Name: a method for culturing embryonic c. elegans cells
Uploaded: 2013-09-21T20:00:00
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Sternchen (*) zeigen an neuen oder modifizierten Schritten im Vergleich zu Christensen et al. 1 1. Material Einstellungs <ol><li> Das Zellkulturverfahren erfordert große Mengen an Eiern von schwangeren Erwachsenen isoliert. Wachsen C. elegans auf Agar-Platten ausgesät 8P mit NA22 (durch C. elegans Genetic Consortium - CGC) Bakterien, um große Mengen von Eiern zu isolieren. In diesen Platten die Menge Pepton verwendet wird, ist 8-mal der Betrag, der ...

C. elegans ist ein leistungsfähiges Modellorganismus für die Entschlüsselung der genetischen Pfade in der Entwicklung, Verhalten und Alterung beteiligt. Seine Bequemlichkeit liegt vor allem in der Leichtigkeit, mit der sie genetisch manipuliert werden können und von seiner kurzen Lebenszyklus. Trotz seiner Bequemlichkeit, C. elegans hat seine Grenzen. C elegans-Zellen sind klein und in einem unter Druck Cuticula, die die Anwendung von Verfahren, die direkten Zugriff auf die Zellen, wie ele...

Caenorhabditis elegans (C. elegans) ist ein leistungsfähiges Modellorganismus für die Untersuchung der molekularen Grundlagen der zellulären Funktion, Differenzierung und Verhalten. Während sein Genom, Stoffwechsel-und Biosynthesewege ähnlich Wirbeltiere &quot;sind, sind die genetischen und molekularen Lenkbarkeit weit größer 2. Einer der Vorteile sind seine Größe und einfache Anatomie, seiner schnellen Lebenszyklus (3 Tage bei 25 ° C), kurze Lebensdauer (2 Wochen) und große Anzahl von Nachkommen (&gt; 200). Aufgrund seiner Zwitter Natur und kurzen Lebenszyklus, sind molekulare und genetische Manipulationen einfach in C. elegans, einschließlich der Erzeugung von transgenen Tieren 3,4 und die Anwendung der Gen-Knock-down-Verfahren, wie RNA-Interferenz-5. C elegans Körper und Eierschale sind transparent. Daher Zellen leicht sowohl in der Erwachsenen-und der Embryo mit Standard-Mikroskopie sichtbar gemacht werden. In den letzten 40 Jahren hat sich die C. elegans </em&gt; Gemeinde hat wertvolle Ressourcen für C erstellt elegans Forschung, darunter eine große Sammlung von Mutanten, Knockouts und Transgenen, eine detaillierte Beschreibung der Anatomie und Entwicklung 6,7, einschließlich der vollständigen Rekonstruktion des Nervensystems 8, und ein Genom vollständig sequenziert, die gut kommentierten und verfügbar für die ganze Gemeinde ( <a href="http://www.wormbase.com" target="_blank">www.wormbase.com</a> ). Trotz der zahlreichen Vorteile, haben einige experimentelle Ansätze in C. Herausforderung worden elegans. Dazu gehören diejenigen, die Zugang zu der Plasmamembran der Zellen und Isolierung von Geweben oder Zelltypen erforderlich. Tatsächlich C. elegans Gewebe in seinem hydrostatischen Druck Skelett, das nicht leicht durch enzymatische Behandlung oder Detergenzien aufgeschlossen wird beschränkt. Am Ende der 1990er Jahre Miriam Goodman und Janet Richmond Pionier Methoden zur elektrophysiologischen Ableitungen von C. elegansNeuronen und Muskelzellen in situ 9,10. Während diese Verfahren gab uns wichtige Einblicke in die neuronalen und Muskelfunktion in vivo, sie sind anspruchsvoll und geringem Durchsatz. Alternative Methoden, um die Zellfunktion in vivo zu untersuchen entwickelt worden, meist vor allem in vivo Calcium Imaging mit genetisch kodierte Kalzium-Sensoren wie GCamP und came 11-13. Diese Methoden aber nicht die Verwendung von pharmakologischen Tools ermöglichen, weil sie auf intakten lebenden Tieren angewendet. Der erste Versuch Kultivierung C. elegans-Zellen in vitro in großem Maßstab wurde von Laird Bloom während der Vorbereitung seiner Doktorarbeit 14 gemacht. Leider mit schlechter Adhäsion der Zellen an das Substrat auf Schwierigkeiten gestoßen, schlechte Zelldifferenzierung und das Überleben verhindert die Einrichtung dieser frühen Protokoll als robuste Zellkulturverfahren. Im Jahr 1995 Edgar und Kollegen veröffentlichten eine ProzedurZellteilung und Morphogenese durch Isolierung und Kultur von einer einzigen C zu untersuchen. elegans Embryonen 15. Embryonale Zellen durch Verdau der Eierschalen mit einer Kombination aus enzymatischer Behandlung und manuelle Dissoziation erhalten, weiter zu vermehren, produzieren bis zu ~ 500 Zellen 15. Anschließend Leung und Mitarbeiter kultiviert eine kleine Anzahl von Blastomeren Darm Morphogenese studieren. Sie zeigten, dass eine in vitro isolierten E Blastomere hergestellt polarisierten Darmzellen, die eine analoge Struktur des Darmlumens durch Wechselwirkung miteinander durch apikalen Adhärenzverbindungen 16 angelegt. Büchner und Kollegen auch ein ähnliches Verfahren für die Kultivierung C. elegans embryonalen Zellen in vitro 17. Basierend auf dieser frühen Arbeit Tensen und Kollegen entwickelt einen robusten Protokoll zur Kultivierung von embryonalen C. elegans-Zellen in vitro 1. Siezeigten, dass isolierte C. elegans-Zellen können in verschiedene Zelltypen zu differenzieren und Aufrechterhaltung der Funktionen, die sie in vivo besitzen, einschließlich der Expression von zellspezifische Marker. Verschiedene Techniken, die in vivo eine Herausforderung sind, können auf isolierte C angewendet werden elegans embryonalen Zellen. Diese umfassen elektro 1,18 19, Bildgebung und immunchemische Techniken 20,21, sowie die Isolierung von spezifischen Zelltypen durch Fluorescent Activated Cell Sorting (FACS) für den Aufbau von Zell-spezifische cDNA-Bibliotheken 22,23. Gen-Knockdown-Techniken wie RNA-Interferenz (RNAi) auf kultivierte C angewendet werden elegans-Zellen 1 und ein neuartiges Verfahren unter Verwendung von metabolischer Markierung Azido-Zucker als Werkzeug für Glykoprotein Entdeckung wurde kürzlich für die in vitro kultiviert C entwickelt elegans Zellen 24. Im Ergebnis dehnt sich das Zellkulturverfahren der Anordnung of Techniken, die dem C angewendet werden können elegans-Modell in dem Bemühen, Gen-Funktion in Zusammenhang mit einem lebenden Organismus zu entschlüsseln. Wir beschreiben hier das Protokoll für die Kultivierung von C. elegans embryonalen Zellen in vitro, die weitgehend auf dem Protokoll zuerst von Christiansen und Kollegen 1 beschrieben basiert.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>REAGENTS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacto Peptone</td>
