Name: a method for culturing embryonic c. elegans cells
Uploaded: 2013-09-21T20:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Method for Culturing Embryonic C. elegans Cells Video at JoVE.com

Stjerne (*) indikerer nye eller modifiserte skritt i forhold til Christensen et al. 1 En. Materiale Setup <ol><li> Prosedyren cellekultur krever store mengder av egg av gravid isolert fra voksne. Grow C. elegans på 8P agarskålene seeded med NA22 (tilgjengelig gjennom C. elegans Genetisk Consortium - CGC) bakterier å isolere store mengder egg. I disse plater mengden av pepton som brukes er åtte ganger mengden som normalt brukes for NGM platene. Jo h...

C. elegans er en kraftig modellorganisme for å tyde den genetiske stier involvert i utvikling, atferd og aldring. Dens bekvemmelighet stammer primært fra den enkle som det kan være genetisk manipulert og fra sin korte livssyklus. Til tross for sin bekvemmelighet, C. elegans har sine begrensninger. C. elegans celler er små og innelukket i en trykksatt hårstråene som begrenser anvendelsen av metoder som krever direkte adgang til cellene, så som elektrofysiologiske og farmakologiske teknik...

Caenorhabditis elegans (C. elegans) er en kraftig modellorganisme for å undersøke molekylære grunnlaget for cellulær funksjon, differensiering, og atferd. Mens sitt genom, metabolske og biosyntetiske banene er lik virveldyr &#39;, dens genetiske og molekylære tractability er langt større to. Blant fordelene er dens størrelse og enkel anatomi, sin raske livssyklus (3 dager ved 25 ° C), kort levealder (2 uker) og stort antall avkom (&gt; 200). På grunn av sin tvekjønnet natur og kort livssyklus, molekylære og genetiske manipulasjoner er grei i C. elegans, inkludert generering av transgene dyr 3,4 og anvendelsen av genet knock-down teknikker som RNA-interferens fem. C. elegans kropp og eggeskall er gjennomsiktig. Derfor celler kan lett visualiseres i både voksen og embryoet ved hjelp av standard mikroskopi. I de siste 40 årene, C. elegans </em&gt; samfunnet har skapt uvurderlige ressurser for C. elegans forskning, inkludert en stor samling av mutanter, knockouts og transgenics, en detaljert beskrivelse av anatomi og utvikling 6,7, inkludert fullstendig rekonstruksjon av nervesystemet 8, og en helt sekvensert genomet som er godt merket og tilgjengelig for hele samfunnet ( <a href="http://www.wormbase.com" target="_blank">www.wormbase.com</a> ). Til tross for de mange fordelene, har noen eksperimentelle tilnærminger vært utfordrende i C. elegans. Disse omfatter de som krever tilgang til plasmamembranen av celler og isolering av vev eller celletyper. Faktisk C. elegans vev er begrenset innenfor den hydrostatiske trykk skjelett, som ikke er lett fordøyes av enzymatisk behandling eller vaskemidler. På slutten av 1990-tallet Miriam Goodman og Janet Richmond pioner metoder for elektrofysiologiske opptak av C. elegansnevroner og muskelceller i situ 9,10. Selv om disse metodene ga oss viktig innsikt i nevronale og muskel funksjon in vivo, er de utfordrende og lav gjennomstrømming. Alternative metoder for å studere cellefunksjon in vivo hadde blitt utviklet, mest spesielt in vivo avbildning ved hjelp av kalsium-genetisk kodede kalsium sensorer slik som GCamP og Came 11-13. Disse metodene imidlertid ikke tillate bruk av farmakologiske verktøy, fordi de anvendes på intakte levende dyr. Det første forsøket på dyrking C. elegans celler in vitro i stor skala ble gjort av Laird Bloom under utarbeidelsen av sin doktoravhandling 14. Uheldigvis vanskelighetene med dårlig adhesjon av cellene til substratet, dårlig celle differensiering og overlevelse hindret etableringen av denne tidlige-protokollen som en robust metode cellekultur. I 1995 Edgar og kolleger publiserte en prosedyreå undersøke celledeling og morphogenesis ved isolering og kulturen av en enkelt C-. elegans embryoer 15. Embryonale celler fremstilt ved fordøyelse av eggeskall med en kombinasjon av enzymatisk behandling og manuell dissosiasjon, fortsatte å spre seg, produsere opp til ~ 500 celler 15. Deretter Leung og medarbeidere dyrket et lite antall blastomeres å studere tarm morphogenesis. De viste at en in vitro isolert E blastomere produsert polarisert tarmceller som skapte en struktur analogt til intestinal lumen ved å samhandle med hverandre gjennom apikale adherens veikryss 16. Buechner og kolleger rapporterte også en lignende metode for dyrking C. elegans embryonale celler in vitro 17. Basert på dette tidlige arbeid, Christensen og kolleger utviklet en robust protokoll for dyrking embryonale C. elegans celler in vitro en. Deviste at isolert C. elegans cellene kan differensieres til ulike celletyper og vedlikeholde de funksjonene som de besitter in vivo, inkludert uttrykk for celle-spesifikke markører. Flere teknikker som er utfordrende in vivo, kan påføres på isolert C. elegans embryonale celler. Disse omfatter elektro 1,18 19, avbildning, og immunkjemiske teknikker 20,21, samt isolering av spesifikke celletyper fra Fluorescent-aktivert cellesortering (FACS) for konstruksjon av cellespesifikke cDNA-biblioteker 22,23. Gene knockdown teknikker som RNA interferens (RNAi) kan brukes på kultivert C. elegans celler en og en roman metabolsk merking metoden bruker Azido-sukker som et verktøy for glykoprotein oppdagelsen har nylig blitt utviklet for in vitro kultivert C. elegans celler 24. Som konklusjon, ekspanderer cellekulturmetode matrisen of teknikker som kan brukes til C. elegans modell i et forsøk på å dechiffrere gen-funksjon i sammenheng med en levende organisme. Vi beskriver her protokollen for dyrking C. elegans embryonale celler in vitro, som i stor grad basert på protokollen først beskrevet av Christiansen og kolleger en.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>REAGENTS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacto Peptone</td>
