Name: a decellularization methodology for the production of a natural acellular intestinal matrix
Uploaded: 2013-10-07T22:45:00
Duration: 8 min 10 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Decellularization Methodology for the Production of a Natural Acellular Intestinal Matrix at JoVE.com

المؤلفان بالشكر إلى معهد ويك فوريست للطب التجديدي لمساعدتهم في تطوير هذا البروتوكول. نحن نعترف الدعم من المنح المقدمة من المؤسسة الخيرية مستشفى جريت أورموند ستريت، ومؤسسة أوجينيو يتا (جنيف، سويسرا)، ومجلس البحوث الطبية، والكلية الملكية للجراحين في انكلترا، والإحسان الطبية سباركس للأطفال، وزارة الخارجية البريطانية في المملكة المتحدة / الولايات المتحدة الأمريكية الخلايا الجذعية جائزة التعاون وصندوق البحوث ميتال. نود أيضا أن نشكر مؤسسة الجمعية الملكية / ولفسون للهندسة الأنسجة منحة تجديد المختبرات التي حصل عليها لجراحة الأطفال قسم في معهد صحة الطفل. معتمدة PDC وSE بنسبة الخيرية جريت أورموند ستريت مستشفى الأطفال.

1. عزل الجرذ الأمعاء <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد الحل 1 لتر من الفوسفات مخزنة المالحة (سيغما، المملكة المتحدة) مع 1٪ المضادات الحيوية / مضاد فطري (سيغما، المملكة المتحدة) (PBS / AA). تناسب مضخة تحوي (Masterflex L / S سرعة متغير) مع اثنين من الأنابيب. تشغيل 70٪ من الإيثانول (ETOH) من خلال أنابيب المضخة تحوي لمدة 15 دقيقة في أقصى سرعة، تليها PBS / AA لمدة 15 دقيقة أخرى. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الموت ببطء الكبار الفئران سبراغ داولي تزن حوالي 250-350 ز بواسطة CO 2 الاستنشاق وخلع عنق الرحم وفقا للمبادئ التوجيهية المحلية الحيوان والموافقات (في المملكة المتحدة، والمبادئ التوجيهية وزارة الداخلية تحت الحيوانات (الإجراءات العلمية) لعام 1986). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الأوتوكلاف الأدوات الجراحية قبل الاستخدام. رذاذ ومسح البطن للحيوان باستخدام 70٪ ETOH. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إجراء شق-xifo العانة laparotomic على البطن لضمان حقل الجراحية واضحة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> سلب الأمعاء الدقيقة على الجانب الأيمن للحيوان على منشفة ورقية رش مع 70٪ ETOH. تاكالرعاية الإلكترونية لالرطب باستمرار الأمعاء مع برنامج تلفزيوني / AA وذلك لتجنب جفاف الأنسجة وتمسخ من المصفوفة خارج الخلية (ECM). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحديد موقع الشريان المساريقي العلوي (SMA) التي تنشأ في زاوية 90 درجة من الشريان الأورطي نحو الأمعاء. استخدام 27 G قنية لدخول SMA من الشريان الأورطي، وسرعان ما سحب الإبرة لتجنب تمزق جدار السفينة. دفع أنبوب من البلاستيك للقنية في SMA وتأمين باستخدام الخيوط الجراحية (VICRYL 5/0). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تأكيد القسطرة عن طريق حقن 1 مل من برنامج تلفزيوني / AA. استخدام مقص الربيع إلى شق الشريان الأورطي القريبة والبعيدة إلى SMA وذلك للافراج عن قنية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لتجنب تسرب البراز عند تشريح خارج الأمعاء الغليظة، ومكان واحد (الحرير 5/0) خياطة عقدة على الطرف القريب من تقاطع ileocaecal واحد في نهاية البعيدة من القولون السيني. ثم قطع محطة الدقاق والقولون بين عقدة اثنين وإزالة الأمعاء الغليظة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> خفض الأمعاء في الاثني عشر، الصائم على مفرقالثانية تحرير الأمعاء من أية اتصالات النسيج الضام أنه قد يكون مع البطن. