Name: a decellularization methodology for the production of a natural acellular intestinal matrix
Uploaded: 2013-10-07T22:45:00
Duration: 8 min 10 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Decellularization Methodology for the Production of a Natural Acellular Intestinal Matrix at JoVE.com

Forfatterne takker Wake Forest Institute of regenerativ medisin for deres hjelp med utvikling av denne protokollen. Vi erkjenner støtte med tilskudd fra Great Ormond Street Hospital veldedighet, Stiftelsen Eugenio Litta (Genève, Sveits), Medical Research Council, Royal College of Surgeons of England, The Sparks Barnas Medical Charity, den britiske utenriksdepartementet for Storbritannia / USA Stem Cell Collaboration Award og Mittal forskningsfond. Vi vil også gjerne takke Royal Society / Wolfson Foundation for tissue engineering laboratorium oppussing stipend innhentet for Pediatric Surgery avdeling i Institute of Child Health. PDC og SE støttes av Great Ormond Street Hospital Children Charity.

En. Isolering av Rat Tarmen <ol><li> Forbered en 1 L løsning fra fosfat bufret (Sigma, UK) med 1% antibiotika / antimycotic (Sigma, UK) (PBS / AA). Monter peristaltisk pumpe (Masterflex L / S variabel hastighet) med to rør. Kjør 70% etanol (EtOH) gjennom rørene av den peristaltiske pumpe i 15 minutter ved maksimal hastighet, etterfulgt av PBS / AA i ytterligere 15 min. </li><li> Avlive voksne Sprague-Dawley rotter som veier ca 250-350 g av CO 2 innånding og halshugging i henhold til lokale retningslinjer dyr og godkjenninger (i Storbritannia, hjemmekontor retningslinjer under Dyr (vitenskapelige prosedyrer) Act 1986). </li><li> Autoklav de kirurgiske instrumenter før bruk. Spray og tørk av buken på dyret ved hjelp av 70% EtOH. </li><li> Utfør et xifo-kjønnshår laparotomic snitt på magen for å sikre en klar kirurgiske feltet. </li><li> Eviscerate tynntarmen på høyre side av dyret på et papirhåndkle sprayet med 70% EtOH. Take seg til kontinuerlig å fukte tarmen med PBS / AA, slik som å unngå dehydrering av vev og denaturering av den ekstracellulære matriks (ECM). </li><li> Finn den overlegne mesenteric arterie (SMA) som oppstår i en 90 ° vinkel fra aorta mot tarmen. Bruke en 27 G kanyle for å gå inn i SMA fra aorta og raskt trekke nålen for å unngå å rive veggen av karet. Advance plastrøret av kanylen inn i SMA og fest med suturer (Vicryl 5/0). </li><li> Bekreft kanylering ved å injisere 1 ml PBS / AA. Bruk fjær saks for å incise aorta proksimalt og distalt til SMA, slik som å slippe en kanyle. </li><li> For å unngå lekkasje av avføring når dissekere ut tykktarmen, plasserer en (Silke 5/0) sutur knute på den proksimale ende av ileocaecale knutepunkt og en ved den distale enden av colon sigmoideum. Deretter kuttes terminal ileum og colon mellom de to knuter og fjerne tykktarmen. </li><li> Kutt tarmen ved jejuno-duodenal krysset ennd frigjøre tarmen fra noen bindevev forbindelser det måtte ha med magen. </li><li> Overfør tynntarmen i en petriskål med PBS / AA. Cannulate proksimale delen av tarmen med en plast Pasteur pipette (LSL laboratorie forbruksvarer) og fest den på plass med sting. Skjær pipetten slik at det vil passe Luer-Lok av en 60 ml sprøyte (BD Plastipak). Skylle tarmen lumen 2x med 60 ml PBS / AA for å fjerne avføring og rusk. </li></ol> 2. Decellularization Methodology <ol><li> Koble vaskulær kanyle til en tre-veis stoppekran. Dette vil lette håndteringen, redusere spenningen på det vaskulære treet og tillater fjerning av bobler fra slangen. </li><li> Begynne deionisert vann (resistivitet 18.2 MΩ / cm) gjennom Masterflex L / S variabel hastighet valsen pumpe ved 0,6 ml / hr. Sikre at ingen bobler innen rør før du kobler med intestinal lumen stoppekran. Noen bobler kan være tilstede inne i hulrommet fra trinnet1,9, noe som kan svekke decellularization prosessen. Variere hastigheten på pumpen og behandle vevet med pinsett nøye for å sikre at boblene kommer ut av den distale enden. Ikke koble vaskulær kanyle før denne prosessen er ferdig, siden høye hastigheter kan skade vaskulær treet. </li><li> Overfør apparat til kjølerommet, da det følgende trinn av decellularization blir utført ved 4 ° C. Den lave temperaturen gjør at fjerning av celler mens minimere vev nedbrytning. Plasser petriskål i en beholder som vil samle opp overstrømmende oppløsning. Perfuse begge tarmlumen og det vaskulære treet med avionisert vann (resistivitet 18.2 MΩ / cm) i 24 timer ved 0,6 ml / hr. For den første timen sjekke apparatet regelmessig for å sikre at alle tilkoblinger er sikre, er lekkasje minimal og ingen bobler er tilstede i tarmen. </li><li> Etter 24 timers behandling med avionisert vann, beveger decellularization anordning utenfor kjølerommet som resten av trinnene erutført i romtemperatur (RT). </li><li> Vei natriumdeoksycholat (Sigma, UK) for å forberede 300 ml av en 4% oppløsning i deionisert vann. Vei natriumdeoksycholat under en sugevifte, som den er en oral og irriterende for øynene. Bland ved hjelp av en vortex inntil oppløsningen er klar. Oppløsningen kan holdes ved 4 ° C i opp til 1 måned. </li><li> Endre avionisert løsning til natriumdeoksycholat, sjekk tilkoblingene, fjern eventuelle bobler og perfuse på 0,6 ml / t for 4 timer. </li><li> Etter at natrium-deoksycholat trinn vask med PBS / AA i 30 min for å unngå interaksjon mellom natrium-deoksycholat og DNase-I. </li><li> Vei opp deoksyribonuklease-I (DNase-I, Sigma) og forberede 250 ml av en 2000 kU oppløsning i 1 M natriumklorid, pH 7,4. Bland ved hjelp av en vortex inntil oppløsningen er klar. Denne løsningen må tilberedes umiddelbart før bruk og kan ikke lagres. </li><li> Perfuse med DNase-I i 3 timer ved romtemperatur med en hastighet på 0,6 ml / time. </li><li> Etter DNase-I trinn, overførestillas til en vev kultur hette og endre plater og instrumenter. Det er foreslått å bruke aseptisk teknikk. </li><li> Vask med PBS / AA i 30 min for å sikre at alle rester av decellularization løsninger er fjernet. Plasser stillaset i en ny petriskål og overføre til en UV kryss kobling (Spectroline, USA). Kjør to steriliseringssykluser. Oppbevar i 5% PBS / AA og endre løsningen hver 3. dag. </li></ol>