			<td>VWR International Inc.</td>
			<td>90000-382</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Difco Agar Granulated</td>
			<td>VWR International Inc.</td>
			<td>90000-784</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacto Tryptone</td>
			<td>VWR International Inc.</td>
			<td>90000-284</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacto Yeast Extract</td>
			<td>VWR International Inc.</td>
			<td>90000-724</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leibovitz's L-15 Medium (1x) Liquid</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>11415-064</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>16140-063</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-streptomycin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P4333-100ML</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chitinase from Streptomyces Griseus</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C6137-25UN</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NA22 Escherichia coli</td>
			<td>Caenorhabditis Genetics Center</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peanut Lectin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L0881-10MG</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>57903-1KG</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-(+)Glucose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>67528-1KG</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylene glycol-bis (2-aminoethylether), N,N,N',N'- tetraacidic acid (EGTA)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E0396-25G</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hepes</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H3375-500G</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cholesterol</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>57653-1KG</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P9333-500G</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C1016-500G</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M8266-100G</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgSO4</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M2643-500 g</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>K2HPO4</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P2222-500G</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P9791-500G</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOH</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S8045-500G</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KOH</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P1767-500G</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Autoclaved distilled H2O</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bleach</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>EQUIPMENT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>101-1000 &mu;l Blue Graduated Pipet Tips</td>
			<td>USA Scentific</td>
			<td>1111-2821</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 ml Sterilized Pipet Individually Wrapped</td>
			<td>USA Scentific</td>
			<td>1071-0810</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ergonomic Variable Volume (100-1000 &mu;l) Pipettor with tip ejector</td>
			<td>VWR International Inc.</td>
			<td>89079-974</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Portable Pipet Aid, Drummond</td>
			<td>VWR International Inc.</td>
			<td>53498-103</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transfer Plastic Pipet Sterile</td>
			<td>VWR International Inc.</td>
			<td>14670-114</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 ml Conical Tube</td>
			<td>USA Scentific</td>
			<td>1475-1611</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 ml Conical Tube</td>
			<td>USA Scentific</td>
			<td>1500-1811</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile 18 gauge Needles</td>
			<td>Becton, Dickinson and Co.</td>
			<td>305196</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile 10 ml Syringes</td>
			<td>Becton, Dickinson and Co.</td>
			<td>305482</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic Syringe Filters Corning 0,20 &mu;m pore size</td>
			<td>Corning</td>
			<td>431224</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acrodic 25 mm Syringe filter w/5 &mu;m versapor Membrane</td>
			<td>VWR International Inc.</td>
			<td>28144-095</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>60x15 mm Petri Dish Sterile</td>
			<td>VWR International Inc.</td>
			<td>82050-548</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100x15 mm Petri Dish Sterile</td>
			<td>VWR International Inc.</td>
			<td>82050-912</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12 mm Diameter Glass Coverslips</td>
			<td>VWR International Inc.</td>
			<td>48300-560</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clear Cell Culture Plates 24 Well Flat Bottom w/lid</td>
			<td>Thomas scientific</td>
			<td>6902A09</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #5- Fine Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11254-20</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge 5702</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>022629883</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminar Flow Hood</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted Microscope with x10 objective</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ambient air humidified Incubator</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a method for culturing embryonic c. elegans cells

