Der Western Blot

Ein Western Blot wird benutzt, um spezifische Proteine in einer elektrophoretisch aufgetrennten Probe nachzuweisen. Nach der Auftrennung mit Hilfe eines Verfahrens das “Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamidgelelektrophorese”, oder SDS-PAGE, genannt wird, benutzt man einen Westerntransfer um Proteine aus dem Polyacrylamidgel auf eine Membran zu übertragen, welche die Proteine in ihrer Position festhält. Danach wird die Membran mit Antikörpern inkubiert – ein Prozess der auch Immunblotting genannt wird. Beim Immunblotting finden Antikörper-Protein und Antikörper-Antikörper Bindungen durch spezifische Bindungsseiten statt, wodurch die hohe Spezifizität die gebraucht wird um ein einzelnes Protein nachzuweisen, sichergestellt wird. Die Detektion von Antikörpern findet mit Hilfe von Reportersystemen statt, welche die Benutzung von Enzymen einschließen. Diese Enzyme sind an einem Ende des Antikörpers angebracht und reagieren mit Substraten um Farb- oder Lichtänderungen zu bewirken. Diese Signale können dann abgebildet und mit Densitometrie quantifiziert werden.

Dieser Videoartikel präsentiert einen Überblick über die Western Blot Methode und beschreibt einen Westerntransfer, die Benutzung von Antikörpererkennung und Bildanalyse. Die Schritte im Westerntransfer, wie zum Beispiel der Aufbau des “Sandwiches” und die Transferbedingungen, sowie die Theorie hinter der Antikörperbindung und wie man diese Antiköper erkennt, werden im Detail erörtert. Die weitreichenden Anwendungen dieses Verfahrens werden mit Hilfe von mehreren Beispielen, wie dem Nachweis von Protein-Protein Interaktionen und der Identifikation von individuellen Proteinen in Komplexen, gezeigt.