Name: a method for culturing embryonic c. elegans cells
Uploaded: 2013-09-21T20:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Method for Culturing Embryonic C. elegans Cells Video at JoVE.com

Asterisk (*) anger nya eller ändrade åtgärder jämfört med Christensen et al. 1 1. Material Setup <ol><li> Cellodlingsförfarandet kräver stora mängder ägg isolerade från gravida vuxna. Grow C. elegans på 8P agarplattor ympats med NA22 (tillgänglig via C. elegans Genetic Consortium - CGC) bakterier för att isolera stora mängder ägg. I dessa plattor mängden pepton användas är 8 gånger den mängd som normalt används för NGM plattor. De...

C. elegans är en kraftfull modell organism för att dechiffrera den genetiska vägar som är involverade i utveckling, beteende och åldrande. Dess bekvämlighet härrör främst från den lätthet med vilken den kan vara genetiskt manipulerade och från sin korta livscykel. Trots sin bekvämlighet, C. elegans har sina begränsningar. C. elegans celler är liten och innesluten i en trycksatt nagelband som begränsar tillämpningen av metoder som kräver direkt tillgång till cellerna, t.ex. e...

Caenorhabditis elegans (C. elegans) är en kraftfull modellorganism för att undersöka de molekylära grunderna för cellulär funktion, differentiering, och beteende. Medan dess genom, metabola och biosyntetiska vägar liknar ryggradsdjur &quot;, dess genetiska och molekylär spårbarhet är mycket större 2. Bland dess fördelar är dess storlek och enkel anatomi, dess snabba livscykel (3 dagar vid 25 ° C), kort livslängd (2 veckor) och ett stort antal avkommor (&gt; 200). På grund av sin hermafroditiska natur och kort livscykel, molekylära och genetiska manipulationer är enkla i C. elegans, även produktion av transgena djur 3,4 och tillämpningen av gen knock-down tekniker såsom RNA-interferens 5. C. elegans kropp och äggskal är transparenta. Därför celler kan enkelt visualiseras i både vuxna och embryot med standard mikroskopi. Under de senaste 40 åren, i C. elegans </em&gt; samfundet har skapat ovärderliga resurser för C. elegans forskning inklusive en stor samling av mutanter, knockouts och transgena, en detaljerad beskrivning av anatomi och utveckling 6,7, inklusive fullständig återuppbyggnad av nervsystemet 8, samt ett helt sekvens genomet som är väl kommenterad och tillgänglig för hela samhället ( <a href="http://www.wormbase.com" target="_blank">www.wormbase.com</a> ). Trots de många fördelar, har en del experimentella metoder varit utmanande i C. elegans. Dessa inkluderar de som kräver tillgång till plasmamembranet i cellerna och isolering av vävnader eller celltyper. Indeed C. elegans vävnader är begränsade till sin tryckhydrostatiskt skelett, som inte är lättsmält genom enzymatisk behandling eller rengöringsmedel. I slutet av 1990-talet Miriam Goodman och Janet Richmond pionjärer metoder för elektrofysiologiska inspelningar av C. elegansnervceller och muskelceller i situ 9,10. Även om dessa metoder gav oss viktiga insikter i neuronal-och muskelfunktion in vivo, de är utmanande och låg genomströmning. Alternativa metoder för att studera cellfunktionen in vivo hade utvecklats, mestadels särskilt in vivo kalcium avbildning med genetiskt kodade kalcium sensorer såsom GCamP och came 11-13. Dessa metoder dock inte tillåta användning av farmakologiska verktyg, eftersom de tillämpas på intakta levande djur. Det första försöket vid odling C. elegans celler in vitro i stor skala gjordes av Laird Bloom under utarbetandet av sin doktorsavhandling 14. Tyvärr, svårigheter med dålig vidhäftning av cellerna till underlaget, dålig celldifferentiering och överlevnad hindrade etableringen av denna tidiga protokoll som en robust cellodlingsmetod. 1995 Edgar och kollegor publicerade ett förfarandeatt undersöka celldelning och morfogenes av isolering och odling av en enda C. elegans embryon 15. Embryoceller erhållna genom digerering av äggskal med en kombination av enzymatisk behandling och manuell dissociation fortsatte att föröka sig och att producera upp till ca 500 celler 15. Därefter Leung och medarbetare odlade ett litet antal blastomerer att studera tarm morfogenes. De visade att en in vitro isolerade E blastomere producerade polarisetarmceller som skapade en struktur analog med tarmlumen genom att interagera med varandra genom apikala adherensgränssnitten junctions 16. Buechner och kollegor rapporterade också en liknande metod för odling C. elegans embryoceller in vitro 17. Baserat på detta tidiga arbete, Christensen och kollegor utvecklat en robust protokoll för odling av embryonala C. elegans-celler in vitro 1. Devisade att isolerade C. elegans celler kan differentiera till olika celltyper och upprätthålla de funktioner som de besitter in vivo, inklusive uttrycket av cellspecifika markörer. Flera tekniker som utmanar in vivo, kan tillämpas på enstaka C. elegans embryonala celler. Dessa inkluderar elektro 1,18 19, bildbehandling, och immunkemiska metoder 20,21, samt isolering av specifika celltyper genom Lysrör-Aktivt cellsortering (FACS) för byggande av cellspecifika cDNA-bibliotek 22,23. Gen knockdown tekniker såsom RNA-interferens (RNAi) kan appliceras på odlade C. elegans-celler 1 och en ny metabolisk märkningsmetod med användning av azido-socker som ett verktyg för glykoprotein upptäckt har nyligen utvecklats för att in vitro odlad C. elegans-celler 24. Sammanfattningsvis expanderar cellodlingsmetod arrayen of tekniker som kan tillämpas på C. elegans modell i ett försök att dechiffrera geners funktion i samband med en levande organism. Vi beskriver här protokollet för odling av C. elegans embryonala celler in vitro, som till stor del bygger på protokoll som först beskrevs av Christiansen och kollegor 1.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>REAGENTS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacto Peptone</td>