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل الأمعاء الدقيقة في طبق بتري مع برنامج تلفزيوني / AA. يقني؛ يدخل القنية القسم الداني من الأمعاء مع ماصة باستير البلاستيك (LSL مختبر المواد الاستهلاكية) وضمان الحصول عليها في مكان مع الغرز. قطع ماصة لذلك سوف تناسب يور لوك من حقنة 60 مل (BD Plastipak). دافق تجويف الأمعاء 2X مع 60 مل من برنامج تلفزيوني / AA لإزالة البراز والحطام. </li></ol> 2. منهجية Decellularization <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ربط الأوعية الدموية قنية إلى محبس ثلاثي. وسوف يخفف هذا التعامل، وتقليل التوتر على الشجرة الوعائية والسماح إزالة الفقاعات من الأنبوب. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بدء تشغيل الماء منزوع الأيونات (18.2 المقاومة MΩ / سم) من خلال Masterflex L / S سرعة متغير مضخة الأسطوانة عند 0.6 مل / ساعة. ضمان عدم وجود فقاعات موجودة داخل أنابيب قبل الاتصال مع محبس معة الأمعاء. قد تكون بعض الفقاعات الموجودة داخل التجويف من الخطوة1.9، والتي قد تعيق عملية decellularization. تختلف سرعة المضخة ومعالجة الأنسجة مع ملقط بعناية لضمان خروج فقاعات من النهاية البعيدة. لا تقم بتوصيل قنية الأوعية الدموية حتى يتم الانتهاء من هذه العملية منذ السرعات العالية قد يؤدي إلى تلف الأوعية الدموية شجرة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل الجهاز إلى غرفة باردة، منذ يتم تنفيذ الخطوة التالية من decellularization في 4 درجات مئوية. درجة الحرارة منخفضة يسمح إزالة الخلايا في حين تقليل تحلل الأنسجة. وضع طبق بتري في الحاوية التي ستجمع الحل تفيض. يروي كل من لمعة الأمعاء والشجرة الوعائية مع الماء منزوع الأيونات (18.2 المقاومة MΩ / سم) لمدة 24 ساعة في 0.6 مل / ساعة. لأول ساعة فحص الجهاز بشكل منتظم لضمان كافة الاتصالات غير آمنة، والتسرب هو الحد الأدنى وعدم وجود فقاعات موجودة داخل الأمعاء. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد 24 ساعة من العلاج مع الماء منزوع الأيونات، نقل الجهاز decellularization خارج الغرفة الباردة مثل باقي الخطوات هينفذت في درجة حرارة الغرفة (RT). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تزن deoxycholate الصوديوم (سيغما، المملكة المتحدة) لتحضير 300 مل من محلول 4٪ في الماء منزوع الأيونات. تزن deoxycholate الصوديوم تحت غطاء الشفط، كما هو مصدر إزعاج عن طريق الفم والعين. مزيج باستخدام الدوامة حتى الحل واضح. ويمكن الاحتفاظ الحل في 4 درجات مئوية لمدة تصل إلى 1 في الشهر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تغيير الحل منزوع الأيونات إلى deoxycholate الصوديوم، والتحقق من وصلات، وإزالة أي فقاعات ويروي عند 0.6 مل / ساعة لمدة 4 ساعة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد deoxycholate الصوديوم خطوة يغسل مع برنامج تلفزيوني / AA لمدة 30 دقيقة لتجنب التفاعل بين deoxycholate الصوديوم والدناز-I. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تزن من ديوكسي ريبونيوكلياز-I (الدناز-I، سيغما) وإعداد 250 مل من محلول 2،000 كو في 1 M كلوريد الصوديوم، ودرجة الحموضة 7.4. مزيج باستخدام الدوامة حتى الحل واضح. يجب أن يكون مستعدا هذا الحل فورا قبل الاستخدام ولا يمكن تخزينها. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يروي مع الدناز-I لمدة 3 ساعة على RT بسرعة 0.6 مل / ساعة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الخطوة التالية الدناز-I، ونقلسقالة في نسيج الثقافة هود وتغيير لوحات والصكوك. يقترح استخدام تقنية العقيم. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يغسل مع برنامج تلفزيوني / AA لمدة 30 دقيقة لضمان إزالة جميع مخلفات الحلول decellularization. وضع السقالة في طبق بتري جديدة ونقل إلى Crosslinker الأشعة فوق البنفسجية (Spectroline، الولايات المتحدة). تشغيل دورتين التعقيم. تخزين في 5٪ PBS / AA وتغيير الحل كل 3 أيام. </li></ol>

