Name: antibody staining in c. elegans using &quot;freeze-cracking&quot;
Uploaded: 2013-10-14T21:15:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Antibody Staining in C. Elegans Using "Freeze-Cracking" at JoVE.com

Finansieringen blev leveret af NSF CCLIs # 0633618 og Ohio University. Nogle stammer blev leveret af Caenorhabditis Genetik Center. Kandidatstuderende Reetobrata Basu vises i videoen.

BEMÆRK: Flere protokoltrin er præsenteret med muligheder for opsætning og forberedelse, afhængigt af de særlige betingelser for eksperimentet. For disse tilfælde er alternative skridt præsenteret som A, B, C, osv. protokol med alternative trin er skitseret i figur 1. 1.. Udarbejdelse af Polylysin Coated Slides Tre forskellige typer af dias kan anvendes afhængigt af den ønskede afvejning mellem let fremstilling, relative adhæsion ...

<ol>
	<li>Harlow, E., Lane, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Antibodies: A Laboratory Manual. , (1988).</li><li>Mello, C., Fire, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+Transformation.">DNA Transformation.</a> Methods Cell Biol. 48, 451-482 (1995).</li><li>Boulin, T., Etchberger, J. F., Hobert, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reporter+gene+fusions.">Reporter gene fusions.</a> WormBook. , (2006).</li><li>Duerr, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunohistochemistry.">Immunohistochemistry.</a> WormBook. , (2006).</li><li>Finney, M., Ruvkun, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+unc-86+gene+product+couples+cell+lineage+and+cell+identity+in+C.+elegans.">The unc-86 gene product couples cell lineage and cell identity in C. elegans.</a> Cell. 63, 895-905 (1990).</li><li>Garriga, G., Desai, C., Horvitz, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+interactions+control+the+direction+of+outgrowth,+branching+and+fasciculation+of+the+HSN+axons+of+Caenorhabditis+elegans.">Cell interactions control the direction of outgrowth, branching and fasciculation of the HSN axons of Caenorhabditis elegans.</a> Development. 117, 1071-1087 (1993).</li><li>Miller, D. M., Shakes, D. C., Epstein, H. F., Shakes, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunofluorescence+microscopy.">Immunofluorescence microscopy.</a> Caenorhabditis elegans: Modern Biological Analysis of an Organism. , 365-394 (1995).</li><li>Crittenden, S. L., Troemel, E. R., Evans, T. C., Kimble, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GLP-1+is+localized+to+the+mitotic+region+of+the+C.+elegans+germ+line.">GLP-1 is localized to the mitotic region of the C. elegans germ line.</a> Development. 120, 2901-2911 (1994).</li><li>Strome, S., Wood, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunofluorescence+visualization+of+germ-line-specific+cytoplasmic+granules+in+embryos,+larvae,+and+adults+of+Caenorhabditis+elegans.">Immunofluorescence visualization of germ-line-specific cytoplasmic granules in embryos, larvae, and adults of Caenorhabditis elegans.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 79, 1558-1562 (1982).</li><li>Albertson, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Formation+of+the+first+cleavage+spindle+in+nematode+embryos.">Formation of the first cleavage spindle in nematode embryos.</a> Dev. Biol. 101, 61-72 (1984).</li><li>Harlow, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Using Antibodies: A Laboratory Manual. , (1999).</li><li>Ahringer, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reverse+Genetics.">Reverse Genetics.</a> WormBook. , (2006).</li></ol>

Fryse-krakning protokol er en af flere metoder til antistoffarvning i C. elegans. Det giver en forholdsvis enkel måde at plette orme, men kræver specifikke reagenser og praksis for optimale resultater. Kritiske trin (beskrevet i figur 1) omfatter: 1) præparatglaspræpareringsprotokol (se trin 1 og 2) manuel kompression af nematoder (se trin 2 og 3) hurtig fiksering (se trin 3). Først, for at maksimere vedhæftningen af ​​nematoder til dias, er det bedst at forberede dias med høj moleky...