			<td>VWR International Inc.</td>
			<td>90000-382</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Difco Agar Granulated</td>
			<td>VWR International Inc.</td>
			<td>90000-784</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacto Tryptone</td>
			<td>VWR International Inc.</td>
			<td>90000-284</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacto Yeast Extract</td>
			<td>VWR International Inc.</td>
			<td>90000-724</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leibovitz's L-15 Medium (1x) Liquid</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>11415-064</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>16140-063</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-streptomycin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P4333-100ML</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chitinase from Streptomyces Griseus</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C6137-25UN</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NA22 Escherichia coli</td>
			<td>Caenorhabditis Genetics Center</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peanut Lectin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L0881-10MG</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>57903-1KG</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-(+)Glucose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>67528-1KG</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylene glycol-bis (2-aminoethylether), N,N,N',N'- tetraacidic acid (EGTA)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E0396-25G</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hepes</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H3375-500G</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cholesterol</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>57653-1KG</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P9333-500G</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C1016-500G</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M8266-100G</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgSO4</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M2643-500 g</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>K2HPO4</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P2222-500G</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P9791-500G</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOH</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S8045-500G</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KOH</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P1767-500G</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Autoclaved distilled H2O</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bleach</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>EQUIPMENT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>101-1000 &mu;l Blue Graduated Pipet Tips</td>
			<td>USA Scentific</td>
			<td>1111-2821</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 ml Sterilized Pipet Individually Wrapped</td>
			<td>USA Scentific</td>
			<td>1071-0810</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ergonomic Variable Volume (100-1000 &mu;l) Pipettor with tip ejector</td>
			<td>VWR International Inc.</td>
			<td>89079-974</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Portable Pipet Aid, Drummond</td>
			<td>VWR International Inc.</td>
			<td>53498-103</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transfer Plastic Pipet Sterile</td>
			<td>VWR International Inc.</td>
			<td>14670-114</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 ml Conical Tube</td>
			<td>USA Scentific</td>
			<td>1475-1611</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 ml Conical Tube</td>
			<td>USA Scentific</td>
			<td>1500-1811</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile 18 gauge Needles</td>
			<td>Becton, Dickinson and Co.</td>
			<td>305196</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile 10 ml Syringes</td>
			<td>Becton, Dickinson and Co.</td>
			<td>305482</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic Syringe Filters Corning 0,20 &mu;m pore size</td>
			<td>Corning</td>
			<td>431224</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acrodic 25 mm Syringe filter w/5 &mu;m versapor Membrane</td>
			<td>VWR International Inc.</td>
			<td>28144-095</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>60x15 mm Petri Dish Sterile</td>
			<td>VWR International Inc.</td>
			<td>82050-548</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100x15 mm Petri Dish Sterile</td>
			<td>VWR International Inc.</td>
			<td>82050-912</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12 mm Diameter Glass Coverslips</td>
			<td>VWR International Inc.</td>
			<td>48300-560</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clear Cell Culture Plates 24 Well Flat Bottom w/lid</td>
			<td>Thomas scientific</td>
			<td>6902A09</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #5- Fine Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11254-20</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge 5702</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>022629883</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminar Flow Hood</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted Microscope with x10 objective</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ambient air humidified Incubator</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a method for culturing embryonic c. elegans cells