<ol>
	<li>Atala, A., Bauer, S. B., Soker, S., Yoo, J. J., Retik, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue-engineered+autologous+bladders+for+patients+needing+cystoplasty.">Tissue-engineered autologous bladders for patients needing cystoplasty.</a> Lancet. 367 (9518), 1241-1246 (2006).</li><li>Raya-Rivera, A., Esquiliano, D. R., Yoo, J. J., Lopez-Bayghen, E., Soker, S., Atala, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue-engineered+autologous+urethras+for+patients+who+need+reconstruction:+an+observational+study.">Tissue-engineered autologous urethras for patients who need reconstruction: an observational study.</a> Lancet. 377 (9772), 1175-1182 (2011).</li><li>Macchiarini, P., Jungebluth, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+transplantation+of+a+tissue-engineered+airway.">Clinical transplantation of a tissue-engineered airway.</a> Lancet. 372 (9655), 2023-2030 (2008).</li><li>Macchiarini, P., Walles, T., Biancosino, C., Mertsching, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=First+human+transplantation+of+a+bioengineered+airway+tissue.">First human transplantation of a bioengineered airway tissue.</a> J. Thorac. Cardiov. Surg. 128 (4), 638-641 (2004).</li><li>Elliott, M. J., de Coppi, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stem-cell-based,+tissue+engineered+tracheal+replacement+in+a+child:+a+2-year+follow-up+study.">Stem-cell-based, tissue engineered tracheal replacement in a child: a 2-year follow-up study.</a> Lancet. 380 (9846), 994-1000 (2012).</li><li>Grikscheit, T. C., Siddique, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue-engineered+small+intestine+improves+recovery+after+massive+small+bowel+resection.">Tissue-engineered small intestine improves recovery after massive small bowel resection.</a> Ann. Surg. 240 (5), 748-754 (2004).</li><li>Sala, F. G., Matthews, J. A., Speer, A. L., Torashima, Y., Barthel, E. R., Grikscheit, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Multicellular+Approach+Forms+a+Significant+Amount+of+Tissue-Engineered+Small+Intestine+in+the+Mouse.">A Multicellular Approach Forms a Significant Amount of Tissue-Engineered Small Intestine in the Mouse.</a> Tissue Eng. Part A. , (2011).</li><li>Matthews, J. A., Sala, F. G., Speer, A. L., Warburton, D., Grikscheit, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=VEGF+optimizes+the+formation+of+tissue-engineered+small+intestine.">VEGF optimizes the formation of tissue-engineered small intestine.</a> Regen. Med. 6 (5), 559-567 (2011).</li><li>Chen, M. K., Badylak, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small+bowel+tissue+engineering+using+small+intestinal+submucosa+as+a+scaffold.">Small bowel tissue engineering using small intestinal submucosa as a scaffold.</a> J. Surg. Res. 99 (2), 352-358 (2001).</li><li>Wang, Z. Q., Watanabe, Y., Toki, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experimental+assessment+of+small+intestinal+submucosa+as+a+small+bowel+graft+in+a+rat+model.">Experimental assessment of small intestinal submucosa as a small bowel graft in a rat model.</a> J. Pediatr. Surg. 38 (11), 1596-1601 (2003).</li><li>Wang, Z. Q., Watanabe, Y., Noda, T., Yoshida, A., Oyama, T., Toki, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphologic+evaluation+of+regenerated+small+bowel+by+small+intestinal+submucosa.">Morphologic evaluation of regenerated small bowel by small intestinal submucosa.</a> J. Pediatr. Surg. 40 (12), 1898-1902 (2005).