			<td>VWR International Inc.</td>
			<td>90000-382</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Difco Agar Granulated</td>
			<td>VWR International Inc.</td>
			<td>90000-784</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacto Tryptone</td>
			<td>VWR International Inc.</td>
			<td>90000-284</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacto Yeast Extract</td>
			<td>VWR International Inc.</td>
			<td>90000-724</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leibovitz's L-15 Medium (1x) Liquid</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>11415-064</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>16140-063</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-streptomycin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P4333-100ML</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chitinase from Streptomyces Griseus</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C6137-25UN</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NA22 Escherichia coli</td>
			<td>Caenorhabditis Genetics Center</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peanut Lectin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L0881-10MG</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>57903-1KG</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-(+)Glucose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>67528-1KG</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylene glycol-bis (2-aminoethylether), N,N,N',N'- tetraacidic acid (EGTA)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E0396-25G</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hepes</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H3375-500G</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cholesterol</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>57653-1KG</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P9333-500G</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C1016-500G</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M8266-100G</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgSO4</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M2643-500 g</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>K2HPO4</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P2222-500G</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P9791-500G</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOH</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S8045-500G</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KOH</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P1767-500G</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Autoclaved distilled H2O</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bleach</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>EQUIPMENT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>101-1000 &mu;l Blue Graduated Pipet Tips</td>
			<td>USA Scentific</td>
			<td>1111-2821</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 ml Sterilized Pipet Individually Wrapped</td>
			<td>USA Scentific</td>
			<td>1071-0810</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ergonomic Variable Volume (100-1000 &mu;l) Pipettor with tip ejector</td>
			<td>VWR International Inc.</td>
			<td>89079-974</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Portable Pipet Aid, Drummond</td>
			<td>VWR International Inc.</td>
			<td>53498-103</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transfer Plastic Pipet Sterile</td>
			<td>VWR International Inc.</td>
			<td>14670-114</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 ml Conical Tube</td>
			<td>USA Scentific</td>
			<td>1475-1611</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 ml Conical Tube</td>
			<td>USA Scentific</td>
			<td>1500-1811</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile 18 gauge Needles</td>
			<td>Becton, Dickinson and Co.</td>
			<td>305196</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile 10 ml Syringes</td>
			<td>Becton, Dickinson and Co.</td>
			<td>305482</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic Syringe Filters Corning 0,20 &mu;m pore size</td>
			<td>Corning</td>
			<td>431224</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acrodic 25 mm Syringe filter w/5 &mu;m versapor Membrane</td>
			<td>VWR International Inc.</td>
			<td>28144-095</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>60x15 mm Petri Dish Sterile</td>
			<td>VWR International Inc.</td>
			<td>82050-548</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100x15 mm Petri Dish Sterile</td>
			<td>VWR International Inc.</td>
			<td>82050-912</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12 mm Diameter Glass Coverslips</td>
			<td>VWR International Inc.</td>
			<td>48300-560</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clear Cell Culture Plates 24 Well Flat Bottom w/lid</td>
			<td>Thomas scientific</td>
			<td>6902A09</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #5- Fine Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11254-20</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge 5702</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>022629883</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminar Flow Hood</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted Microscope with x10 objective</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ambient air humidified Incubator</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a method for culturing embryonic c. elegans cells

