Name: a method for culturing embryonic c. elegans cells
Uploaded: 2013-09-21T20:00:00
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Los asteriscos (*) indican los pasos nuevos o modificados en comparación con Christensen et al. 1 1. Configuración del material <ol><li> El procedimiento de cultivo celular requiere grandes cantidades de huevos aislados de los adultos grávidas. Crecer C. elegans en 8P placas de agar sembrado con NA22 (disponible a través de la C. elegans Consorcio Genético - CGC) bacterias para aislar grandes cantidades de huevos. En estas placas de la cantidad de...

C. elegans es un organismo modelo de gran alcance para descifrar los mecanismos genéticos implicados en el desarrollo, la conducta y el envejecimiento. Su conveniencia se debe principalmente a la facilidad con la que puede ser manipulada genéticamente y de su ciclo de vida corto. A pesar de su conveniencia, C. elegans tiene sus limitaciones. C. células elegans son pequeñas y confinado dentro de una cutícula a presión que limita la aplicación de métodos que requieren el acceso ...

Caenorhabditis elegans (C. elegans) es un organismo modelo de gran alcance para la investigación de las bases moleculares de la función celular, la diferenciación y el comportamiento. Mientras que su genoma, metabólicos y las vías biosintéticas son similares a los vertebrados, su maleabilidad genética y molecular son mucho mayores 2. Entre sus ventajas son su tamaño y simple anatomía, su rápido ciclo de vida (3 días a 25 ° C), de corta duración de la vida (2 semanas) y gran número de crías (&gt; 200). Debido a su naturaleza hermafrodita y corto ciclo de vida, las manipulaciones genéticas y moleculares son sencillos en C. elegans, incluyendo la generación de animales transgénicos 3,4 y la aplicación de técnicas de saldo de genes tales como ARN de interferencia 5. C. cuerpo elegans y la cáscara de huevo son transparentes. Por lo tanto las células se pueden visualizar fácilmente tanto en el adulto y el embrión utilizando microscopía estándar. En los últimos 40 años, el C. elegans </em&gt; comunidad ha creado recursos invaluables para C. investigación elegans incluyendo una gran colección de mutantes, knockouts y transgénicos, una descripción detallada de la anatomía y desarrollo 6,7, incluida la reconstrucción completa del sistema nervioso 8, y un genoma secuenciado completamente, que es bien anotado y disponible para toda la comunidad ( <a href="http://www.wormbase.com" target="_blank">www.wormbase.com</a> ). A pesar de las numerosas ventajas, algunos enfoques experimentales han sido difíciles en C. elegans. Estos incluyen los que requieren la accesibilidad a la membrana plasmática de las células y el aislamiento de los tejidos o tipos de células. De hecho C. tejidos elegans están confinados dentro de su esqueleto hidrostático a presión, que no es fácilmente digerido por tratamiento enzimático o detergentes. A finales de la década de 1990 Miriam Goodman y Janet Richmond pioneros métodos de registros electrofisiológicos de C. elegansneuronas y células musculares in situ 9,10. Si bien estos métodos nos dio pistas importantes sobre neuronal y la función muscular in vivo, que son desafiantes y bajo rendimiento. Los métodos alternativos para el estudio de la función de células in vivo se han desarrollado, sobre todo en especial en vivo de imágenes de calcio por medio de sensores de calcio genéticamente codificados como GCamP y cameleon 11-13. Estos métodos, sin embargo, no permiten el uso de herramientas farmacológicas porque se aplican en animales vivos intactos. El primer intento de cultivar C. elegans células in vitro en gran escala fue realizada por Laird Bloom durante la preparación de su tesis doctoral 14. Desafortunadamente, las dificultades encontradas con una pobre adhesión de las células al sustrato, pobre diferenciación celular y la supervivencia prevenir el establecimiento de este protocolo ya en un método de cultivo celular robusto. En 1995 Edgar y sus colegas publicaron un procedimientopara investigar la división celular y la morfogénesis por aislamiento y cultivo de una sola C. elegans embriones 15. Las células embrionarias obtenidos por la digestión de las cáscaras de huevo con una combinación de tratamiento enzimático y la disociación manual, continuaron proliferando, produciendo hasta ~ 500 células 15. Posteriormente, Leung y colaboradores cultivaron un pequeño número de blastómeras estudiar la morfogénesis intestinal. Ellos mostraron que uno in vitro aislados E blastómeros produjo células intestinales polarizadas que crearon una estructura análoga a la luz intestinal al interactuar entre sí a través de las salidas 16 adherentes apicales. Buechner y colegas también informaron un método similar para el cultivo C. elegans células embrionarias in vitro 17. Sobre la base de este trabajo inicial, Christensen y sus colegas desarrollaron un protocolo robusto para el cultivo embrionario C. elegans células in vitro 1. Ellosmostró que el aislado C. elegans células pueden diferenciarse en diversos tipos de células y mantener las características que poseen in vivo, incluyendo la expresión de marcadores específicos de célula. Varias técnicas que son un reto in vivo, se pueden aplicar en aislado C. elegans células embrionarias. Estos incluyen electrofisiológico 1,18 19, de formación de imágenes, y técnicas inmunoquímicas 20,21, así como el aislamiento de tipos de células específicas por-fluorescente clasificación de células activadas (FACS) para la construcción de bibliotecas de ADNc de células específicas de 22,23. Técnicas de genes desmontables tales como interferencia de ARN (RNAi) se pueden aplicar sobre culta C. elegans células 1 y un método novedoso marcaje metabólico usando Azido-azúcar como una herramienta para el descubrimiento de glicoproteína se ha desarrollado recientemente para cultivadas in vitro C. elegans células 24. En conclusión, el método de cultivo celular se expande la matriz Of técnicas que se pueden aplicar a la C. modelo elegans en un esfuerzo para descifrar la función de genes en el contexto de un organismo vivo. Se describe aquí el protocolo para el cultivo de C. Elegans células embrionarias in vitro, que se basa en gran parte en el protocolo descrito por primera vez por Christiansen y sus colegas 1.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>REAGENTS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacto Peptone</td>