C. elegans er en kraftig modellsystem, i hvilket genetiske og molekylære teknikker er lett anvendelig. Inntil nylig har imidlertid teknikker som krever direkte tilgang til celler og isolering av spesifikke celletyper og kunne ikke bli anvendt i C. elegans. Denne begrensning skyldes det faktum at vev er innelukket i en trykksatt hårstråene som ikke er lett fordøyes ved behandling med enzymer og / eller vaskemidler. Basert på tidlig pioner arbeid av Laird Bloom, Christensen og kollegene en utviklet en robust metode for dyrking C. elegans embryonale celler i stor skala. Egg er isolert fra av gravid voksne ved behandling med blekemiddel / NaOH og deretter behandlet med chitinase å fjerne eggeskall. Embryonale celler blir deretter dissosiert ved manuell pipettering og platet ut på substrat-dekket glass i serum-anrikede mediet. Innen 24 timer av isolasjonscellene begynner å differensiere ved å endre morfologi og ved å uttrykke celle spesifikke markers. C. elegans cellene dyrkes ved hjelp av denne metode overleve i opptil 2 uker, in vitro, og har vært benyttet for elektrofysiologisk, immunokjemisk, og avbildningsanalyser, så vel som de er blitt sortert, og som brukes for mikromatrise profilering.

C. elegans dyrkede celler differensiere og ekspress celle spesifikke markører Christensen og kolleger ved hjelp av trypan blå farging viste at&gt; 99% av embryonale C. elegans celler overleve isolering prosedyre. På dag 9 og 22 etter plating, 85% og 65%, henholdsvis er fortsatt i live ett. Isolert embryonale C. elegans celler må forholde seg til et substrat for å differensiere. Celler som ikke klarer å overholde danner klumper og det er ikke klart om ...

Watch this Scientific Journal Video about A Method for Culturing Embryonic C. elegans Cells Video at JoVE.com

A Method for Culturing Embryonic C. elegans Cells Video (Video) | JoVE

Vi beskriver her en revidert protokoll for storskala kultur embryonale C. elegans celler. Embryonale C. elegans celler dyrket in vitro ved å bruke denne metoden, ser ut til å differensiere og rekapitulere ekspresjonen av gener i en celle spesifikk måte. Teknikker som krever direkte adgang til cellene og isolering av spesifikke celletyper fra andre vev kan påføres på C. elegans dyrkede celler.

En metode for dyrking Embryonic<em&gt; C. elegans</em&gt; Celler

C. elegans is a powerful model system, in which genetic and molecular techniques are easily applicable. Until recently though, techniques that require ...