C. elegans ist ein leistungsfähiges Modellsystem, in der genetischen und molekularen Techniken sind leicht anwendbar. Bis vor kurzem aber Techniken, die direkten Zugang zu den Zellen und Isolierung von spezifischen Zelltypen benötigen, konnten nicht in C angewendet werden elegans. Diese Beschränkung resultiert aus der Tatsache, dass Gewebe in einem unter Druck Kutikula, die nicht leicht durch die Behandlung mit Enzymen und / oder Detergenzien aufgeschlossen wird beschränkt. Basierend auf frühen Pionierarbeit von Laird Bloom, Christensen und Kollegen entwickelten ein ein robustes Verfahren für die Kultivierung von C. elegans embryonalen Zellen in großem Maßstab. Die Eier werden von schwangeren Erwachsenen durch Behandlung mit Bleichmittel / NaOH isoliert und anschließend mit Chitinase behandelt, um die Eierschalen zu entfernen. Embryonale Zellen werden dann durch manuelles Pipettieren dissoziiert und auf das Substrat beschichtete Glas im Serum angereicherten Medien ausplattiert. Innerhalb von 24 Stunden von Isolationszellen beginnen, indem Morphologie und durch zellspezifische marke ausdrücken unterscheidenrs. C elegans Zellen mit dieser Methode kultiviert überleben bis 2 Wochen in vitro und haben für elektrophysiologische, immun verwendet, und Bildanalysen sowie wurden sie sortiert und für die Microarray-Profiling eingesetzt.

C. elegans kultivierten Zellen zu differenzieren und Express-Zell-spezifische Marker Christensen und Kollegen mit Trypanblaufärbung gezeigt, dass&gt; 99% der embryonalen C. elegans Zellen überleben die Isolierungsverfahren. Am Tag 9 und 22 nach dem Plattieren, 85% und 65%, bzw. 1 sind noch am Leben. Isoliert embryonalen C. elegans-Zellen müssen auf ein Substrat, um zu unterscheiden haften. Zellen, die Klumpen bilden nicht einhalten und es ist nicht klar,...

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A Method for Culturing Embryonic C. elegans Cells Video (Video) | JoVE

Wir beschreiben hier eine überarbeitete Protokoll für die groß angelegte Kultur von embryonalen C. elegans-Zellen. Embryonale C. elegans in vitro kultivierte Zellen unter Verwendung dieses Verfahrens scheinen in einer zellspezifischen Weise zu differenzieren und zu rekapitulieren, die Expression von Genen. Techniken, die direkten Zugriff auf die Zellen oder Isolierung von spezifischen Zelltypen aus den anderen Geweben erfordern kann auf C angewendet werden elegans kultivierten Zellen.

Ein Verfahren zur Kultivierung von embryonalen<em&gt; C. elegans</em&gt; Zellen

C. elegans is a powerful model system, in which genetic and molecular techniques are easily applicable. Until recently though, techniques that require ...

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