Name: a method for culturing embryonic c. elegans cells
Uploaded: 2013-09-21T20:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Method for Culturing Embryonic C. elegans Cells Video at JoVE.com

כוכביות (*) מצביעות על צעדים חדשים או שונה בהשוואה לכריסטנסן et al. 1 1. התקנת חומר <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הליך תרבית תאים דורש כמויות גדולות של ביצים מבודדות ממבוגרים הרה. לגדול ג elegans על 8P צל?...

סי אלגנס הוא אורגניזם מודל רב עוצמה לפענוח המסלולים הגנטיים מעורבים בפיתוח, התנהגות והזדקנות. הנוחות שלה נובעת בעיקר מההקלות שבה ניתן להשפיע מבחינה גנטית וממחזור החיים הקצר שלה. למרות הנוחות שלה, ג יש elegans מגבלותיו. ג תאי elegans הם זעירים ומוגבל ...

elegans Caenorhabditis (סי אלגנס) הוא אורגניזם מודל רב עוצמה לחקירת הבסיסים המולקולריים של תפקוד תאי, התמיינות, והתנהגות. בעוד הגנום, חילוף החומרים ומסלולי biosynthetic דומים לבעלי חוליות &quot;, העקיבות הגנטיות והמולקולרית שלו הן הרבה יותר גדולות 2. בין יתרונותיה לגודלה ואנטומיה פשוטה, המחזור המהיר שלה חיים (3 ימים ב25 מעלות צלזיוס), תוחלת חיים קצרה (2 שבועות) ומספר רב של צאצאים (&gt; 200) הם. בשל אופי hermaphroditic ומחזור חיים קצר, מניפולציות מולקולריות וגנטיות הן פשוט בג elegans, הכולל את הדור של בעלי חיים מהונדסים 3,4 והיישום של טכניקות עקומות למטה גן כגון התערבות RNA 5. ג גוף elegans וקליפת ביצה הם שקופים. לכן ניתן דמיינו תאים בקלות בשני המבוגרים והעובר באמצעות מיקרוסקופ רגיל. ב40 השנים האחרונות, ג elegans </em&gt; הקהילה יצרה משאבים רב ערך עבור ג מחקר elegans כולל אוסף גדול של מוטציות, knockouts וtransgenics, תיאור מפורט של האנטומיה ופיתוח 6,7, כולל השחזור המלא של מערכת העצבים 8, ולחלוטין הגנום רצף אשר מבואר וזמין לכל הקהילה גם ( <a href="http://www.wormbase.com" target="_blank">www.wormbase.com).</a> למרות יתרונות הרבים, חלקם גישות ניסיוניות כבר מאתגרות בג elegans. אלה כוללים את אלה שדורשים נגישות לקרום הפלזמה של התאים והבידוד של רקמות או סוגי תאים. ואכן C. רקמות elegans מוגבלות בתוך השלד שלה בלחץ ההידרוסטטי, שאינו מתעכל בקלות על ידי טיפול או בדטרגנטים האנזימטית. בסופו של 1990 מרים גודמן וג&#39;נט ריצ&#39;מונד חלוץ שיטות עבור קלטות אלקטרו של ג elegansנוירונים ותאי שריר באתר 9,10. בעוד שיטות אלו נתנו לנו תובנות חשובות עצבי ותפקוד שרירים in vivo, הם מאתגרים ותפוקה נמוכה. שיטות אלטרנטיביים ללמוד את תפקוד תא in vivo שפותחו, בעיקר בעיקר בסידן ההדמיה vivo באמצעות חיישני סידן מקודד גנטי כגון GCamP וCameleon 11-13. שיטות אלה אף, אינן מאפשרים שימוש בכלים תרופתיים משום שהם חלים על בעלי חי חיים בשלמותה. הניסיון הראשון בג culturing תאי elegans במבחנה בקנה מידה גדולה נעשו על ידי לרד בלום במהלך תקופת ההכנה של עבודת הדוקטורט שלו 14. למרבה הצער, קשיים עם הידבקות לקויה של התאים למצע, התמיינות תאים עני והישרדות מנעו את הקמתו של הפרוטוקול בתחילת כשיטת תרבית תאים חזקה. בשנת 1995 אדגר ועמיתיו פרסמו נוהלכדי לחקור את חלוקת תא והמורפוגנזה ידי בידוד והתרבות של C אחד. elegans עוברי 15. תאים עובריים שהושגו על ידי עיכול של קליפות הביצים עם שילוב של טיפול אנזימטי וניתוק ידני, המשיכו להתרבות, לייצר עד ~ 500 תאים 15. בהמשך לכך, ליונג ועמיתים לעבודה בתרבית מספר קטן של לסטומרים ללמוד המורפוגנזה מעיים. הם הראו כי במבחנה blastomere E המבודדת אחד המיוצר בתאי מעיים מקוטבים שיצרו מבנה מקביל ללומן מעיים על ידי אינטראקציה אחד עם השני דרך צמתים adherens פסגת 16. Buechner ועמיתיו גם דיווחו בשיטה דומה לC culturing. elegans תאים עובריים במבחנה 17. בהתבסס על עבודה מוקדמת זו, כריסטנסן ועמיתיו פיתחו פרוטוקול חזק עבור culturing C העוברי. elegans תאים במבחנה 1. הםהראה כי C המבודד. elegans תאים יכולים להתמיין לסוגי תאים שונים ולשמור על התכונות שיש להם in vivo, כולל הביטוי של סמנים ספציפיים בתא. כמה טכניקות שמאתגרות in vivo, יכולות להיות מיושמות על ג המבודד elegans תאים עובריים. אלה כוללים 1,18 19 אלקטרו, הדמיה וטכניקות immunochemical 20,21, כמו גם בידוד של סוגי תאים ספציפיים על ידי Cell-Activated פלורסנט מיון (FACS) לבניית ספריות cDNA תא ספציפי 22,23. ניתן ליישם טכניקות ג&#39;ין מציאה כגון התערבות RNA (RNAi) בג בתרבית elegans תאי 1 ושיטת תיוג מטבולי רומן באמצעות Azido סוכר ככלי לגילוי גליקופרוטאין פותחו לאחרונה במבחנת ג בתרבית תאי elegans 24. לסיכום, שיטת תרבית תאים מרחיבה את מערך oטכניקות ו שיכול להיות מיושמות על ג דגם elegans במאמץ לפענח את תפקוד גן בהקשר של האורגניזם חי. אנו מתארים כאן את הפרוטוקול לculturing ג elegans תאים עובריים במבחנה, המבוססת במידה רבה על הפרוטוקול שתואר לראשונה על ידי כריסטיאנסן ו1 עמיתים לעבודה.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>REAGENTS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacto Peptone</td>
			<td>VWR International Inc.</td>
			<td>90000-382</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Difco Agar Granulated</td>
			<td>VWR International Inc.</td>
			<td>90000-784</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacto Tryptone</td>
			<td>VWR International Inc.</td>
			<td>90000-284</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacto Yeast Extract</td>
			<td>VWR International Inc.</td>
