Name: a method for culturing embryonic c. elegans cells
Uploaded: 2013-09-21T20:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Method for Culturing Embryonic C. elegans Cells Video at JoVE.com

Звездочки (*) указывают новые или измененные меры по сравнению с Кристенсен и др.. 1 1. Настройка Материал <ol><li> Процедура культуры клеток требует большого количества яиц, изолированных от беременных взрослых. Расти C. Элеганс на 8P пластин агара высевают с na2...

С. Элеганс является мощным модельным организмом для расшифровки генетических путей, участвующих в разработке, поведения и старения. Ее удобство происходит, главным образом от той легкости, с которой он может быть генетически манипулировать и от его короткого жизненного цикла. Нес...

Caenorhabditis Элеганс (C. Элеганс) является мощным модельным организмом для изучения молекулярных основ клеточной функции, дифференциации и поведения. В то время как его геном, метаболические и биосинтеза похожи на позвоночных », его генетических и молекулярных уступчивость гораздо больше 2. Среди его преимуществ являются его размер и простой анатомии, его быстрый цикл жизни (3 дней при 25 ° С), короткий срок службы (2 недели) и большое количество потомства (&gt; 200). Благодаря своей гермафродитного природы и коротким жизненным циклом, молекулярные и генетические манипуляции просты в С. Элеганс, в том числе получения трансгенных животных 3,4 и применения генных методов бросовым таких как РНК-интерференция 5. С. Элеганс тело и яичной скорлупы прозрачны. Поэтому клетки могут быть легко визуализированы как в взрослых и эмбриона с помощью стандартного микроскопии. В последние 40 лет, С. Элеганс </EM&gt; сообщество создало бесценные ресурсы для C. Исследование Элеганс в том числе большой коллекции мутантов, врезками и трансгенных, подробное описание анатомии и развития 6,7, в том числе полная реконструкция нервной системы 8, и полностью секвенированных генома, которая хорошо аннотированный и доступной для всего сообщества ( <a href="http://www.wormbase.com" target="_blank">www.wormbase.com</a> ). Несмотря на многочисленные преимущества, некоторые экспериментальные подходы, создают большие сложности в С. Элеганс. К ним относятся те, которые требуют доступ к плазматической мембране клеток и тканей изоляции или типов клеток. Действительно C. Elegans ткани заключены внутри ее под давлением гидростатического скелета, которое не легко переваривается ферментативной обработкой или моющих средств. В конце 1990-х годов Мириам Гудман и Джанет Ричмонд впервые методы электрофизиологических записей С. Элеганснейроны и мышечные клетки в месте 9,10. Хотя эти методы дали нам важную информацию о нейронных и функции мышц в естественных условиях, они являются сложными и низкая пропускная. Альтернативные методы для изучения функции клеток в естественных условиях была разработана, в основном в частности, в естественных изображений кальция с использованием генетически закодированные датчики кальция, такие как GCamP и Cameleon 11-13. Эти методы не менее, не позволяют использование фармакологических средств, так как они применяются на интактных живых животных. Первая попытка культивирования C. Элеганс клетки в пробирке в больших масштабах выступил Laird Блум в ходе подготовки своей диссертации 14. К сожалению, трудности, возникающие с плохой адгезии клеток к подложке, плохое дифференцировка клеток и выживание предотвратить создание этой ранней протокола как надежного метода культуры клеток. В 1995 году Эдгар и его коллеги опубликовали процедуруисследовать деление клеток и морфогенеза путем выделения и культуры одного C. Элеганс эмбрионов 15. Эмбриональные клетки, полученные путем гидролиза из яичной скорлупы с комбинацией ферментативной обработки и ручной диссоциации, продолжали размножаться, производя до ~ 500 клеток 15. Впоследствии Леунг и его коллеги культивировали небольшие количества бластомеров для изучения кишечной морфогенез. Они показали, что один в пробирке изолированные E бластомер производится поляризованные клетки кишечника, которые создали структуру, аналогичную просвет кишечника, взаимодействуя друг с другом через верхушечных слипчивых соединений 16. Бюхнер и его коллеги также сообщили подобный метод для культивирования C. Элеганс эмбриональные клетки в пробирке 17. Основываясь на этой ранней работы, Кристенсен и его коллеги разработали надежную протокол для культивирования эмбриональных C. Элеганс клетки в пробирке 1. Онипоказали, что изолированные C. Элеганс клетки могут дифференцироваться в различные типы клеток и поддерживать функции, которыми они обладают в естественных условиях, в том числе экспрессию маркеров для соты. Некоторые методы, которые являются сложными в естественных условиях, могут быть применены на изолированных С. Элеганс эмбриональные клетки. К ним относятся электрофизиологические 1,18 19 изображений, и иммунохимических методов 20,21, а также изоляцию специфические типы клеток флуоресцентным-Активированный сортировки клеток (FACS) для строительства клеточных конкретных библиотек кДНК 22,23. Генные нокдаун методы, такие как РНК-интерференция (RNAi) может быть применен на культивируемой С. Элеганс клетки 1 и роман метаболический метод маркировки с помощью Азидо-сахар в качестве инструмента для открытия гликопротеина недавно был разработан для в пробирке культурного C. Элеганс клетки 24. В заключение, метод культуры клеток расширяет массив Oе методы, которые могут быть применены к С. Элеганс модель в попытке расшифровать функции генов в контексте живой организм. Мы описываем здесь протокол для культивирования C. Элеганс эмбриональные клетки в пробирке, которая в значительной степени на основе протокола, впервые описанным Кристиансен и 1 коллегами.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>REAGENTS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacto Peptone</td>
