Name: a method for culturing embryonic c. elegans cells
Uploaded: 2013-09-21T20:00:00
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クリステンセンらと比較して、アスタリスク（*）は、新規または変更されたステップを示している。1 1。素材のセットアップ<ol><li>細胞培養手順が妊娠成人から単離された卵を大量に必要とする。 Cを育てる卵を大量に分離するために、細菌- エレガンス 8P寒天プレート上NA22（CGC 虫遺伝コンソーシアムを通じて利用可能）を播?...

線虫は、開発、行動や老化に関与する遺伝的経路を解読するための強力なモデル生物である。その利便性は、主にそれが遺伝子操作することができる容易さから、その短いライフサイクルから生じる。その便利さにもかかわらず、C.虫には限界があります。 で虫細胞は、そのような小さな電気生理学的及び薬理学的技術、またはこのようなマイクロアレイ解析による遺伝...

線虫（Caenorhabditis elegans）（虫 ） は、細胞の機能、分化、および行動の分子基盤を調査するための強力なモデル生物である。そのゲノム、代謝および生合成経路は、脊椎動物&#39;に似ていますが、その遺伝的および分子扱いやすには、2はるかに大きい。その利点の中でも、その大きさと単純な解剖学的構造、その迅速なライフサイクル（25℃で3日間）、短寿命（2週）および子孫の大多数（&gt; 200）である。 、その雌雄同体自然と短いライフサイクルに、分子·遺伝子操作は、C言語で簡単ですトランスジェニック動物3,4、およびそのようなRNA干渉5のような遺伝子ノックダウン技術の適用の生成を含む線虫、C.虫体と卵の殻が透明です。従って細胞は、容易に標準的な顕微鏡を使用して、成体および胚の両方で可視化することができる。過去40年間で、C.虫 </EM&gt;コミュニティは、C.のための非常に貴重なリソースを作成しました突然変異体、ノックアウトおよびトランスジェニックの大規模なコレクション、神経系8の完全復興を含む解剖学と開発6,7の詳細な説明、よく注釈付きやコミュニティ全体で使用可能な完全に配列ゲノム（含む虫研究 <a href="http://www.wormbase.com" target="_blank">www.wormbase.com</a> ）。 多くの利点にもかかわらず、いくつかの実験的アプローチは、C言語で挑戦してきた虫 。これらは、組織または細胞型の細胞および単離の原形質膜へのアクセス可能性を必要とするものが挙げられる。確かにC。虫の組織は簡単に酵素処理または界面活性剤によって消化されない、その加圧された流体静力学的骨格内に閉じ込められる。 1990年代の終わりに、ミリアム·グッドマンとジャネットリッチモンドでの電気生理学的記録のための方法を開拓した虫その場 9,10 の神経細胞や筋肉細胞。これらの方法は、生体内での神経や筋肉の機能に私たちに重要な洞察を与えたが、彼 ​​らは挑戦的で低スループットである。 インビボで細胞機能を研究するための代替方法は、主に、特に、そのようなGCamPとカメレオン11-13として遺伝的にコードされたカルシウムセンサを用いてインビボカルシウムイメージングでは 、開発した。彼らは無傷で生きている動物に適用されるため、これらの方法は、しかし、薬理学的なツールの使用を許可していない。 培養にて最初の試み大規模な生体外での線虫細胞は、彼の博士論文14の調製時レアード·ブルームによって作られた。残念ながら、基板に対する細胞の接着不良で遭遇する困難は、貧弱な細胞分化および生存は、堅牢な細胞培養法として、この初期のプロトコルの確立を防止する。 1995年にエドガーらは手順を公表単一のCの単離および培養することによって細胞分裂と形態形成を調査する。虫は 15胚。酵素処理と手動解離の組み合わせで卵の殻の消化によって得られた胚細胞は、〜500のセル15までの生産、増殖し続けた。その後、レオンらは腸の形態形成を研究する割球数の少ない培養した。彼らは、1 試験管内孤立のE割球は、頂端接着結合16を介して互いに相互作用することにより、腸管腔に類似した構造を作成した偏腸細胞を生成することを示した。ブフナーらはまた、Cを培養するための同様の方法を報告した。試験管 17 内の胚細胞エレガンス 。 この初期の研究に基づいて、クリステンセンらは、胚のCを培養するための堅牢なプロトコルを開発した。試験管 1 で細胞エレガンス 。彼らその孤立したCが示された。虫細胞は、様々な細胞型に分化し、細胞特異的マーカーの発現を含め、それらがインビボで有する機能を維持することができる。 インビボで挑戦しているいくつかの技術は、単離されたC.上に塗布することができる胚細胞エレガンス 。これらは、電気生理学1,18 19、撮像、免疫化学的技法20,21、ならびに細胞特異的cDNAライブラリーの構築のため22,23（FACS）を蛍光活性化セルソーティングにより特定の細胞型の単離を含む。このようなRNA干渉（RNAi）などの遺伝子ノックダウン技術は、培養されたC.上に塗布することができる虫細胞1および糖タンパク質の発見のためのツールとしてアジド糖を用いて新規な代謝標識法は最近、 インビトロで培養C.ために開発されている虫の細胞24。 結論として、細胞培養法は、アレイを展開oをC.に適用することができるfの技法生体の文脈において遺伝子機能を解読するための努力においてエレガンスモデル 。ここではCを培養するためのプロトコルを記述大部分は最初のクリスチャンセンら1によって記述されたプロトコルに基づいており、in vitroで胚細胞を、 虫 。