			<td>90000-724</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leibovitz's L-15 Medium (1x) Liquid</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>11415-064</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>16140-063</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-streptomycin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P4333-100ML</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chitinase from Streptomyces Griseus</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C6137-25UN</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NA22 Escherichia coli</td>
			<td>Caenorhabditis Genetics Center</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peanut Lectin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L0881-10MG</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>57903-1KG</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-(+)Glucose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>67528-1KG</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylene glycol-bis (2-aminoethylether), N,N,N',N'- tetraacidic acid (EGTA)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E0396-25G</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hepes</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H3375-500G</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cholesterol</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>57653-1KG</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P9333-500G</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C1016-500G</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M8266-100G</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgSO4</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M2643-500 g</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>K2HPO4</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P2222-500G</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P9791-500G</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOH</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S8045-500G</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KOH</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P1767-500G</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Autoclaved distilled H2O</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bleach</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>EQUIPMENT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>101-1000 &mu;l Blue Graduated Pipet Tips</td>
			<td>USA Scentific</td>
			<td>1111-2821</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 ml Sterilized Pipet Individually Wrapped</td>
			<td>USA Scentific</td>
			<td>1071-0810</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ergonomic Variable Volume (100-1000 &mu;l) Pipettor with tip ejector</td>
			<td>VWR International Inc.</td>
			<td>89079-974</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Portable Pipet Aid, Drummond</td>
			<td>VWR International Inc.</td>
			<td>53498-103</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transfer Plastic Pipet Sterile</td>
			<td>VWR International Inc.</td>
			<td>14670-114</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 ml Conical Tube</td>
			<td>USA Scentific</td>
			<td>1475-1611</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 ml Conical Tube</td>
			<td>USA Scentific</td>
			<td>1500-1811</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile 18 gauge Needles</td>
			<td>Becton, Dickinson and Co.</td>
			<td>305196</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile 10 ml Syringes</td>
			<td>Becton, Dickinson and Co.</td>
			<td>305482</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic Syringe Filters Corning 0,20 &mu;m pore size</td>
			<td>Corning</td>
			<td>431224</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acrodic 25 mm Syringe filter w/5 &mu;m versapor Membrane</td>
			<td>VWR International Inc.</td>
			<td>28144-095</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>60x15 mm Petri Dish Sterile</td>
			<td>VWR International Inc.</td>
			<td>82050-548</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100x15 mm Petri Dish Sterile</td>
			<td>VWR International Inc.</td>
			<td>82050-912</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12 mm Diameter Glass Coverslips</td>
			<td>VWR International Inc.</td>
			<td>48300-560</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clear Cell Culture Plates 24 Well Flat Bottom w/lid</td>
			<td>Thomas scientific</td>
			<td>6902A09</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #5- Fine Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11254-20</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge 5702</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>022629883</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminar Flow Hood</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted Microscope with x10 objective</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ambient air humidified Incubator</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a method for culturing embryonic c. elegans cells