			<td>VWR International Inc.</td>
			<td>90000-382</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Difco Agar Granulated</td>
			<td>VWR International Inc.</td>
			<td>90000-784</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacto Tryptone</td>
			<td>VWR International Inc.</td>
			<td>90000-284</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacto Yeast Extract</td>
			<td>VWR International Inc.</td>
			<td>90000-724</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leibovitz's L-15 Medium (1x) Liquid</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>11415-064</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>16140-063</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-streptomycin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P4333-100ML</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chitinase from Streptomyces Griseus</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C6137-25UN</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NA22 Escherichia coli</td>
			<td>Caenorhabditis Genetics Center</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peanut Lectin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L0881-10MG</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>57903-1KG</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-(+)Glucose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>67528-1KG</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylene glycol-bis (2-aminoethylether), N,N,N',N'- tetraacidic acid (EGTA)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E0396-25G</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hepes</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H3375-500G</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cholesterol</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>57653-1KG</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P9333-500G</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C1016-500G</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M8266-100G</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgSO4</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M2643-500 g</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>K2HPO4</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P2222-500G</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P9791-500G</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOH</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S8045-500G</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KOH</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P1767-500G</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Autoclaved distilled H2O</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bleach</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>EQUIPMENT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>101-1000 &mu;l Blue Graduated Pipet Tips</td>
			<td>USA Scentific</td>
			<td>1111-2821</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 ml Sterilized Pipet Individually Wrapped</td>
			<td>USA Scentific</td>
			<td>1071-0810</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ergonomic Variable Volume (100-1000 &mu;l) Pipettor with tip ejector</td>
			<td>VWR International Inc.</td>
			<td>89079-974</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Portable Pipet Aid, Drummond</td>
			<td>VWR International Inc.</td>
			<td>53498-103</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transfer Plastic Pipet Sterile</td>
			<td>VWR International Inc.</td>
			<td>14670-114</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 ml Conical Tube</td>
			<td>USA Scentific</td>
			<td>1475-1611</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 ml Conical Tube</td>
			<td>USA Scentific</td>
			<td>1500-1811</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile 18 gauge Needles</td>
			<td>Becton, Dickinson and Co.</td>
			<td>305196</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile 10 ml Syringes</td>
			<td>Becton, Dickinson and Co.</td>
			<td>305482</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic Syringe Filters Corning 0,20 &mu;m pore size</td>
			<td>Corning</td>
			<td>431224</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acrodic 25 mm Syringe filter w/5 &mu;m versapor Membrane</td>
			<td>VWR International Inc.</td>
			<td>28144-095</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>60x15 mm Petri Dish Sterile</td>
			<td>VWR International Inc.</td>
			<td>82050-548</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100x15 mm Petri Dish Sterile</td>
			<td>VWR International Inc.</td>
			<td>82050-912</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12 mm Diameter Glass Coverslips</td>
			<td>VWR International Inc.</td>
			<td>48300-560</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clear Cell Culture Plates 24 Well Flat Bottom w/lid</td>
			<td>Thomas scientific</td>
			<td>6902A09</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #5- Fine Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11254-20</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge 5702</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>022629883</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminar Flow Hood</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted Microscope with x10 objective</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ambient air humidified Incubator</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a method for culturing embryonic c. elegans cells