<ol>
	<li>Atala, A., Bauer, S. B., Soker, S., Yoo, J. J., Retik, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue-engineered+autologous+bladders+for+patients+needing+cystoplasty.">Tissue-engineered autologous bladders for patients needing cystoplasty.</a> Lancet. 367 (9518), 1241-1246 (2006).</li><li>Raya-Rivera, A., Esquiliano, D. R., Yoo, J. J., Lopez-Bayghen, E., Soker, S., Atala, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue-engineered+autologous+urethras+for+patients+who+need+reconstruction:+an+observational+study.">Tissue-engineered autologous urethras for patients who need reconstruction: an observational study.</a> Lancet. 377 (9772), 1175-1182 (2011).</li><li>Macchiarini, P., Jungebluth, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+transplantation+of+a+tissue-engineered+airway.">Clinical transplantation of a tissue-engineered airway.</a> Lancet. 372 (9655), 2023-2030 (2008).</li><li>Macchiarini, P., Walles, T., Biancosino, C., Mertsching, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=First+human+transplantation+of+a+bioengineered+airway+tissue.">First human transplantation of a bioengineered airway tissue.</a> J. Thorac. Cardiov. Surg. 128 (4), 638-641 (2004).</li><li>Elliott, M. J., de Coppi, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stem-cell-based,+tissue+engineered+tracheal+replacement+in+a+child:+a+2-year+follow-up+study.">Stem-cell-based, tissue engineered tracheal replacement in a child: a 2-year follow-up study.</a> Lancet. 380 (9846), 994-1000 (2012).</li><li>Grikscheit, T. C., Siddique, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue-engineered+small+intestine+improves+recovery+after+massive+small+bowel+resection.">Tissue-engineered small intestine improves recovery after massive small bowel resection.</a> Ann. Surg. 240 (5), 748-754 (2004).</li><li>Sala, F. G., Matthews, J. A., Speer, A. L., Torashima, Y., Barthel, E. R., Grikscheit, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Multicellular+Approach+Forms+a+Significant+Amount+of+Tissue-Engineered+Small+Intestine+in+the+Mouse.">A Multicellular Approach Forms a Significant Amount of Tissue-Engineered Small Intestine in the Mouse.</a> Tissue Eng. Part A. , (2011).</li><li>Matthews, J. A., Sala, F. G., Speer, A. L., Warburton, D., Grikscheit, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=VEGF+optimizes+the+formation+of+tissue-engineered+small+intestine.">VEGF optimizes the formation of tissue-engineered small intestine.</a> Regen. Med. 6 (5), 559-567 (2011).</li><li>Chen, M. K., Badylak, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small+bowel+tissue+engineering+using+small+intestinal+submucosa+as+a+scaffold.">Small bowel tissue engineering using small intestinal submucosa as a scaffold.</a> J. Surg. Res. 99 (2), 352-358 (2001).</li><li>Wang, Z. Q., Watanabe, Y., Toki, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experimental+assessment+of+small+intestinal+submucosa+as+a+small+bowel+graft+in+a+rat+model.">Experimental assessment of small intestinal submucosa as a small bowel graft in a rat model.</a> J. Pediatr. Surg. 38 (11), 1596-1601 (2003).</li><li>Wang, Z. Q., Watanabe, Y., Noda, T., Yoshida, A., Oyama, T., Toki, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphologic+evaluation+of+regenerated+small+bowel+by+small+intestinal+submucosa.">Morphologic evaluation of regenerated small bowel by small intestinal submucosa.</a> J. Pediatr. Surg. 40 (12), 1898-1902 (2005).