סי אלגנס הוא מערכת מודל רבת עוצמה, שבו טכניקות גנטיות ומולקולריים הן ישימות בקלות. עד לאחרונה אם כי, טכניקות הדורשות גישה ישירה לתאים ובידוד של תאים מסוגים מסוימים, לא יכולים להיות מיושמות בג elegans. מגבלה זו הייתה בשל העובדה שרקמות מוגבלות בתוך ציפורן בלחץ שאינו מתעכל בקלות על ידי טיפול עם אנזימים ו / או חומרי ניקוי. בהתבסס על עבודה חלוצה מוקדם על ידי לרד בלום, כריסטנסן ועמיתים 1 פיתח שיטה חזקה לculturing ג elegans תאים עובריים בקנה מידה גדולה. ביצים מבודדות ממבוגרים הרה להולדת על ידי טיפול עם אקונומיקה / NaOH ולאחר מכן טופלו בchitinase כדי להסיר את קליפות הביצים. לאחר מכן תאים עובריים הם ניתקו על ידי pipetting הידני ומצופים על זכוכית מכוסה מצע בתקשורת מועשר בסרום. בתוך 24 שעות של תאי בידוד מתחיל להבחין על ידי שינוי מורפולוגיה ועל ידי הבעת marke תאים הספציפיrs. ג elegans תאים בתרבית בשיטה זו לשרוד עד 2 שבועות במבחנה והיה בשימוש במשך אלקטרו, immunochemical, והדמיה מנתח, כמו גם שהם כבר מסודרים ומשמשים לאפיון microarray.

C. elegans תאים בתרבית להבדיל ותא מפורש סמנים ספציפיים כריסטנסן ועמיתים באמצעות מכתים trypan הכחול הוכיחו כי&gt; 99% ג העוברי תאי elegans לשרוד את הליך הבידוד. ביום 9 ו22 לאחר ציפוי, 85% ו65% בהתאמה עדיין בחיים 1. ג העוברי המב?...

Watch this Scientific Journal Video about A Method for Culturing Embryonic C. elegans Cells Video at JoVE.com

A Method for Culturing Embryonic C. elegans Cells Video (Video) | JoVE

אנו מתארים כאן פרוטוקול מתוקן לתרבות בקנה מידה גדולה של ג העוברי elegans תאים. עוברי ג elegans תאים בתרבית במבחנה באמצעות שיטה זו, מופיעים כדי לבדל ולשחזר את הביטוי של גנים באופן ספציפי בתא. טכניקות הדורשות גישה ישירה לתאים או בידוד של סוגי תאים ספציפיים מרקמות האחרות יכולות להיות מיושמות על ג elegans תאים בתרבית.

שיטה לCulturing עוברי<em&gt; ג elegans</em&gt; תאים

C. elegans is a powerful model system, in which genetic and molecular techniques are easily applicable. Until recently though, techniques that require ...