</li><li>Hori, Y., Nakamura, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experimental+study+on+tissue+engineering+of+the+small+intestine+by+mesenchymal+stem+cell+seeding.">Experimental study on tissue engineering of the small intestine by mesenchymal stem cell seeding.</a> J. Surg. Res. 102 (2), 156-160 (2002).</li><li>Gardner-Thorpe, J., Grikscheit, T. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Angiogenesis+in+tissue-engineered+small+intestine.">Angiogenesis in tissue-engineered small intestine.</a> Tissue Eng. 9 (6), 1255-1261 (2003).</li><li>Conconi, M. T., Coppi, P. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tracheal+matrices,+obtained+by+a+detergent-enzymatic+method,+support+in+vitro+the+adhesion+of+chondrocytes+and+tracheal+epithelial+cells.">Tracheal matrices, obtained by a detergent-enzymatic method, support in vitro the adhesion of chondrocytes and tracheal epithelial cells.</a> Transpl. Int. 18 (6), 727-734 (2005).</li><li>Ott, H. C., Matthiesen, T. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Perfusion-decellularized+matrix:+using+nature's+platform+to+engineer+a+bioartificial+heart.">Perfusion-decellularized matrix: using nature's platform to engineer a bioartificial heart.</a> Nat. Med. 14 (2), 213-221 (2008).</li><li>Uygun, B. E., Soto-Gutierrez, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organ+reengineering+through+development+of+a+transplantable+recellularized+liver+graft+using+decellularized+liver+matrix.">Organ reengineering through development of a transplantable recellularized liver graft using decellularized liver matrix.</a> Nat. Med. , 1-8 (2010).</li><li>Uygun, B. E., Price, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Decellularization+and+recellularization+of+whole+livers.">Decellularization and recellularization of whole livers.</a> J. Vis. Exp. (48), e2394 (2011).</li><li>Petersen, T. H., Calle, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue-Engineered+Lungs+for+in+Vivo+Implantation.">Tissue-Engineered Lungs for in Vivo Implantation.</a> Science. 329 (5991), 538-541 (2010).</li><li>Ott, H. C., Clippinger, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regeneration+and+orthotopic+transplantation+of+a+bioartificial+lung.">Regeneration and orthotopic transplantation of a bioartificial lung.</a> Nat. Med. 16 (8), 927-933 (2010).</li><li>Calle, E. A., Petersen, T. H., Niklason, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Procedure+for+lung+engineering.">Procedure for lung engineering.</a> J. Vis. Exp. (49), e2651 (2011).</li><li>Totonelli, G., Maghsoudlou, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rat+decellularized+small+bowel+scaffold+that+preserves+villus-crypt+architecture+for+intestinal+regeneration.">A rat decellularized small bowel scaffold that preserves villus-crypt architecture for intestinal regeneration.</a> Biomaterials. 33 (12), 3401-3410 (2012).</li><li>Sala, F. G., Kunisaki, S. M., Ochoa, E. R., Vacanti, J., Grikscheit, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue-engineered+small+intestine+and+stomach+form+from+autologous+tissue+in+a+preclinical+large+animal+model.">Tissue-engineered small intestine and stomach form from autologous tissue in a preclinical large animal model.</a> J. Surg. Res. 156 (2), 205-212 (2009).</li><li>Demirbilek, S., Kanmaz, T., Ozardali, I., Edali, M. N., Y&#252;cesan, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+porcine+small+intestinal+submucosa+in+intestinal+regeneration.">Using porcine small intestinal submucosa in intestinal regeneration.</a> Pediatr. Surg. Int. 19 (8), 588-592 (2003).</li></ol>