</li><li>Hori, Y., Nakamura, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experimental+study+on+tissue+engineering+of+the+small+intestine+by+mesenchymal+stem+cell+seeding.">Experimental study on tissue engineering of the small intestine by mesenchymal stem cell seeding.</a> J. Surg. Res. 102 (2), 156-160 (2002).</li><li>Gardner-Thorpe, J., Grikscheit, T. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Angiogenesis+in+tissue-engineered+small+intestine.">Angiogenesis in tissue-engineered small intestine.</a> Tissue Eng. 9 (6), 1255-1261 (2003).</li><li>Conconi, M. T., Coppi, P. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tracheal+matrices,+obtained+by+a+detergent-enzymatic+method,+support+in+vitro+the+adhesion+of+chondrocytes+and+tracheal+epithelial+cells.">Tracheal matrices, obtained by a detergent-enzymatic method, support in vitro the adhesion of chondrocytes and tracheal epithelial cells.</a> Transpl. Int. 18 (6), 727-734 (2005).</li><li>Ott, H. C., Matthiesen, T. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Perfusion-decellularized+matrix:+using+nature's+platform+to+engineer+a+bioartificial+heart.">Perfusion-decellularized matrix: using nature's platform to engineer a bioartificial heart.</a> Nat. Med. 14 (2), 213-221 (2008).</li><li>Uygun, B. E., Soto-Gutierrez, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organ+reengineering+through+development+of+a+transplantable+recellularized+liver+graft+using+decellularized+liver+matrix.">Organ reengineering through development of a transplantable recellularized liver graft using decellularized liver matrix.</a> Nat. Med. , 1-8 (2010).</li><li>Uygun, B. E., Price, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Decellularization+and+recellularization+of+whole+livers.">Decellularization and recellularization of whole livers.</a> J. Vis. Exp. (48), e2394 (2011).</li><li>Petersen, T. H., Calle, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue-Engineered+Lungs+for+in+Vivo+Implantation.">Tissue-Engineered Lungs for in Vivo Implantation.</a> Science. 329 (5991), 538-541 (2010).</li><li>Ott, H. C., Clippinger, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regeneration+and+orthotopic+transplantation+of+a+bioartificial+lung.">Regeneration and orthotopic transplantation of a bioartificial lung.</a> Nat. Med. 16 (8), 927-933 (2010).</li><li>Calle, E. A., Petersen, T. H., Niklason, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Procedure+for+lung+engineering.">Procedure for lung engineering.</a> J. Vis. Exp. (49), e2651 (2011).</li><li>Totonelli, G., Maghsoudlou, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rat+decellularized+small+bowel+scaffold+that+preserves+villus-crypt+architecture+for+intestinal+regeneration.">A rat decellularized small bowel scaffold that preserves villus-crypt architecture for intestinal regeneration.</a> Biomaterials. 33 (12), 3401-3410 (2012).</li><li>Sala, F. G., Kunisaki, S. M., Ochoa, E. R., Vacanti, J., Grikscheit, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue-engineered+small+intestine+and+stomach+form+from+autologous+tissue+in+a+preclinical+large+animal+model.">Tissue-engineered small intestine and stomach form from autologous tissue in a preclinical large animal model.</a> J. Surg. Res. 156 (2), 205-212 (2009).</li><li>Demirbilek, S., Kanmaz, T., Ozardali, I., Edali, M. N., Y&#252;cesan, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+porcine+small+intestinal+submucosa+in+intestinal+regeneration.">Using porcine small intestinal submucosa in intestinal regeneration.</a> Pediatr. Surg. Int. 19 (8), 588-592 (2003).</li></ol>