For at bestemme den cellulære og subcellulære lokalisering af proteiner, har forskerne traditionelt mærkede væv med antistoffer udvalgt til specifikt at genkende bestemte proteiner 1. I nogle modelorganismer såsom C. elegans har antistoffarvning ofte blevet erstattet af molekylærgenetiske teknikker, der giver resultater hurtigere. Heriblandt transformerende organismer med konstruktioner der består af genfusioner mellem promotoren og kodende regioner af genet af interesse og grønt fluorescerende protein. Men molekylære teknikker er underlagt en række af artefakter, herunder problemer med at kende den sande promotor og ændringer i ekspression af konstruktioner ved høje kopital (de sædvanlige teknikker i C. elegans) 2,3. Derfor farvning med antistoffer er fortsat et mål for mange forskere studerer protein funktion in vivo. Farvning væv med antistoffer kan være vanskelig, idet entibodies kan kun anerkende deres antigen i en bestemt kropsbygning 1. For eksempel kan antistoffer genkender kun denatureres eller intakt antigen fast på en bestemt måde, og kan ikke genkende antigenet in situ. Problemet med antistoffarvning i nematoder forværres af det faktum, at cuticula nematoden danner en relativt uigennemtrængelig barriere, blokerer adgangen af ​​antistoffer til væv. Der er flere forskellige metoder til antistoffarvning i C. elegans (revideret i vores tidligere arbejde 4). At plette intakte &#39;orme&#39; blev metoder udviklet til at fryse og tø i en forholdsvis hård fiksativ (formaldehyd eller glutaraldehyd), de fryse-tø cykler med til at knække neglebånd at tillade hurtig penetration af fiksativet 5.. Efter fiksering blev kutikula permeabiliseret til at tillade indtrængning af antistoffet, metoder indgår behandling med reduktionsmidler, collagenase eller begge 5-7. Disse treatments bevarede morfologi, men ofte nedsat eller ødelagt antistof anerkendelse. Alternative fremgangsmåder indbefatter dissektion 8 for at tillade antistof penetration. &quot;Freeze-krakning&quot; er en måde at få adgang til det indre af den semi-intakte orm at tillade antistof farvning 9-10. Fryse-revnedannelse kan udføres med en bred vifte af fikseringen betingelser samtidig undgå collagenase og reduktion behandlinger. Nematoderne placeret mellem to klæbende slides, frosset, og derefter glider adskilles, således at de fleste af nematoden på bunden slide og meget af kutikula på tværslæde. Den nederste side kan være placeret i fiksativ og hele objektglasset med adhærerede nematoder overføres gennem antistoffarvning procedure. Metoden gør nuværende to store vanskeligheder. Det første er det vanskeligt at anvende den korrekte mængde pres nødvendigt at opdele de nematoder uden alvorligt at deformere dem. For det andet er mange af de orme vil ikke skryds til enten dias, og vil blive tabt i fiksativ eller skylninger. Men med den korrekte dias og praksis er det vil hurtigt give nematoder med rimelig morfologi, som kan anvendes med en bred vifte af fikseringsmidler og antistoffer. Fremgangsmåden kan varieres en smule, afhængigt af mål eksperimentatoren. Hvis der ønskes farvning af enkelte nematoder (fx til at afgøre, om en enkelt transformant har ændret antistoffarvning), og derefter glider med maksimal friktion (men højere baggrundsfarvning) kan anvendes, såsom laboratorie-forberedt dias med ekstra polylysin (se nedenfor). For formaldehyd eller glutaraldehyd fiksering, bør anvendes højere vedhæftning slides (laboratorie-forberedt polylysin slides), da nematoder holde mere dårligt på polylysin efter disse optagelser. Hvis vildtype-nematoder fastsættes med methanol og / eller acetone, så glider med lavere vedhæftning og lavere baggrundsfarvning bør anvendes (kommerciel eller laboratory forberedte slides). Hvis en række antistoffer og fikseringsmidler bliver brugt i laboratoriet, kan et udvalg af objektglas fremstilles i forvejen og opbevares indtil brug. Efter adgang til nematode væv er opnået, antistof farvningsprocedurer følge standardmetoder (med længere inkubationer karakteristiske af væv snarere end celler 1,11).