أعلن عن أي تضارب في المصالح.

الخطوات الأكثر صعوبة في إقامة هذه التجربة تنطوي على القسطرة من SMA وإنشاء وصيانة العقم. يمكن Cannulating المتوسط ​​الحسابي في القوارض دون تمزق الجدار سيكون من الصعب جدا نظرا لحجم وموقع السفينة. بدلا من ذلك، قد يتم وضع خياطة حول الأبهر الداني قبل SMA الأصل، ثم عن طريق القسطرة من الشريان الأورطي نفسه بشكل أقصى، وتوجيه قنية البلاستيك في SMA. خلال decellularization مزيج من سوء وضع قنية ومعدلات تدفق عالية قد يؤدي إلى فقدان الوصول الى الاوعية الدموية. العقم هو مشكلة كبيرة نظرا لكمية من النباتات البكتيرية الموجودة في الأمعاء الدقيقة. غسل مع PBS / AA التالية الحصاد مهم جدا، ويجب إزالة أي علامة على البراز أو الحطام من التجويف. يجب وضع جزء من السقالة في أنبوب الصقر مع DMEM في الحاضنة بعد التعقيم بالأشعة فوق البنفسجية يكون مؤشرا إذا كان قد تم تحقيق العقم. في حالةالاستعمار الجرثومي، فإن وسائل الإعلام تغيير درجة الحموضة مع لونه تحول من الأحمر إلى الأصفر. للتعامل مع هذا، وينصح كذلك دورات للأشعة فوق البنفسجية وكذلك الغسيل مع برنامج تلفزيوني يحتوي على نسبة عالية من المضادات الحيوية / مضاد فطري. ومن شأن التعديل الممكن الحصول على السقالة مع وصول كل من الأوعية الدموية الوريدية وتكون ليقني؛ يدخل القنية في الوريد الأجوف السفلي (IVC) فضلا عن SMA. ينبغي محاولة Decellularization من الجانبين وريدي والأوعية الدموية بشكل متقطع لجميع الحلول الثلاثة. decellularization المستمر قد تنفجر الشعيرات الدموية من خلال وجود ضغط إيجابي على كلا الجانبين. على مر السنين كان هناك عدد من الجهود في الأمعاء TE باستخدام تركيبات مختلفة الخلايا سقالة في المختبر والمجراة 6،9،12. وقد تم تنفيذ معظم أعمال باستخدام أنبوبي محبوكة 95٪ PGA-5٪ السقالات PLGA المغلفة مع نوع الكولاجين أنا 6،7،13،22. بعد غرس البذور مع المعويةوحدات الظهارية عضوي (الأوس) وفترة الزرع في الثرب من الفئران، فإنها تشكل كيسات مع العضلات على الخارج وظهارة في الداخل ومن ثم يمكن tubularized. ومع ذلك، فإن المسامية والبساطة في تصميم هذه السقالات لا يسمح لجيل من القطع الكبيرة من الأمعاء في بيئة اصطناعية في المختبر مثل تلك التي من مفاعل حيوي. بالإضافة إلى ذلك، فإن عدم وجود شبكة الأوعية الدموية الفطرية التي يمكن توصيلها إلى المتلقي مزيد يحد من استخدام هذه السقالة للترجمة السريرية. إلى جانب التجارب مع السقالات PGA-PLGA، استخدمت جماعات أخرى الكولاجين أو SIS السقالات، وكلاهما لا تكرار المعضلة من الأمعاء. SIS على وجه الخصوص هي المنهجية الوحيدة السابقة التي نشرت في هندسة الأنسجة المعوية واستخدمت في أكثر من 150 الإعدادات الطبية، مما يدل على قدرة السقالات decellularized لتوفير الاستقرار الميكانيكية وتشجيع نمو الخلايا في حين الرصاصجي إلى أي استجابة المناعية. ومع ذلك، فإن عدم وجود البنية الكلي والجزئي المناسبة، أدى إلى سوء النتائج في &#39;استخدام لأغراض المعوية TE 9-11،23. وتشمل فوائد منهجية decellularization وصفناها الحفاظ على الخصائص المجهرية مثل اللمعية العمارة سرداب-زغابة التي تمثل بيئة مناسبة لإعادة تعمير من قبل الأمعاء المتخصصة الخلايا الجذعية. في الجانب العيانية، فإن وجود شبكة الأوعية الدموية الهرمي تمكين المرفق إلى المستلم، مما يتيح توفير المواد المغذية والأكسجين إلى كل طبقة من الأمعاء TE-21. ما هو أكثر من ذلك، الحفاظ على مكونات ECM مثل الكولاجين، والإيلاستين وglyocosaminoglycans دورا هاما ليس فقط للخصائص الميكانيكية ولكن أيضا توجيه الانتشار الخلوي والتمايز. الأهم من ذلك، من قدرة منهجية decellularization يتم تصعيده إلى كبيرةص الأنسجة مع الحفاظ على نفس الخصائص هو سمة هامة للترجمة السريرية من الشركة المصرية للاتصالات. تطوير مصفوفة المعوية الطبيعية مع شبكة الأوعية الدموية يتيح إنشاء شرائح أكبر من الأمعاء الاصطناعي التي يمكن توصيلها إلى المضيف.