Ingen interessekonflikter erklært.

De vanskeligste skritt i å sette opp dette eksperimentet involvere cannulation av SMA og etablering og vedlikehold av sterilitet. Kanylerør SMA hos gnagere uten sprekker i veggen kan være ganske vanskelig på grunn av størrelsen og posisjonen til fartøyet. Alternativt kan en sutur skal plasseres rundt den proksimale aorta før SMA opprinnelse, etterfulgt av kanylering av aorta seg distalt, dirigere plast kanyle inn i SMA. Under decellularization en kombinasjon av dårlig kanyle plassering og høye strømningshastigheter kan føre til tap av vaskulær tilgang. Sterilitet er et stort problem på grunn av mengden av bakterieflora som er tilstede i tynntarmen. Vask med PBS / AA etter innhøsting er svært viktig, og må fjernes noen tegn til avføring eller rusk fra lumen. Ved å legge en del av stillaset på en falkonrør med DMEM i inkubatoren følgende UV-steriliseringen skal være en indikator om sterilitet er oppnådd. I tilfelletav bakteriell kolonisering, vil mediet endrer pH med sin farge dreie fra rød til gul. For å håndtere dette på, er ytterligere UV-sykluser rådet samt vasking med PBS inneholdende en høy konsentrasjon av antibiotisk / antimykotisk. En mulig modifikasjon å skaffe et stillas med både vaskulære og venetilgang vil være å cannulate inferior vena cava (IVC), så vel som den SMA. Decellularization fra venøse og vaskulære sider bør forsøkes i perioder for alle tre løsningene. Kontinuerlig decellularization kan sprenge blodkar ved å ha et positivt press på begge sider. Gjennom årene har det vært en rekke tiltak i tarm TE ved hjelp av ulike celle-stillas kombinasjoner in vitro og in vivo 6,9,12. Hoveddelen av arbeidet er utført ved hjelp av rørformede vevde 95% PGA-5% PLGA stillasene belagt med kollagen type I 6,7,13,22. Etter seeding med tarmepiteliale organoid enheter (OUS) og en periode av implantering i omentet hos mus, danner de cyster med muskel på utsiden og epitelet på innsiden som deretter kan tubularized. Imidlertid porøsiteten og enkelhet i utformingen av disse stillaser ikke tillater for generering av store stykker av kunstig tarmen i en in vitro miljø som den om en bioreaktor. I tillegg begrenser mangelen på en medfødt vaskulære nettverk som kan kobles til mottakeren videre bruken av dette stillas for klinisk oversettelse. Foruten de eksperimenter med PGA-PLGA stillasene, har andre grupper brukte kollagen eller SIS stillasene, som begge ikke gjenskape det detaljtarmkanalen. SIS spesielt er den eneste tidligere publiserte metode av tarmvevet teknikk og har vært benyttet i mer enn 150 medisinske innstillinger, som viser evnen til decellularized stillaser for å gi mekanisk stabilitet og fremme cellevekst, mens blying til ingen immunogene respons. Men mangelen på egnede makro-og mikro-arkitektur, har ført til dårlige resultater i sin &#39;bruk for tarm TE formål 9-11,23. Fordelene med decellularization metodikk vi har beskrevet inkludere bevaring av mikroskopiske egenskaper som luminal krypten-villus arkitektur som representerer et passende miljø for repopulation av tarmstamcelle nisje. I den makroskopiske aspekt, vil tilstedeværelsen av en hierarkisk vaskulære nettverk muliggjøre befestigelse til mottakeren, slik at bestemmelsen av næringsstoffer og oksygen til alle lag av TE-tarmen 21. Hva mer er, har opprettholdelse av ECM-komponenter slik som kollagen, elastin og glyocosaminoglycans en viktig rolle, ikke bare for mekaniske egenskaper, men også å dirigere cellulær proliferasjon og differensiering. Det viktigste er muligheten av decellularization metodikk for å bli skalert opp til storr vev samtidig opprettholde de samme egenskapene er en viktig funksjon for klinisk oversettelse av TE. Utviklingen av en naturlig tarm matrise med et vaskulære nettverket tillater etablering av større deler av kunstig tarm som kan kobles til verten.