<table border="1">
		<tbody>
		 <tr>
			<td>Name of Reagent/Material</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>poly-L-lysine slide (ESCO brand)</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>12-545-78</td>
			<td>Sigma brand slides also suitable</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>poly-L-lysine hydrobromide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P1524</td>
			<td>IMPORTANT: Brand and high molecular weight of polylysine critical</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>single frosted edge slides</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>48312-002</td>
			<td>Other brands are suitable</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>sodium azide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S2002-25G</td>
			<td>TOXIC, wear gloves and mask while weighing out powder to make 10% stock. Wear gloves when pipeting stock solution</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>coplin staining jar</td>
			<td>VWR</td>
			<td>47751-792</td>
			<td>Other brands are suitable</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>5-slide mailer</td>
			<td>Electron Microscopy Science</td>
			<td>71549-01</td>
			<td>One of many different brands of small slide holder, suitable for staining</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>VWR</td>
			<td>MK262159</td>
			<td>IMPORTANT: Regular formalin solutions (37% formaldehyde) are NOT suitable. Either 1) Dissolve crysatlaline paraformaldehyde in phosphate buffer and store in small aliquots frozen. Or 2) buy electron microscopy grade paraformaldehyde in aliquots. TOXIC -wear gloves; dispose of excess down sink with water.</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Glutaraldehyde solution, 25% in water</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G 5882</td>
			<td>IMPORTANT: purchase electron microscopy grade glutaraldehyde in ampules; TOXIC -wear gloves; dispose of excess down sink with water.</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>VWR</td>
			<td>EM-9410</td>
			<td>Other brands are suitable</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>ICN820451</td>
			<td>Other brands are suitable</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Donkey Serum, lyophilized</td>
			<td>Jackson Immunoresearch</td>
			<td>017-000-121</td>
			<td>Other brands are suitable</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Cy3 Donkey anti-Mouse IgG multi-labeling</td>
			<td>Jackson Immunoresearch</td>
			<td>715-165-150</td>
			<td>This company is recommended for high quality multi-label (affinity depleted) antibodies. Select appropriate dye and antigen (animal used to raise primary antibody). </td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>n-propyl gallate</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>ICN10274750</td>
			<td>Other brands are suitable</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>DAPI, 4',6'-diamidino-2-phenylindole dihydrochloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D 9542</td>
			<td>TOXIC. Wear gloves and dispense into small aliquots and feeze to minimize exposure</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Whatman #1 15 cm diameter filters</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>09805G</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Coverslip #1 1/2 rectangle 24 x 60 mm</td>
			<td>VWR</td>
			<td>48393-252</td>
			<td>#1 1/2 thickness is optically best</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Microscope slide folder</td>
			<td>VWR</td>
			<td>48429-092</td>
			<td>Other brands are suitable</td>
		 </tr>
		</tbody>
 </table>

antibody staining in c. elegans using &quot;freeze-cracking&quot;

At farve C. elegans med antistoffer, skal den relativt uigennemtrængelige neglebånd blive omgået ved kemiske eller mekaniske metoder. &quot;Freeze-cracking&quot; er en metode, der anvendes til fysisk at trække neglebånd fra nematoder ved at komprimere nematoder mellem to vedhængende dias, frysning dem, og trække dias fra hinanden. Fryse-krakning giver en enkel og hurtig måde at få adgang til vævet uden kemisk behandling og kan anvendes med en række af fikseringsmidler. Men det fører til tab af mange af de prøver og den nødvendige kompression mekanisk fordrejer prøven. Praksis er nødvendig for at maksimere genvinding af prøver med god morfologi. Fryse-revnedannelse kan optimeres til specifikke fikseringen forhold, genvinding af prøver eller lav ikke-specifik farvning, men ikke for alle parametre på en gang. For antistoffer, der kræver meget hårde fikseringen forhold og tolerere de kemiske behandlinger er nødvendige for at kemisk permeabilisere neglebånd, behandlit intakte nematoder i opløsning kan være foretrukket. Hvis antistoffet kræver en lysere fix eller hvis de optimale fikseringen betingelser er ukendt, fryse-krakning giver en meget nyttig måde til hurtigt at analysere antistoffet og kan give specifikke subcellulære og cellulære lokalisering information for antigenet af interesse.