			<td>VWR International Inc.</td>
			<td>90000-382</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Difco Agar Granulated</td>
			<td>VWR International Inc.</td>
			<td>90000-784</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacto Tryptone</td>
			<td>VWR International Inc.</td>
			<td>90000-284</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacto Yeast Extract</td>
			<td>VWR International Inc.</td>
			<td>90000-724</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leibovitz's L-15 Medium (1x) Liquid</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>11415-064</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>16140-063</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-streptomycin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P4333-100ML</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chitinase from Streptomyces Griseus</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C6137-25UN</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NA22 Escherichia coli</td>
			<td>Caenorhabditis Genetics Center</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peanut Lectin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L0881-10MG</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>57903-1KG</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-(+)Glucose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>67528-1KG</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylene glycol-bis (2-aminoethylether), N,N,N',N'- tetraacidic acid (EGTA)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E0396-25G</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hepes</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H3375-500G</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cholesterol</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>57653-1KG</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P9333-500G</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C1016-500G</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M8266-100G</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgSO4</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M2643-500 g</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>K2HPO4</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P2222-500G</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P9791-500G</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOH</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S8045-500G</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KOH</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P1767-500G</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Autoclaved distilled H2O</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bleach</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>EQUIPMENT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>101-1000 &mu;l Blue Graduated Pipet Tips</td>
			<td>USA Scentific</td>
			<td>1111-2821</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 ml Sterilized Pipet Individually Wrapped</td>
			<td>USA Scentific</td>
			<td>1071-0810</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ergonomic Variable Volume (100-1000 &mu;l) Pipettor with tip ejector</td>
			<td>VWR International Inc.</td>
			<td>89079-974</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Portable Pipet Aid, Drummond</td>
			<td>VWR International Inc.</td>
			<td>53498-103</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transfer Plastic Pipet Sterile</td>
			<td>VWR International Inc.</td>
			<td>14670-114</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 ml Conical Tube</td>
			<td>USA Scentific</td>
			<td>1475-1611</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 ml Conical Tube</td>
			<td>USA Scentific</td>
			<td>1500-1811</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile 18 gauge Needles</td>
			<td>Becton, Dickinson and Co.</td>
			<td>305196</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile 10 ml Syringes</td>
			<td>Becton, Dickinson and Co.</td>
			<td>305482</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic Syringe Filters Corning 0,20 &mu;m pore size</td>
			<td>Corning</td>
			<td>431224</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acrodic 25 mm Syringe filter w/5 &mu;m versapor Membrane</td>
			<td>VWR International Inc.</td>
			<td>28144-095</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>60x15 mm Petri Dish Sterile</td>
			<td>VWR International Inc.</td>
			<td>82050-548</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100x15 mm Petri Dish Sterile</td>
			<td>VWR International Inc.</td>
			<td>82050-912</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12 mm Diameter Glass Coverslips</td>
			<td>VWR International Inc.</td>
			<td>48300-560</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clear Cell Culture Plates 24 Well Flat Bottom w/lid</td>
			<td>Thomas scientific</td>
			<td>6902A09</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #5- Fine Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11254-20</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge 5702</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>022629883</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminar Flow Hood</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted Microscope with x10 objective</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ambient air humidified Incubator</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a method for culturing embryonic c. elegans cells