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>REAGENTS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacto Peptone</td>
			<td>VWR International Inc.</td>
			<td>90000-382</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Difco Agar Granulated</td>
			<td>VWR International Inc.</td>
			<td>90000-784</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacto Tryptone</td>
			<td>VWR International Inc.</td>
			<td>90000-284</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacto Yeast Extract</td>
			<td>VWR International Inc.</td>
			<td>90000-724</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leibovitz's L-15 Medium (1x) Liquid</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>11415-064</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>16140-063</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-streptomycin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P4333-100ML</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chitinase from Streptomyces Griseus</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C6137-25UN</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NA22 Escherichia coli</td>
			<td>Caenorhabditis Genetics Center</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peanut Lectin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L0881-10MG</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>57903-1KG</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-(+)Glucose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>67528-1KG</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylene glycol-bis (2-aminoethylether), N,N,N',N'- tetraacidic acid (EGTA)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E0396-25G</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hepes</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H3375-500G</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cholesterol</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>57653-1KG</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P9333-500G</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C1016-500G</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M8266-100G</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgSO4</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M2643-500 g</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>K2HPO4</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P2222-500G</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P9791-500G</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOH</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S8045-500G</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KOH</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P1767-500G</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Autoclaved distilled H2O</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bleach</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>EQUIPMENT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>101-1000 &mu;l Blue Graduated Pipet Tips</td>
			<td>USA Scentific</td>
			<td>1111-2821</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 ml Sterilized Pipet Individually Wrapped</td>
			<td>USA Scentific</td>
			<td>1071-0810</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ergonomic Variable Volume (100-1000 &mu;l) Pipettor with tip ejector</td>
			<td>VWR International Inc.</td>
			<td>89079-974</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Portable Pipet Aid, Drummond</td>
			<td>VWR International Inc.</td>
			<td>53498-103</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transfer Plastic Pipet Sterile</td>
			<td>VWR International Inc.</td>
			<td>14670-114</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 ml Conical Tube</td>
			<td>USA Scentific</td>
			<td>1475-1611</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 ml Conical Tube</td>
			<td>USA Scentific</td>
			<td>1500-1811</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile 18 gauge Needles</td>
			<td>Becton, Dickinson and Co.</td>
			<td>305196</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile 10 ml Syringes</td>
			<td>Becton, Dickinson and Co.</td>
			<td>305482</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic Syringe Filters Corning 0,20 &mu;m pore size</td>
			<td>Corning</td>
			<td>431224</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acrodic 25 mm Syringe filter w/5 &mu;m versapor Membrane</td>
			<td>VWR International Inc.</td>
			<td>28144-095</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>60x15 mm Petri Dish Sterile</td>
			<td>VWR International Inc.</td>
			<td>82050-548</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100x15 mm Petri Dish Sterile</td>
			<td>VWR International Inc.</td>
			<td>82050-912</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12 mm Diameter Glass Coverslips</td>
			<td>VWR International Inc.</td>
			<td>48300-560</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clear Cell Culture Plates 24 Well Flat Bottom w/lid</td>
			<td>Thomas scientific</td>
			<td>6902A09</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #5- Fine Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11254-20</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge 5702</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>022629883</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminar Flow Hood</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted Microscope with x10 objective</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ambient air humidified Incubator</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a method for culturing embryonic c. elegans cells

C.エレガンスは、遺伝的および分子技術を容易に適用可能な、強力なモデル系である。しかし最近まで、細胞及び特定の細胞型の単離に直接アクセスする必要の技術は、C.に適用できなかった虫 。この制限は、組織が容易に酵素及び/又は界面活性剤で処理することによって消化されない加圧されたキューティクル内に閉じ込められるという事実によるものであった。 1は Cを培養するための堅牢な方法を開発したレアードブルーム、クリステンセンらが先駆者の仕事に基づいて大規模に胚細胞エレガンス 。卵は、漂白/ NaOHで処理することによって妊娠成人から単離し、続いて卵の殻を除去するキチナーゼで処理される。胚細胞は、その後、手動ピペッティングにより分離し、血清富化培地中の基質で覆われたガラス上にプレーティングする。アイソレーション·セルの24時間以内に形態を変更することにより、および細胞特異的マルケを発現させることにより、分化し始めるRS。C.エレガンスこの方法を用いて培養した細胞は、 インビトロで 2週間まで生存し、電気生理学的、免疫のために使用されており、それらはソートされ、マイクロアレイプロファイリングのために使用されているような画像は、同様に解析する。

C.は、培養細胞が分化し、細胞特異的マーカーを発現する線虫 トリパンブルー染色を用いてクリステンセンらは、胚での&gt; 99％を示した虫細胞が単離手順を生き残る。 9日目と22めっき後、それぞれ85％と65％は、まだ1生きている。孤立した胚で虫細胞は、区別するために、基板に接着しなければならない。フォーム塊を接着する?...

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A Method for Culturing Embryonic C. elegans Cells Video (Video) | JoVE

ここでは、胚での大規模培養のための改訂されたプロトコルを記述細胞エレガンス 。胚でエレガンスこの方法を用いてインビトロで培養した細胞は、細胞特異的な様式で遺伝子の発現を区別し、反復するように見える。他の組織から特定 ​​の細胞型の細胞または単離への直接アクセスを必要とする技術は、C.上に塗布することができる培養細胞エレガンス 。

培養胚のための方法<em&gt; C.虫</em&gt;細胞

C. elegans is a powerful model system, in which genetic and molecular techniques are easily applicable. Until recently though, techniques that require ...

Research

JoVE Journal

Biology

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