Tissue engineering (TE) gir et terapeutisk alternativ til organtransplantasjon, omgåelsen saker av immunsuppresjon og organmangel. TE har nylig hatt vellykkede søknader i klinikken, med utskifting av organer som blære 1, urinrør 2 og luftrør, både hos voksne 3,4 og barn 5. Bygge en vev-konstruert organ nødvendig kombinasjonen av et stillas med de riktige cellene. Et stillas, kan fremstilles ved hjelp av naturlig-avledet (f.eks kollagen) og syntetiske (for eksempel poly-L-glykolsyre; PLGA) materialer, eller kan oppnås ved decellularization native organer og vev. Stillas som har vært brukt hittil for intestinal TE har hovedsakelig vært enten decellularized (small intestinal submucosa) eller syntetiske (poly-L-glykolsyre og poly-melkesyre) 6-13. Disse biomaterialer er svært enkle i både makro-og mikro-arkitektur, somkan ikke være ideelt hvis vev-konstruert tarmen er å være klinisk oversatt. En optimal biomateriale for tarmen bør ha en medfødt vaskulære treet som kan kobles til vertens blodtilførsel, et lagdelt rørveggen med ulike egenskaper for å reflektere de lag av tarmveggen og villus-krypt aksen på luminale side for å hjelpe til med repopulation av epitel stamceller. Decellularization er en roman metodikk som produserer stillaser ved å fjerne celler fra hele organer samtidig opprettholde sin opprinnelige arkitektur 14. Dette er å foretrekke fremfor eksisterende stillaser, siden de ikke bare replikere strukturen av organet, men også inneholder kjemiske signaler integrert i den ekstracellulære matriks (ECM) som kan benyttes til cellulær proliferasjon og differensiering. I 2008 en avdød luftrøret ble decellularized 14, sådd med pasientens egne celler, og transplantert til å erstatte de viktigste venstre bronkie i en ung mann <sup&gt; 3. Siden da har en rekke grupper rapportert produksjon av decellularized stillaser for hjertet 15, lever 16,17, og lunge 18-20 i små og store dyr. Vi har også tilpasset den samme metode for å produsere et tynntarm decellularized stillaset 21.. Målet med fremgangsmåten beskrevet heri er å produsere decellularized tarm matriser som opprettholder de makroskopiske egenskaper av det opprinnelige vev slik som blodforsyning, så vel som den mikroskopiske arkitekturen på villus-krypten akse i tarmlumen. Vi tror denne metoden kan til slutt bli vedtatt for andre organer for å forbedre effektiviteten i decellularization.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Name of Material</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol solution, 70% in H20</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>02877</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline tablets</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>79382</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotic Antimycotic Solution (100x)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A5955</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium deoxycholate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D6750</td>
			<td>Oral and eye irritant; use protection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deoxyribonuclease I from bovine pancreas</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D5025</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a decellularization methodology for the production of a natural acellular intestinal matrix