C. elegans är en kraftfull modellsystem, i vilka genetiska och molekylära metoder är lätta att tillämpa. Fram till helt nyligen men tekniker som kräver direkt tillgång till celler och isolering av specifika celltyper, kunde inte tillämpas i C. elegans. Denna begränsning beror på det faktum att vävnaderna är begränsade till en trycksatt nagelband som inte är lättsmält genom behandling med enzymer och / eller detergenter. Baserat på tidiga pionjärarbete från Laird Bloom, Christensen och kollegor 1 utvecklat en robust metod för odling av C. elegans embryonala celler i stor skala. Ägg är isolerade från gravida vuxna genom behandling med blekmedel / NaOH och därefter behandlas med chitinas att ta bort äggskal. Embryonala celler sedan dissocieras genom manuell pipettering och ströks ut på substrattäckta glas i serumberikat medium. Inom 24 timmar av isoleringsceller börjar differentiera genom att ändra morfologi och genom att uttrycka cellspecifika Markers. C. elegans celler odlade med hjälp av denna metod överleva i upp 2 veckor in vitro och har använts för elektrofysiologiska, immun och bildhantering analyser samt de har sorterats och används för microarray profilering.

C. elegans odlade celler differentierar och uttrycker cell specifika markörer Christensen och kollegor med trypanblått färgning visade att&gt; 99% av embryonala C. elegans celler överlever isoleringsförfarandet. Vid dag 9 och 22 efter plätering, 85% och 65%, respektive fortfarande lever 1. Isolerad embryonal C. elegans cellerna måste hålla sig till ett substrat för att skilja. Celler som inte följer bildar klumpar och det är oklart om de överlev...

Watch this Scientific Journal Video about A Method for Culturing Embryonic C. elegans Cells Video at JoVE.com

A Method for Culturing Embryonic C. elegans Cells Video (Video) | JoVE

Vi beskriver här ett reviderat protokoll för storskalig odling av embryonala C. elegans-celler. Embryonala C. elegans-celler odlade in vitro med användning av denna metod verkar att differentiera och rekapitulera uttrycket av gener i ett cellspecifikt sätt. Tekniker som kräver direkt tillgång till cellerna eller isolering av specifika celltyper från andra vävnader kan tillämpas på C. elegans odlade celler.

En metod för odling av embryonala<em&gt; C. elegans</em&gt; Celler

C. elegans is a powerful model system, in which genetic and molecular techniques are easily applicable. Until recently though, techniques that require ...

Research

JoVE Journal

Biology

A Method for Culturing Embryonic C. elegans Cells

Generation of Stable Transgenic C. elegans Using Microinjection

Generation of Stable Transgenic C. elegans Using Microinjection Video (Video) | JoVE

Generering av Stabil Transgena C. elegans Använda mikroinjektion

Transgenic Caenorhabditis elegans can be readily created via microinjection of a DNA plasmid solution into the gonad 1.  The plasmid DNA rearranges to ...

