Name: antibody staining in c. elegans using &quot;freeze-cracking&quot;
Uploaded: 2013-10-14T21:15:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Antibody Staining in C. Elegans Using "Freeze-Cracking" at JoVE.com

De financiering werd verstrekt door NSF CCLI # 0633618 en de Universiteit van Ohio. Sommige stammen werden geleverd door het Caenorhabditis Genetics Center. Afgestudeerde student Reetobrata Basu verschijnt in de video.

OPMERKING: Meerdere protocol stappen worden met opties voor de set-up en voorbereiding afhankelijk van de specifieke omstandigheden van het experiment. In deze gevallen worden alternatieve stappen voorgesteld als A, B, C, enz. Het protocol met alternatieve stappen is beschreven in figuur 1. 1. Voorbereiding van Polylysine gecoate glaasjes Drie verschillende soorten dia worden gebruikt, afhankelijk van het gewenste compromis tussen gemak va...

<ol>
	<li>Harlow, E., Lane, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Antibodies: A Laboratory Manual. , (1988).</li><li>Mello, C., Fire, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+Transformation.">DNA Transformation.</a> Methods Cell Biol. 48, 451-482 (1995).</li><li>Boulin, T., Etchberger, J. F., Hobert, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reporter+gene+fusions.">Reporter gene fusions.</a> WormBook. , (2006).</li><li>Duerr, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunohistochemistry.">Immunohistochemistry.</a> WormBook. , (2006).</li><li>Finney, M., Ruvkun, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+unc-86+gene+product+couples+cell+lineage+and+cell+identity+in+C.+elegans.">The unc-86 gene product couples cell lineage and cell identity in C. elegans.</a> Cell. 63, 895-905 (1990).</li><li>Garriga, G., Desai, C., Horvitz, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+interactions+control+the+direction+of+outgrowth,+branching+and+fasciculation+of+the+HSN+axons+of+Caenorhabditis+elegans.">Cell interactions control the direction of outgrowth, branching and fasciculation of the HSN axons of Caenorhabditis elegans.</a> Development. 117, 1071-1087 (1993).</li><li>Miller, D. M., Shakes, D. C., Epstein, H. F., Shakes, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunofluorescence+microscopy.">Immunofluorescence microscopy.</a> Caenorhabditis elegans: Modern Biological Analysis of an Organism. , 365-394 (1995).</li><li>Crittenden, S. L., Troemel, E. R., Evans, T. C., Kimble, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GLP-1+is+localized+to+the+mitotic+region+of+the+C.+elegans+germ+line.">GLP-1 is localized to the mitotic region of the C. elegans germ line.</a> Development. 120, 2901-2911 (1994).</li><li>Strome, S., Wood, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunofluorescence+visualization+of+germ-line-specific+cytoplasmic+granules+in+embryos,+larvae,+and+adults+of+Caenorhabditis+elegans.">Immunofluorescence visualization of germ-line-specific cytoplasmic granules in embryos, larvae, and adults of Caenorhabditis elegans.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 79, 1558-1562 (1982).</li><li>Albertson, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Formation+of+the+first+cleavage+spindle+in+nematode+embryos.">Formation of the first cleavage spindle in nematode embryos.</a> Dev. Biol. 101, 61-72 (1984).</li><li>Harlow, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Using Antibodies: A Laboratory Manual. , (1999).</li><li>Ahringer, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reverse+Genetics.">Reverse Genetics.</a> WormBook. , (2006).</li></ol>

De gevries kraken protocol is een van de manieren voor antilichaamkleuring in C. elegans. Het biedt een relatief eenvoudige manier om wormen te kleuren, maar vereist specifieke reagentia en de praktijk voor een optimaal resultaat. Kritische stappen (geschetst in figuur 1) zijn: 1) de voorbereiding glijbaan (zie stap 1 en 2) manuele compressie van de nematoden (zie stap 2 en 3) snelle fixatie (zie stap 3). Ten eerste, om de hechting van de nematoden op de dia maximaliseren, is het het beste om d...