С. Элеганс является мощным модель системы, в которой генетические и молекулярные методы легко применимы. До недавнего времени не менее, методы, которые требуют прямой доступ к клеткам и выделения специфических типов клеток, не могли быть применены в C. Элеганс. Это ограничение было связано с тем, что ткани заключены внутри герметичной кутикулы, которое не легко переваривается обработкой ферментами и / или моющих средств. Основываясь на ранней пионерской работе по Laird Блум, Кристенсен и его коллеги 1 разработали надежный метод для культивирования C. Элеганс эмбриональные клетки в больших масштабах. Яйца изолированы от беременных взрослых путем обработки отбеливающей / NaOH и затем обрабатывали хитиназы, чтобы удалить скорлупы. Эмбриональные клетки затем диссоциирует с помощью ручного пипетки и помещают на подложки, покрытые стеклом в сыворотке крови, обогащенной средах. В 24 часов в одиночных камерах начинают дифференцироваться путем изменения морфологии и, выражая определенную Marke клетокRS. C. Элеганс-клетки, культивируемые с помощью этого метода выживать в течение 2 недель в пробирке и были использованы для электрофизиологических, иммунохимическими и визуализации анализа, а также они были отсортированы и используется для микрочипов профилирования.

C. Элеганс культивируемые клетки дифференцируются и экспресс клеток специфические маркеры Кристенсен и его коллеги с помощью окрашивания трипановым синим показали, что&gt; 99% эмбриональной С. Элеганс клетки выживают процедуру изоляции. На 9-й день и 22 после посева...

Watch this Scientific Journal Video about A Method for Culturing Embryonic C. elegans Cells Video at JoVE.com

A Method for Culturing Embryonic C. elegans Cells Video (Video) | JoVE

Мы описываем здесь пересмотренный протокол для крупномасштабного культуры эмбриональных С. Элеганс клетки. Эмбриональные С. Элеганс клетки, культивируемые в лабораторных, используя этот метод, по-видимому, дифференцировать и резюмировать экспрессию генов в определенном порядке клеток. Методы, которые требуют прямого доступа к клеткам или изоляцию специфические типы клеток из других тканей можно применять на С. Элеганс культивируемых клеток.

Метод для культивирования эмбриональных<em&gt; С. Элеганс</em&gt; Клетки

C. elegans is a powerful model system, in which genetic and molecular techniques are easily applicable. Until recently though, techniques that require ...

Research

JoVE Journal

Biology

A Method for Culturing Embryonic C. elegans Cells

Generation of Stable Transgenic C. elegans Using Microinjection

Generation of Stable Transgenic C. elegans Using Microinjection Video (Video) | JoVE

Генерация Стабильный Трансгенные Элеганс C. Использование Микроинъекция

Transgenic Caenorhabditis elegans can be readily created via microinjection of a DNA plasmid solution into the gonad 1.  The plasmid DNA rearranges to ...