Application of a C. elegans Dopamine Neuron Degeneration Assay for the Validation of Potential Parkinson's Disease Genes

Application of a C. elegans Dopamine Neuron Degeneration Assay for the Validation of Potential Parkinson's Disease Genes Video (Video) | JoVE

Tillämpning av en C. elegans Dopamin Neuron Degeneration-analys för validering av potentiella Parkinsons sjukdomsgener

Improvements to the diagnosis and treatment of Parkinson's disease (PD) are dependent upon knowledge about susceptibility factors that render populations ...

Chromosomal Spread Preparation of Human Embryonic Stem Cells for Karyotyping

Chromosomal Spread Preparation of Human Embryonic Stem Cells for Karyotyping Video (Video) | JoVE

Kromosomala Sprid Beredning av mänskliga embryonala stamceller för karyotypning

Although human embryonic stem cells (hESC) have been shown to present a stable diploid karyotype 1, many studies have reported that depending on culture ...

Generation of Transgenic C. elegans by Biolistic Transformation

Generation of Transgenic C. elegans by Biolistic Transformation Video (Video) | JoVE

Generering av Transgena C. elegans Genom Biolistic Transformation

The number of laboratories using the free living nematode C. elegans is rapidly growing. The popularity of this biological model is attributed to a rapid ...

The Production of C. elegans Transgenes via Recombineering with the galK Selectable Marker

The Production of C. elegans Transgenes via Recombineering with the galK Selectable Marker Video (Video) | JoVE

Produktionen av C. elegans Transgener via Recombineering med GalK Markör

The creation of transgenic animals is widely utilized in C. elegans research including the use of GFP fusion proteins to study the regulation and ...

Robust Generation of Hepatocyte-like Cells from Human Embryonic Stem Cell Populations

Robust Generation of Hepatocyte-like Cells from Human Embryonic Stem Cell Populations Video (Video) | JoVE

Robust generationens Hepatocyte-liknande celler från mänskliga embryonala patientgrupper Stem Cell

Despite progress in modelling human drug toxicity, many compounds fail during clinical trials due to unpredicted side effects. The cost of clinical ...

RNAi Screening to Identify Postembryonic Phenotypes in C. elegans

RNAi Screening to Identify Postembryonic Phenotypes in C. elegans Video (Video) | JoVE

RNAi screening identifiera Postembryonic fenotyper i C. elegans</em

C. elegans has proven to be a valuable model system for the discovery and functional characterization of many genes and gene pathways1. More sophisticated ...

Preparation of Mouse Embryonic Fibroblast Cells Suitable for Culturing Human Embryonic and Induced Pluripotent Stem Cells

Preparation of Mouse Embryonic Fibroblast Cells Suitable for Culturing Human Embryonic and Induced Pluripotent Stem Cells Video (Video) | JoVE

Beredning av mus Embryonala Fibroblastceller Lämplig för odling av humana embryonala och inducerade pluripotenta stamceller

In general, human embryonic stem cells (hESCs) and human induced pluripotent stem cells (hiPSCs)1 can be cultured under variable conditions. However, it ...

A System for ex vivo Culturing of Embryonic Pancreas

A System for ex vivo Culturing of Embryonic Pancreas Video (Video) | JoVE

Ett system för<em&gt; Ex vivo</em&gt; Odling av embryonala Pancreas

The pancreas controls vital functions of our body,  including the production of digestive enzymes and regulation of blood sugar  levels1. Although in the ...

Basic Caenorhabditis elegans Methods: Synchronization and Observation

Basic Caenorhabditis elegans Methods: Synchronization and Observation Video (Video) | JoVE

Basisk<em&gt; Caenorhabditis elegans</em&gt; Metoder: Synkronisering och miljöövervakning

Research into the molecular and developmental biology of the nematode Caenorhabditis elegans was begun in the early seventies by Sydney Brenner and it has ...