Om de cellulaire en subcellulaire lokalisatie van eiwitten te bepalen, hebben wetenschappers traditioneel gemerkte weefsels met antilichamen geselecteerd om specifiek bepaalde eiwitten herkent 1. In sommige model organismen zoals C. elegans, antilichaam kleuring is vaak vervangen door moleculaire genetische technieken, die sneller resultaten opleveren. Deze omvatten transformeren organismen constructen bestaande uit genfusies tussen de promoter en coderende regio van het gen van interesse en groen fluorescerend proteïne. Echter, moleculaire technieken zijn onderhevig aan een aantal voorwerpen, waaronder problemen met het kennen van de ware promotor en veranderingen in expressie van de constructen een groot aantal kopieën (gebruikelijke technieken in C. elegans) 2,3. Daarom kleuring met antilichamen blijft een doel voor veel wetenschappers bestuderen eiwit functie in vivo. Kleuring weefsels met antilichamen kan moeilijk zijn, omdat eentibodies mogen alleen hun antigeen herkennen in een bepaalde conformatie 1. Bijvoorbeeld kunnen antilichamen alleen gedenatureerde of intacte antigeen vast op een bepaalde manier herkennen en het antigeen in situ niet herkennen. Het probleem van antilichaam kleuring in nematoden wordt verergerd door het feit dat de cuticula van de nematode vormt een betrekkelijk ondoordringbare barrière, toegang van antilichamen aan weefsels blokkeren. Er zijn verschillende methoden voor antilichaam kleuring in C. elegans (besproken in onze vorige werk 4). Intacte vlek &quot;wormen werden methoden ontwikkeld om bevriezen en ontdooien in een relatief hard fixeermiddel (formaldehyde of glutaaraldehyde), de vries-dooi cycli helpen de cuticula kraken snelle penetratie van het fixeermiddel 5 toestaan. Na fixatie werd de cuticula permeabel de penetratie van het antilichaam mogelijk te maken; methoden inbegrepen behandeling met reductiemiddelen, collagenase of beide 5-7. Deze treatments bewaard morfologie, maar vaak verminderd of vernietigd antilichaam herkenning. Alternatieve methoden omvatten dissectie 8 tot antilichaam penetratie mogelijk te maken. &quot;Freeze-kraken&quot; is een manier om toegang tot het inwendige van de semi-intacte worm krijgen zodat antilichaam kleuring 9-10. Freeze-kraken kan worden uitgevoerd met verschillende fixatie omstandigheden terwijl het vermijden collagenase en vermindering behandelingen. De nematoden worden geplaatst tussen twee kleefstoffen dia, bevroren, en de glijbanen zijn gescheiden, terwijl de meeste van de nematode aan de onderkant glijbaan en veel van de cuticula van de bovenste slede. De onderste dia kan in fixatief worden geplaatst en de gehele dia met gehandeld nematoden wordt overgedragen via de antilichaamkleuring procedure. De methode doet dit moment twee grote problemen. Ten eerste is het moeilijk om de juiste hoeveelheid druk nodig om de nematoden splitsen zonder serieus vervormen toepassen. Ook een in de wormen zal niet saankruisen om ofwel dia, en gaan verloren in de lijm of spoelingen. Echter, met de juiste glijbanen en praktijk de methode snel nematoden opleveren redelijke morfologie die kunnen worden gebruikt met een grote verscheidenheid van fixeermiddelen en antilichamen. De werkwijze kan enigszins variëren, afhankelijk van het doel van de experimentator. Indien kleuring van enkele nematoden gewenst (bijvoorbeeld om te bepalen of een transformant antilichaam kleuring is veranderd), dan schuift met maximale hechting (maar hogere achtergrondkleuring) kunnen worden gebruikt, zoals laboratorium bereide objectglaasjes met extra polylysine (zie hieronder). Voor formaldehyde of glutaaraldehyde fixatie, moeten hogere hechting slides (-laboratorium vervaardigde polylysine slides) worden gebruikt, omdat aaltjes zich meer slecht op polylysine na deze fixaties. Als wildtype nematoden worden gefixeerd met methanol en / of aceton, dan schuift met lagere hechting en lagere achtergrond kleuring worden gebruikt (commercieel of laboratory bereid dia). Indien verschillende antilichamen en fixeermiddelen worden gebruikt in het laboratorium, kan een selectie dia tevoren worden bereid en opgeslagen totdat ze nodig. Nadat is toegang gekregen tot de nematode weefsel, antilichaamkleuring procedures te volgen standaard methoden (met een langere incubaties kenmerk van weefsels in plaats van cellen 1,11).