هندسة الأنسجة (TE) توفر بديلا العلاجية لزرع الأعضاء، وتجاوز القضايا من نقص المناعة والجهاز. تمت زيارتها مؤخرا TE التطبيقات الناجحة في العيادة، مع استبدال الأجهزة مثل المثانة 1، 2 مجرى البول والقصبة الهوائية، سواء في البالغين والأطفال 3،4 5. بناء الجهاز الأنسجة المهندسة يتطلب مزيجا من السقالة مع الخلايا المناسبة. يمكن إعداد السقالة باستخدام المشتقة طبيعيا (مثل الكولاجين) والاصطناعية (مثل بولي-L-حمض الجليكوليك؛ PLGA) مواد، أو أن يحصل عليها decellularization الأعضاء والأنسجة الأصلية. وكانت السقالات التي استخدمت حتى الآن لTE المعوية أساسا إما decellularized (تحت مخاطية الأمعاء الصغيرة) أو الاصطناعية (بولي-L-حمض الجليكوليك وحمض اللبنيك بولي) 6-13. هذه الحيوية هي بسيطة جدا في كل من العمارة الكلي والجزئي، والذيقد لا يكون مثاليا إذا الأمعاء الأنسجة المهندسة هو أن تترجم سريريا. ينبغي أن يكون مادة بيولوجية الأمثل لالأمعاء شجرة الأوعية الدموية الفطرية التي يمكن توصيلها إلى إمدادات الدم المضيف، جدار أنبوبي المستويات مع خصائص مختلفة لتعكس طبقات من جدار الأمعاء ومحور زغابة سرداب على الجانب اللمعية للمساعدة في إعادة تعمير بواسطة الخلايا الجذعية الظهارية. Decellularization هي منهجية الرواية التي تنتج عن طريق إزالة السقالات الخلايا من الأجهزة كلها مع الحفاظ على العمارة الأصلية 14. هذا هو أفضل من السقالات الموجودة بالفعل لأنها لا تكرار، ليس فقط هيكل الجهاز ولكن أيضا تحتوي على منبهات الكيميائية جزءا لا يتجزأ من داخل المصفوفة خارج الخلية (ECM) أن المساعدات انتشار الخلوي والتمايز. في عام 2008 تم decellularized والقصبة الهوائية جثي 14، المصنف مع خلايا المريض نفسه، وزرعها لاستبدال القصبة اليسرى الرئيسي في شاب <sup&gt; 3. منذ ذلك الحين، وأفاد عدد من المجموعات إنتاج السقالات decellularized للقلب 15، 16،17 الكبد، والرئة 18-20 في الحيوانات الصغيرة والكبيرة. تكيفنا أيضا نفس المنهجية لإنتاج سقالة decellularized الأمعاء الصغيرة 21. الهدف من الطريقة الموصوفة هنا هو إنتاج مصفوفات المعوية decellularized التي تحافظ على الخصائص العيانية من النسيج الأصلي مثل تدفق الدم، فضلا عن الهندسة المعمارية مجهرية من المحور زغابة سرداب في لمعة الأمعاء. نعتقد يمكن اعتماد هذه المنهجية في نهاية المطاف عن الأجهزة الأخرى لتحسين كفاءة decellularization.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Name of Material</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol solution, 70% in H20</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>02877</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline tablets</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>79382</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotic Antimycotic Solution (100x)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A5955</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium deoxycholate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D6750</td>
			<td>Oral and eye irritant; use protection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deoxyribonuclease I from bovine pancreas</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D5025</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a decellularization methodology for the production of a natural acellular intestinal matrix

هندسة الأنسجة ناجحة ينطوي على مزيج من السقالات المناسبة مع الخلايا في المختبر أو في الجسم الحي. قد تكون السقالات الاصطناعية، وبطبيعة الحال المستمدة أو المشتقة من الأنسجة / الأعضاء. ويتم الحصول على هذه الأخيرة باستخدام تقنية تسمى decellularization. قد تنطوي على مزيج من Decellularization الفيزيائية والكيميائية، وأساليب الأنزيمية. الهدف من هذه التقنية هو لإزالة كل آثار الخلوية مع الحفاظ على الهندسة المعمارية الدقيقة الكلي والنسيج الأصلي. هندسة الأنسجة المعوية وقد استخدمت حتى الآن السقالات بسيطة نسبيا والتي لا تكرار بنية معقدة من الجهاز الأصلي. محور هذه الورقة هو لوصف تقنية فعالة لdecellularization الفئران الأمعاء الدقيقة. يوصف العزلة من الأمعاء الدقيقة وذلك لضمان المحافظة على اتصال الأوعية الدموية. مزيج من المحاليل الكيميائية والأنزيمية لإزالة الخلايا حين إلىتم تعيين الحادي الحفاظ على محور زغابة سرداب في الجانب اللمعية من السقالة أيضا. أخيرا، وتناقش تقييم السقالات المنتجة للخصائص المناسبة.