C. elegans es un modelo de sistema de gran alcance, en la que las técnicas genéticas y moleculares son de fácil aplicación. Hasta hace poco, sin embargo, las técnicas que requieren acceso directo a las células y el aislamiento de determinados tipos de células, podrían no aplicarse en C. elegans. Esta limitación se debe al hecho de que los tejidos están confinados dentro de una cutícula presurizado que no es fácilmente digerido por el tratamiento con enzimas y / o detergentes. Basado en el trabajo de los pioneros por Laird Bloom, Christensen y sus colegas han desarrollado la 1 un método robusto para el cultivo de C. Elegans células embrionarias en gran escala. Los huevos están aisladas de adultos grávidas por tratamiento con lejía / NaOH y posteriormente tratados con quitinasa para eliminar las cáscaras de huevo. Las células embrionarias se disocia mediante pipeteo manual y sembraron en sustrato de vidrio cubierto en medio de suero enriquecido. Dentro de las 24 horas de las celdas de aislamiento comenzar a diferenciar cambiando la morfología y expresando marke células específicasrs. C. elegans células cultivadas con este método sobrevivir hasta 2 semanas in vitro y se han utilizado para electrofisiológico, inmunoquímica, y proyección de imagen analiza todo lo bien que se han clasificado y utilizado para los microarrays de perfiles.

C. elegans y células cultivadas se diferencian de células expresan marcadores específicos Christensen y sus colegas utilizando tinción con azul tripán demostraron que&gt; 99% de los embriones C. elegans células sobreviven el procedimiento de aislamiento. En días 9 y 22 después de la siembra, 85% y 65%, respectivamente, siguen vivos 1. Aislado embrionario C. células elegans deben adherirse a un sustrato con el fin de diferenciar. Las célul...

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A Method for Culturing Embryonic C. elegans Cells Video (Video) | JoVE

Se describe aquí un protocolo revisado para el cultivo a gran escala de embriones C. elegans células. Embryonic C. elegans células cultivadas in vitro utilizando este método, parecen diferenciarse y recapitular la expresión de genes de una manera específica de la célula. Las técnicas que requieren el acceso directo a las células o el aislamiento de tipos de células específicas de los otros tejidos se pueden aplicar sobre C. elegans células cultivadas.

Un método para cultivar embrionarias<em&gt; C. elegans</em&gt; Células

C. elegans is a powerful model system, in which genetic and molecular techniques are easily applicable. Until recently though, techniques that require ...

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