Vellykket tissue teknikk involverer kombinasjonen av stillaser med egnede celler in vitro eller in vivo. Stillas kan være syntetisk, naturlig-avledet eller avledet fra vev / organer. Det sistnevnte blir oppnådd ved bruk av en teknikk som kalles decellularization. Decellularization kan innebære en kombinasjon av fysiske, kjemiske og enzymatiske metoder. Målet med denne teknikken er å fjerne alle mobiltelefon spor samtidig opprettholde den makro-og mikro-arkitektur av den opprinnelige vev. Intestinal tissue engineering har så langt brukt relativt enkle stillaser som ikke gjenskape den komplekse arkitekturen av de innfødte organ. Fokuset i denne artikkelen er å beskrive en effektiv decellularization teknikk for rotte tynntarmen. Isoleringen av tynntarmen, for å sikre opprettholdelsen av en vaskulær forbindelsen er beskrevet. Den kombinasjon av kjemiske og enzymatiske løsninger for å fjerne cellene whilst bevare villus-krypten aksen i luminal aspektet av stillaset er også satt ut. Til slutt, er vurderingen av produsert stillaser for egnede egenskaper diskutert.

Etter vellykket decellularization (figur 1), bør stillaset har en makroskopisk utseende som ligner på den ene av de innfødte tarmen, men med gjennomskinnelige vegger (figur 2A). Bevaringen av makro arkitektur bør også være tydelig av åpenheten til det vaskulære tre. Når fargestoff injiseres gjennom kanylen SMA, bør det fordele jevnt i hele stillaset og når kapillær treet (figur 2B). Stillaset skal være fri for kjernefysiske og cytoplasmatisk materiale, noe som kan vurderes ved hjelp av en DNA kvantifisering kit og enkel histologisk analyse. Hematoxylin og eosin farging (H &amp; E) skal demonstrere et fravær av kjernekraft og cytoplasmatisk materialet samtidig bevare de små tarm lag (figur 3A). Spesielt bør vedlikehold av villi og krypter på luminale side være tydelig etter scanning elektronmikroskopi (figur 4). Abevaring av ekstracellulære matriks-komponenter slik som kollagen, elastin og glykosaminoglykaner bør også være forventet. For eksempel, Masson er Trikrom flekker viser intakt bindevev i stillaset (Figur 3B). <img alt="Figur 1" fo:content-width="6.5in" src="/files/ftp_upload/50658/50658fig1.jpg" width="600px" /> Figur 1. . Eksperimentell plan Tidslinje av decellularization prosedyre, PBS / AA: fosfat saltvann med antibiotika-antimycotic, NaDeoxy: Sodium deoxycholate, RT: romtemperatur, DNAse-I: deoxyribonuclease-I. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/50658/50658fig1highres.jpg" target="_blank">Klikk her for å se større bilde</a> . <img alt="Fig. 2" fo:content-width="6.5in" src="/files/ftp_upload/50658/50658fig2.jpg" width="600px" /> Figur 2. Stillas macroscopic karakteristikker. Makroskopisk utseende av rotte tynntarmen etter vellykket decellularization (A). Injeksjon av Rosso Ponceau fargestoff gjennom SMA demonstrerer en intakt vaskulære nettverk (B), SMA: overlegen mesenteric arterie <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/50658/50658fig2highres.jpg" target="_blank">Klikk her for å se større bilde</a> . <img alt="Figur 3" fo:content-width="6.5in" src="/files/ftp_upload/50658/50658fig3.jpg" width="600px" /> Figur 3. . Histologi H &amp; E (A) og MT (B) flekker indikerer et fravær av cellemateriale med bevaring av bindevev arkitektur, H &amp; E: hematoxylin og eosin, MT: Masson sin Trikrom. Målestokk:. 100 mikrometer <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/50658/50658fig3highres.jpg" target="_blank">Klikk her for å se større bilde</a> . </p&gt; <img alt="Figur 4" fo:content-width="6.5in" src="/files/ftp_upload/50658/50658fig4.jpg" width="600px" /> Figur 4. . Elektronmikroskopi Scanning elektronmikros indikerer bevart villus-krypten arkitektur i stillaset lumen; Målestokk:. 100 mikrometer <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/50658/50658fig4highres.jpg" target="_blank">Klikk her for å se større bilde</a> .