<table border="1">
		<tbody>
		 <tr>
			<td>Name of Reagent/Material</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>poly-L-lysine slide (ESCO brand)</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>12-545-78</td>
			<td>Sigma brand slides also suitable</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>poly-L-lysine hydrobromide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P1524</td>
			<td>IMPORTANT: Brand and high molecular weight of polylysine critical</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>single frosted edge slides</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>48312-002</td>
			<td>Other brands are suitable</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>sodium azide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S2002-25G</td>
			<td>TOXIC, wear gloves and mask while weighing out powder to make 10% stock. Wear gloves when pipeting stock solution</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>coplin staining jar</td>
			<td>VWR</td>
			<td>47751-792</td>
			<td>Other brands are suitable</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>5-slide mailer</td>
			<td>Electron Microscopy Science</td>
			<td>71549-01</td>
			<td>One of many different brands of small slide holder, suitable for staining</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>VWR</td>
			<td>MK262159</td>
			<td>IMPORTANT: Regular formalin solutions (37% formaldehyde) are NOT suitable. Either 1) Dissolve crysatlaline paraformaldehyde in phosphate buffer and store in small aliquots frozen. Or 2) buy electron microscopy grade paraformaldehyde in aliquots. TOXIC -wear gloves; dispose of excess down sink with water.</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Glutaraldehyde solution, 25% in water</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G 5882</td>
			<td>IMPORTANT: purchase electron microscopy grade glutaraldehyde in ampules; TOXIC -wear gloves; dispose of excess down sink with water.</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>VWR</td>
			<td>EM-9410</td>
			<td>Other brands are suitable</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>ICN820451</td>
			<td>Other brands are suitable</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Donkey Serum, lyophilized</td>
			<td>Jackson Immunoresearch</td>
			<td>017-000-121</td>
			<td>Other brands are suitable</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Cy3 Donkey anti-Mouse IgG multi-labeling</td>
			<td>Jackson Immunoresearch</td>
			<td>715-165-150</td>
			<td>This company is recommended for high quality multi-label (affinity depleted) antibodies. Select appropriate dye and antigen (animal used to raise primary antibody). </td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>n-propyl gallate</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>ICN10274750</td>
			<td>Other brands are suitable</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>DAPI, 4',6'-diamidino-2-phenylindole dihydrochloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D 9542</td>
			<td>TOXIC. Wear gloves and dispense into small aliquots and feeze to minimize exposure</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Whatman #1 15 cm diameter filters</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>09805G</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Coverslip #1 1/2 rectangle 24 x 60 mm</td>
			<td>VWR</td>
			<td>48393-252</td>
			<td>#1 1/2 thickness is optically best</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Microscope slide folder</td>
			<td>VWR</td>
			<td>48429-092</td>
			<td>Other brands are suitable</td>
		 </tr>
		</tbody>
 </table>

antibody staining in c. elegans using &quot;freeze-cracking&quot;

Om C. vlek elegans met antilichamen, moet de doorlatende cuticula worden omzeild door chemische of mechanische methoden. &quot;Freeze-kraken&quot; is een methode die wordt gebruikt om fysiek trek de cuticula van nematoden door het comprimeren van nematoden tussen twee aanhangend dia&#39;s, ze in te vriezen, en de dia&#39;s uit elkaar te trekken. Freeze-kraken is een eenvoudige en snelle manier om toegang tot de weefsels krijgen zonder chemische behandeling en kan worden gebruikt met een verscheidenheid van fixeermiddelen. Dit leidt echter tot het verlies van veel van de monsters en de vereiste compressie mechanisch vervormt het monster. Praktijk is nodig om het herstel van de monsters met een goede morfologie maximaliseren. Freeze-kraken kan worden geoptimaliseerd voor specifieke fixatie voorwaarden terugwinning van monsters of lage niet-specifieke kleuring, maar niet voor alle parameters tegelijk. Voor antilichamen die zeer moeilijk fixatie omstandigheden dit vereisen en tolereren de chemische behandelingen nodig zijn om chemisch permeabiliseren de cuticula, treatment van intacte nematoden in oplossing de voorkeur. Wanneer het antilichaam is een lichtere oplossing of als de optimale fixatie voorwaarden bekend, vries-kraken levert een zeer nuttige manier om snel assay het antilichaam en kunnen specifieke subcellulaire en cellulaire lokalisatie informatie opleveren voor het antigeen van belang.