Research

JoVE Journal

Biology

A Method for Culturing Embryonic C. elegans Cells

Generation of Stable Transgenic C. elegans Using Microinjection

Generation of Stable Transgenic C. elegans Using Microinjection Video (Video) | JoVE

Transgenic Caenorhabditis elegans can be readily created via microinjection of a DNA plasmid solution into the gonad 1.  The plasmid DNA rearranges to ...

Application of a C. elegans Dopamine Neuron Degeneration Assay for the Validation of Potential Parkinson's Disease Genes

Application of a C. elegans Dopamine Neuron Degeneration Assay for the Validation of Potential Parkinson's Disease Genes Video (Video) | JoVE

Improvements to the diagnosis and treatment of Parkinson's disease (PD) are dependent upon knowledge about susceptibility factors that render populations ...

Chromosomal Spread Preparation of Human Embryonic Stem Cells for Karyotyping

Chromosomal Spread Preparation of Human Embryonic Stem Cells for Karyotyping Video (Video) | JoVE

Although human embryonic stem cells (hESC) have been shown to present a stable diploid karyotype 1, many studies have reported that depending on culture ...

Generation of Transgenic C. elegans by Biolistic Transformation

Generation of Transgenic C. elegans by Biolistic Transformation Video (Video) | JoVE

The number of laboratories using the free living nematode C. elegans is rapidly growing. The popularity of this biological model is attributed to a rapid ...

The Production of C. elegans Transgenes via Recombineering with the galK Selectable Marker

The Production of C. elegans Transgenes via Recombineering with the galK Selectable Marker Video (Video) | JoVE

The creation of transgenic animals is widely utilized in C. elegans research including the use of GFP fusion proteins to study the regulation and ...

Robust Generation of Hepatocyte-like Cells from Human Embryonic Stem Cell Populations

Robust Generation of Hepatocyte-like Cells from Human Embryonic Stem Cell Populations Video (Video) | JoVE

Robust Generation of hepatocytter-lignende celler fra humane embryonale Stem Cell pasientgrupper

Despite progress in modelling human drug toxicity, many compounds fail during clinical trials due to unpredicted side effects. The cost of clinical ...

RNAi Screening to Identify Postembryonic Phenotypes in C. elegans

RNAi Screening to Identify Postembryonic Phenotypes in C. elegans Video (Video) | JoVE

RNAi Screening for å identifisere Postembryonic fenotyper i C. elegans</em

C. elegans has proven to be a valuable model system for the discovery and functional characterization of many genes and gene pathways1. More sophisticated ...

Preparation of Mouse Embryonic Fibroblast Cells Suitable for Culturing Human Embryonic and Induced Pluripotent Stem Cells

Preparation of Mouse Embryonic Fibroblast Cells Suitable for Culturing Human Embryonic and Induced Pluripotent Stem Cells Video (Video) | JoVE

Utarbeidelse av mus embryonale fibroblast celler Egnet for dyrking humane embryonale og Induced pluripotent stamceller

In general, human embryonic stem cells (hESCs) and human induced pluripotent stem cells (hiPSCs)1 can be cultured under variable conditions. However, it ...

A System for ex vivo Culturing of Embryonic Pancreas

A System for ex vivo Culturing of Embryonic Pancreas Video (Video) | JoVE

Et system for<em&gt; Ex vivo</em&gt; Dyrking av Embryonic Pancreas

The pancreas controls vital functions of our body,  including the production of digestive enzymes and regulation of blood sugar  levels1. Although in the ...

Basic Caenorhabditis elegans Methods: Synchronization and Observation

Basic Caenorhabditis elegans Methods: Synchronization and Observation Video (Video) | JoVE

Grunnleggende<em&gt; Caenorhabditis elegans</em&gt; Metoder: Synkronisering og observasjon

Research into the molecular and developmental biology of the nematode Caenorhabditis elegans was begun in the early seventies by Sydney Brenner and it has ...