على decellularization الناجحة (الشكل 1)، وينبغي أن يكون السقالة مظهر العيانية مماثلة لتلك التي من الأمعاء الأم، ولكن مع جدران شفافة (الشكل 2A). وينبغي أيضا أن يكون الحفاظ على العمارة الكلي واضح من جانب المباح من شجرة الأوعية الدموية. عندما يتم حقن صبغة من خلال قنية SMA، فإنه ينبغي أن توزع بالتساوي في جميع أنحاء السقالة والوصول إلى شجرة الشعرية (الشكل 2B). وينبغي أن يكون السقالة خالية من المواد النووية وحشوية، وهو الأمر الذي يمكن تقييم استخدام عدة الكمي الحمض النووي والتحليل النسيجي بسيطة. الهيماتوكسيلين وتلطيخ يوزين (H &amp; E) وينبغي أن يبين عدم وجود مواد نووية وحشوية مع المحافظة على طبقات الأمعاء الصغيرة (الشكل 3A). على وجه الخصوص، ينبغي أن يكون الحفاظ على الزغب والخبايا على الجانب اللمعية واضحا بعد المسح الضوئي المجهر الإلكتروني (الشكل 4). Aوينبغي أيضا أن يتوقع المحافظة على مكونات المصفوفة خارج الخلية مثل الكولاجين، والإيلاستين والجليكوزامينوجليكان. على سبيل المثال، يعرض ثلاثي الألوان ماسون في تلطيخ سليمة النسيج الضام في السقالة (الشكل 3B). <img alt="الشكل 1" fo:content-width="6.5in" src="/files/ftp_upload/50658/50658fig1.jpg" width="600px" /> الشكل 1. . خطة تجريبية الجدول الزمني الداخلي decellularization؛ PBS / AA: الفوسفات مخزنة المالحة مع NaDeoxy للمضادات الحيوية مضاد فطري،: deoxycholate الصوديوم، RT: درجة حرارة الغرفة، الدناز-I: ديوكسي ريبونيوكلياز-I. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/50658/50658fig1highres.jpg" target="_blank">اضغط هنا لمشاهدة صورة بشكل اكبر</a> . <img alt="الرقم 2" fo:content-width="6.5in" src="/files/ftp_upload/50658/50658fig2.jpg" width="600px" /> الشكل 2. سقالة macroscopiج الخصائص. مظهر عياني من الأمعاء الدقيقة الفئران التالية decellularization الناجحة (A). حقن روسو الشقائقية صبغ خلال SMA يدل على شبكة الأوعية الدموية سليمة (B)؛ SMA: الشريان المساريقي العلوي <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/50658/50658fig2highres.jpg" target="_blank">اضغط هنا لمشاهدة صورة بشكل اكبر</a> . <img alt="الرقم 3" fo:content-width="6.5in" src="/files/ftp_upload/50658/50658fig3.jpg" width="600px" /> الرقم 3. . الأنسجة H &amp; E (A) وMT (B) تلطيخ تشير إلى عدم وجود مواد الخلوية مع الحفاظ على بنية النسيج الضام؛ H &amp; E: الهيماتوكسيلين ويوزين، MT: ثلاثي الألوان ماسون في. شريط مقياس: 100 ميكرون <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/50658/50658fig3highres.jpg" target="_blank">اضغط هنا لمشاهدة صورة بشكل اكبر</a> . </ع&gt; <img alt="الرقم 4" fo:content-width="6.5in" src="/files/ftp_upload/50658/50658fig4.jpg" width="600px" /> الشكل 4. . الإلكترون المجهري الضوئي المجهر الإلكتروني يشير إلى الحفاظ على العمارة زغابة-سرداب في التجويف سقالة؛ شريط مقياس: 100 ميكرون <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/50658/50658fig4highres.jpg" target="_blank">اضغط هنا لمشاهدة صورة بشكل اكبر</a> .

