic Caenorhabditis elegans Methods: Synchronization and Observation Video (Video) | JoVE

Grundlæggende<em&gt; Caenorhabditis elegans</em&gt; Metoder: Synkronisering og Observation

Research into the molecular and developmental biology of the nematode Caenorhabditis elegans was begun in the early seventies by Sydney Brenner and it has ...