Application of a C. elegans Dopamine Neuron Degeneration Assay for the Validation of Potential Parkinson's Disease Genes

Application of a C. elegans Dopamine Neuron Degeneration Assay for the Validation of Potential Parkinson's Disease Genes Video (Video) | JoVE

Применение допамина Элеганс C. Анализ дегенерация нейронов для проверки потенциальных болезни Паркинсона Гены

Improvements to the diagnosis and treatment of Parkinson's disease (PD) are dependent upon knowledge about susceptibility factors that render populations ...

Chromosomal Spread Preparation of Human Embryonic Stem Cells for Karyotyping

Chromosomal Spread Preparation of Human Embryonic Stem Cells for Karyotyping Video (Video) | JoVE

Хромосомные Подготовка распространения человеческих эмбриональных стволовых клеток для Кариотипирование

Although human embryonic stem cells (hESC) have been shown to present a stable diploid karyotype 1, many studies have reported that depending on culture ...

Generation of Transgenic C. elegans by Biolistic Transformation

Generation of Transgenic C. elegans by Biolistic Transformation Video (Video) | JoVE

Поколение трансгенных С. Элеганс По Biolistic преобразования

The number of laboratories using the free living nematode C. elegans is rapidly growing. The popularity of this biological model is attributed to a rapid ...

The Production of C. elegans Transgenes via Recombineering with the galK Selectable Marker

The Production of C. elegans Transgenes via Recombineering with the galK Selectable Marker Video (Video) | JoVE

Производство С. Элеганс Трансгенов через Recombineering с GalK Выбор маркера

The creation of transgenic animals is widely utilized in C. elegans research including the use of GFP fusion proteins to study the regulation and ...

Robust Generation of Hepatocyte-like Cells from Human Embryonic Stem Cell Populations

Robust Generation of Hepatocyte-like Cells from Human Embryonic Stem Cell Populations Video (Video) | JoVE

Прочная Генерация гепатоцитов-подобных клеток из человеческих эмбриональных стволовых клеток населения

Despite progress in modelling human drug toxicity, many compounds fail during clinical trials due to unpredicted side effects. The cost of clinical ...

RNAi Screening to Identify Postembryonic Phenotypes in C. elegans

RNAi Screening to Identify Postembryonic Phenotypes in C. elegans Video (Video) | JoVE

RNAi скрининга для выявления Постэмбриональное фенотипы в С. Элеганс</em

C. elegans has proven to be a valuable model system for the discovery and functional characterization of many genes and gene pathways1. More sophisticated ...

Preparation of Mouse Embryonic Fibroblast Cells Suitable for Culturing Human Embryonic and Induced Pluripotent Stem Cells

Preparation of Mouse Embryonic Fibroblast Cells Suitable for Culturing Human Embryonic and Induced Pluripotent Stem Cells Video (Video) | JoVE

Подготовка мышиных эмбриональных фибробластов подходит для культивирования эмбриональных и индуцированных плюрипотентных стволовых клетках

In general, human embryonic stem cells (hESCs) and human induced pluripotent stem cells (hiPSCs)1 can be cultured under variable conditions. However, it ...

A System for ex vivo Culturing of Embryonic Pancreas

A System for ex vivo Culturing of Embryonic Pancreas Video (Video) | JoVE

Система<em&gt; Бывших естественных условиях</em&gt; Культивирования эмбриональных поджелудочной железы

The pancreas controls vital functions of our body,  including the production of digestive enzymes and regulation of blood sugar  levels1. Although in the ...

Basic Caenorhabditis elegans Methods: Synchronization and Observation

Basic Caenorhabditis elegans Methods: Synchronization and Observation Video (Video) | JoVE

Основной<em&gt; Caenorhabditis Элеганс</em&gt; Методы синхронизации и наблюдения

Research into the molecular and developmental biology of the nematode Caenorhabditis elegans was begun in the early seventies by Sydney Brenner and it has ...