Når orme er korrekt komprimerede, revnet, og let fast, kan næsten hele ormen være tilgængelig for antistof-farvning (se figur 2). Placeringen af ​​kerner som angivet ved DAPI-farvning viser, hvilke dele af ormen er intakte, når ormene udsættes for en hårdere fiksativ, såsom formaldehyd, kan morfologi ormen blive forvrænget (set fra unaturligt bølget udseende muskler i 3A-D). Et andet fælles problem er ujævn fiksering eller indtrængen af ​​bestemte væv. Et eksempel ...

Watch this Scientific Journal Video about Antibody Staining in C. Elegans Using "Freeze-Cracking" at JoVE.com

Antibody Staining in C. Elegans Using "Freeze-Cracking"

Antistoffarvning i<em&gt; C. Elegans</em&gt; Brug af &quot;Freeze-Cracking&quot;

&quot;Freeze-cracking&quot;, en metode til at afsløre de indre væv af rundorm C. elegans til antistoffer til protein lokalisering, demonstreres.

To stain C.  elegans with antibodies, the relatively impermeable cuticle must be  bypassed by chemical or mechanical methods.  "Freeze-cracking" is one ...

Research

JoVE Journal

Biology

Antibody Staining in C. Elegans Using &quot;Freeze-Cracking&quot;

Generation of Stable Transgenic C. elegans Using Microinjection

Transgenic Caenorhabditis elegans can be readily created via microinjection of a DNA plasmid solution into the gonad 1.  The plasmid DNA rearranges to ...

Method for Whole Mount Antibody Staining in Chick

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ...

Generation of Transgenic C. elegans by Biolistic Transformation

Generation of Transgenic C. elegans by Biolistic Transformation

The number of laboratories using the free living nematode C. elegans is rapidly growing. The popularity of this biological model is attributed to a rapid ...

Imaging C. elegans Embryos using an Epifluorescent Microscope and Open Source Software

Imaging C. elegans Embryos using an Epifluorescent Microscope and Open Source Software

Cellular processes, such as chromosome assembly, segregation and cytokinesis,are inherently dynamic. Time-lapse imaging of living cells, using ...

Determining Genetic Expression Profiles in C. elegans Using Microarray and Real-time PCR

Determining Genetic Expression Profiles in C. elegans Using Microarray and Real-time PCR

Synapses are composed of a presynaptic active zone in the signaling cell and a postsynaptic terminal in the target cell. In the case of chemical synapses, ...

RNAi Screening to Identify Postembryonic Phenotypes in C. elegans

RNAi Screening to Identify Postembryonic Phenotypes in C. elegans

RNAi screening for at identificere Postembryonic fænotyper i C. elegans</em

C. elegans has proven to be a valuable model system for the discovery and functional characterization of many genes and gene pathways1. More sophisticated ...

C. elegans Chemotaxis Assay

C. elegans Chemotaxis Assay

C. elegans Kemotaksi Assay

Many organisms use chemotaxis to seek out food sources, avoid noxious substances, and find mates.  Caenorhabditis elegans has impressive chemotaxis ...

An Anoxia-starvation Model for Ischemia/Reperfusion in C. elegans

An Anoxia-starvation Model for Ischemia/Reperfusion in C. elegans

En Anoxia-sult Model for iskæmi / reperfusion i<em&gt; C. elegans</em

Protocols for anoxia/starvation in the genetic model organism C. elegans simulate ischemia/reperfusion. Worms are separated from bacterial food and placed ...

Methods for Skin Wounding and Assays for Wound Responses in C. elegans

Methods for Skin Wounding and Assays for Wound Responses in C. elegans

Metoder til Hud sårbarhed og Analyser for Wound Svar i<em&gt; C. elegans</em

The C. elegans epidermis and cuticle form a simple yet sophisticated skin layer that can repair localized damage resulting from wounding. Studies of wound ...

Methods to Assess Subcellular Compartments of Muscle in C. elegans

Methods to Assess Subcellular Compartments of Muscle in C. elegans

Metoder til at vurdere subcellulære afsnit af muskler i<em&gt; C. elegans</em

Muscle is a dynamic tissue that responds to changes in nutrition, exercise, and disease state. The loss of muscle mass and function with disease and age ...