Watch this Scientific Journal Video about A Decellularization Methodology for the Production of a Natural Acellular Intestinal Matrix at JoVE.com

A Decellularization Methodology for the Production of a Natural Acellular Intestinal Matrix

يصف المقال منهجية لإنتاج مصفوفة ديكي من الأمعاء الفئران. اشتقاق السقالات المعوية المهم للتطبيقات المستقبلية في هندسة الأنسجة، بيولوجيا الخلايا الجذعية واختبار المخدرات.

منهج Decellularization لإنتاج وغير خلوي الطبيعية المعوية ماتريكس

Successful tissue engineering involves the  combination of scaffolds with appropriate cells in vitro or in vivo.  Scaffolds may be synthetic, ...

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Decellularization and Recellularization of Whole Livers

وDecellularization Recellularization الأكباد من الجامعة

The liver is a complex organ which requires constant perfusion for delivery of nutrients and oxygen and removal of waste in order to survive1. Efforts to ...

Synthetic Spider Silk Production on a Laboratory Scale

الاصطناعية إنتاج حرير العنكبوت على نطاق المختبر

As society progresses and resources become scarcer, it is becoming increasingly important to cultivate new technologies that engineer next generation ...

Co-culture of Living Microbiome with Microengineered Human Intestinal Villi in a Gut-on-a-Chip Microfluidic Device

شارك في ثقافة المعيشة Microbiome مع المعوية الزوائد Microengineered الإنسان في الوتر على واحد في رقاقة ميكروفلويديك الأجهزة

Here, we describe a protocol to perform long-term co-culture of multi-species human gut microbiome with microengineered intestinal villi in a human ...

Tunable Hydrogels from Pulmonary Extracellular Matrix for 3D Cell Culture

الانضباطي الهلاميات المائية من الرئوي خارج الخلية مصفوفة للثقافة خلية 3D

Here we present a method for establishing multiple component cell culture hydrogels for in vitro lung cell culture. Beginning with healthy en bloc lung ...

Decellularization and Recellularization Methodology for Human Saphenous Veins

ديسيلولاريزيشن ومنهجية ريسيلولاريزيشن للاوردة الصافن البشرية

Vascular conduits used during most vascular surgeries are allogeneic or synthetic grafts that often lead to complications caused by immunosuppression and ...

Decellularization of Whole Human Heart Inside a Pressurized Pouch in an Inverted Orientation

ديسيلولاريزيشن قلب البشري برمته داخل حقيبة الضغط في اتجاه معكوس

The ultimate solution for patients with end-stage heart failure is organ transplant. But donor hearts are limited, immunosuppression is required, and ...

Isolation and Decellularization of a Whole Porcine Pancreas

والعزلة وديسيلولاريزيشن من بنكرياس الخنزير كله

Tissue engineering of the whole pancreas can improve current treatments for diabetes mellitus. The ultimate goal is to tissue engineer pancreas from an ...

Fabricating a Kidney Cortex Extracellular Matrix-Derived Hydrogel

اختﻻق الكلي لحاء خارج الخلية المستمدة من مصفوفة المائية

Extracellular matrix (ECM) provides important biophysical and biochemical cues to maintain tissue homeostasis. Current synthetic hydrogels offer robust ...

A Human 3D Extracellular Matrix-Adipocyte Culture Model for Studying Matrix-Cell Metabolic Crosstalk

A الإنسان 3D مصفوفة-الخلايا الشحمية نموذج ثقافة لدراسة مصفوفة خليه الأيض الأيضي

The extracellular matrix (ECM) plays a central role in regulating tissue homeostasis, engaging in crosstalk with cells and regulating multiple aspects of ...

A Quantitative Fluorescence Microscopy-based Single Liposome Assay for Detecting the Compositional Inhomogeneity Between Individual Liposomes

A الكمي الفلورية المجهري القائم علي فحص ليبوسوم واحد للكشف عن التجانس التركيبي بين الجسيمات الشحمية الفردية

Most research employing liposomes as membrane model systems or drug delivery carriers relies on bulk read-out techniques and thus intrinsically assumes ...