Research

JoVE Journal

Biology

A Method for Culturing Embryonic C. elegans Cells

Generation of Stable Transgenic C. elegans Using Microinjection

Generation of Stable Transgenic C. elegans Using Microinjection Video (Video) | JoVE

הדור של Stable טראנסגנטי C. elegans שימוש Microinjection

Transgenic Caenorhabditis elegans can be readily created via microinjection of a DNA plasmid solution into the gonad 1.  The plasmid DNA rearranges to ...

Application of a C. elegans Dopamine Neuron Degeneration Assay for the Validation of Potential Parkinson's Disease Genes

Application of a C. elegans Dopamine Neuron Degeneration Assay for the Validation of Potential Parkinson's Disease Genes Video (Video) | JoVE

יישום של C. elegans Assay ניוון Neuron דופמין עבור אימות של מחלת פרקינסון גנים אפשריים

Improvements to the diagnosis and treatment of Parkinson's disease (PD) are dependent upon knowledge about susceptibility factors that render populations ...

Chromosomal Spread Preparation of Human Embryonic Stem Cells for Karyotyping

Chromosomal Spread Preparation of Human Embryonic Stem Cells for Karyotyping Video (Video) | JoVE

מורחים הכנה כרומוזומלית של בתאי גזע עובריים אנושיים עבור Karyotyping

Although human embryonic stem cells (hESC) have been shown to present a stable diploid karyotype 1, many studies have reported that depending on culture ...

Generation of Transgenic C. elegans by Biolistic Transformation

Generation of Transgenic C. elegans by Biolistic Transformation Video (Video) | JoVE

דור טראנסגנטי ג elegans על ידי שינוי Biolistic

The number of laboratories using the free living nematode C. elegans is rapidly growing. The popularity of this biological model is attributed to a rapid ...

The Production of C. elegans Transgenes via Recombineering with the galK Selectable Marker

The Production of C. elegans Transgenes via Recombineering with the galK Selectable Marker Video (Video) | JoVE

הייצור של ג elegans Transgenes דרך Recombineering עם GalK לבחירה מרקר

The creation of transgenic animals is widely utilized in C. elegans research including the use of GFP fusion proteins to study the regulation and ...

Robust Generation of Hepatocyte-like Cells from Human Embryonic Stem Cell Populations

Robust Generation of Hepatocyte-like Cells from Human Embryonic Stem Cell Populations Video (Video) | JoVE

הדור יציבה של hepatocyte דמויי תאים של אדם אוכלוסיות תאים גזע עובריים

Despite progress in modelling human drug toxicity, many compounds fail during clinical trials due to unpredicted side effects. The cost of clinical ...

RNAi Screening to Identify Postembryonic Phenotypes in C. elegans

RNAi Screening to Identify Postembryonic Phenotypes in C. elegans Video (Video) | JoVE

RNAi הקרנת לזהות פנוטיפים Postembryonic ב ג elegans</em

C. elegans has proven to be a valuable model system for the discovery and functional characterization of many genes and gene pathways1. More sophisticated ...

Preparation of Mouse Embryonic Fibroblast Cells Suitable for Culturing Human Embryonic and Induced Pluripotent Stem Cells

Preparation of Mouse Embryonic Fibroblast Cells Suitable for Culturing Human Embryonic and Induced Pluripotent Stem Cells Video (Video) | JoVE

הכנת עובריים של עכברים תאים פיברובלסטים מתאים האדם culturing תאים עובריים pluripotent המושרה בתאי גזע

In general, human embryonic stem cells (hESCs) and human induced pluripotent stem cells (hiPSCs)1 can be cultured under variable conditions. However, it ...

A System for ex vivo Culturing of Embryonic Pancreas

A System for ex vivo Culturing of Embryonic Pancreas Video (Video) | JoVE

מערכת ל<em&gt; Vivo לשעבר</em&gt; Culturing של לבלב עוברי

The pancreas controls vital functions of our body,  including the production of digestive enzymes and regulation of blood sugar  levels1. Although in the ...

Basic Caenorhabditis elegans Methods: Synchronization and Observation

Basic Caenorhabditis elegans Methods: Synchronization and Observation Video (Video) | JoVE

בסיסי<em&gt; Caenorhabditis elegans</em&gt; שיטות: סנכרון תצפית

Research into the molecular and developmental biology of the nematode Caenorhabditis elegans was begun in the early seventies by Sydney Brenner and it has ...