Watch this Scientific Journal Video about A Decellularization Methodology for the Production of a Natural Acellular Intestinal Matrix at JoVE.com

A Decellularization Methodology for the Production of a Natural Acellular Intestinal Matrix

Artikkelen beskriver en metode for produksjon av en acellulær matriks fra rotte tarm. Avledning av tarm stillaser er viktig for fremtidige anvendelser innen tissue engineering, stamcellebiologi og narkotika testing.

En Decellularization metodikk for produksjon av en Natural acellulære Intestinal Matrix

Successful tissue engineering involves the  combination of scaffolds with appropriate cells in vitro or in vivo.  Scaffolds may be synthetic, ...

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Decellularization and Recellularization of Whole Livers

The liver is a complex organ which requires constant perfusion for delivery of nutrients and oxygen and removal of waste in order to survive1. Efforts to ...

Synthetic Spider Silk Production on a Laboratory Scale

Syntetisk Spider Silk Produksjonen på en laboratorieskala

As society progresses and resources become scarcer, it is becoming increasingly important to cultivate new technologies that engineer next generation ...

Co-culture of Living Microbiome with Microengineered Human Intestinal Villi in a Gut-on-a-Chip Microfluidic Device

Co-kultur of Living mikrobiomer med mikro-oppbygd Menneskelig tarmtotter i en Gut-on-a-Chip mikrofluid Device

Here, we describe a protocol to perform long-term co-culture of multi-species human gut microbiome with microengineered intestinal villi in a human ...

Tunable Hydrogels from Pulmonary Extracellular Matrix for 3D Cell Culture

Fleksibel Hydrogeler fra Lunge ekstracellulær matriks for 3D Cell Culture

Here we present a method for establishing multiple component cell culture hydrogels for in vitro lung cell culture. Beginning with healthy en bloc lung ...

Decellularization and Recellularization Methodology for Human Saphenous Veins

Decellularization og Recellularization metoder for menneskelig Saphenous årer

Vascular conduits used during most vascular surgeries are allogeneic or synthetic grafts that often lead to complications caused by immunosuppression and ...

Decellularization of Whole Human Heart Inside a Pressurized Pouch in an Inverted Orientation

Decellularization av hele hjerte inne i en trykksatt pose i en omvendt retning

The ultimate solution for patients with end-stage heart failure is organ transplant. But donor hearts are limited, immunosuppression is required, and ...

Isolation and Decellularization of a Whole Porcine Pancreas

Isolasjon og Decellularization av en helt svin bukspyttkjertelen

Tissue engineering of the whole pancreas can improve current treatments for diabetes mellitus. The ultimate goal is to tissue engineer pancreas from an ...

Fabricating a Kidney Cortex Extracellular Matrix-Derived Hydrogel

Fabrikere en nyre Cortex ekstracellulær Matrix-avledet Hydrogel

Extracellular matrix (ECM) provides important biophysical and biochemical cues to maintain tissue homeostasis. Current synthetic hydrogels offer robust ...

A Human 3D Extracellular Matrix-Adipocyte Culture Model for Studying Matrix-Cell Metabolic Crosstalk

A Human 3D ekstracellulære Matrix-Adipocyte kultur modell for å studere Matrix-Cell metabolsk crosstalk

The extracellular matrix (ECM) plays a central role in regulating tissue homeostasis, engaging in crosstalk with cells and regulating multiple aspects of ...

A Quantitative Fluorescence Microscopy-based Single Liposome Assay for Detecting the Compositional Inhomogeneity Between Individual Liposomes

En kvantitativ fluorescens mikroskopi-basert enkelt liposome-analyse for registrering av Inhomogeneity mellom individuelle liposomer

Most research employing liposomes as membrane model systems or drug delivery carriers relies on bulk read-out techniques and thus intrinsically assumes ...