Wanneer wormen behoren worden gecomprimeerd, gebarsten, en licht vast kan vrijwel de gehele worm toegankelijk antilichaam kleuring (zie figuur 2). De locatie van de kernen zoals aangegeven door DAPI kleuring geeft aan welke delen van de worm intact Wanneer de wormen worden onderworpen aan een hardere fixeermiddel, zoals formaldehyde, kan de morfologie van de worm vervormen (zoals gezien door de onnatuurlijke golvende uiterlijk van de spieren in figuren 3A-D). Een ander veel voorkomend p...

Watch this Scientific Journal Video about Antibody Staining in C. Elegans Using "Freeze-Cracking" at JoVE.com

Antibody Staining in C. Elegans Using "Freeze-Cracking"

Antilichaamkleuring in<em&gt; C. Elegans</em&gt; Een &#39;Freeze-Cracking &quot;

&quot;Freeze-kraken,&quot; een werkwijze voor het blootstellen van de inwendige weefsels van de nematode C. elegans antilichamen voor eiwit lokalisatie, wordt aangetoond.

To stain C.  elegans with antibodies, the relatively impermeable cuticle must be  bypassed by chemical or mechanical methods.  "Freeze-cracking" is one ...

Research

JoVE Journal

Biology

Antibody Staining in C. Elegans Using &quot;Freeze-Cracking&quot;

Generation of Stable Transgenic C. elegans Using Microinjection

Generatie van Stable transgene C. elegans Met behulp van micro-injectie

Transgenic Caenorhabditis elegans can be readily created via microinjection of a DNA plasmid solution into the gonad 1.  The plasmid DNA rearranges to ...

Method for Whole Mount Antibody Staining in Chick

Methode voor Whole Mount antilichaam kleuring in Chick

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ...

Generation of Transgenic C. elegans by Biolistic Transformation

Generation of Transgenic C. elegans by Biolistic Transformation

Generatie van transgene C. elegans Door biolistische Transformatie

The number of laboratories using the free living nematode C. elegans is rapidly growing. The popularity of this biological model is attributed to a rapid ...

Imaging C. elegans Embryos using an Epifluorescent Microscope and Open Source Software

Imaging C. elegans Embryos using an Epifluorescent Microscope and Open Source Software

Imaging C. elegans Embryo&#39;s met behulp van een epifluorescerende Microscoop en Open Source Software

Cellular processes, such as chromosome assembly, segregation and cytokinesis,are inherently dynamic. Time-lapse imaging of living cells, using ...

Determining Genetic Expression Profiles in C. elegans Using Microarray and Real-time PCR

Determining Genetic Expression Profiles in C. elegans Using Microarray and Real-time PCR

Het bepalen van genetische expressie profielen in C. elegans Met behulp van microarray en real-time PCR

Synapses are composed of a presynaptic active zone in the signaling cell and a postsynaptic terminal in the target cell. In the case of chemical synapses, ...

RNAi Screening to Identify Postembryonic Phenotypes in C. elegans

RNAi Screening to Identify Postembryonic Phenotypes in C. elegans

RNAi screening Postembryonic fenotypes Leg in C. elegans</em

C. elegans has proven to be a valuable model system for the discovery and functional characterization of many genes and gene pathways1. More sophisticated ...

C. elegans Chemotaxis Assay

C. elegans Chemotaxis Assay

Many organisms use chemotaxis to seek out food sources, avoid noxious substances, and find mates.  Caenorhabditis elegans has impressive chemotaxis ...

An Anoxia-starvation Model for Ischemia/Reperfusion in C. elegans

An Anoxia-starvation Model for Ischemia/Reperfusion in C. elegans

Een Anoxia-verhongering Model voor ischemie / reperfusie in<em&gt; C. elegans</em

Protocols for anoxia/starvation in the genetic model organism C. elegans simulate ischemia/reperfusion. Worms are separated from bacterial food and placed ...

Methods for Skin Wounding and Assays for Wound Responses in C. elegans

Methods for Skin Wounding and Assays for Wound Responses in C. elegans

Methoden voor de huid De verwondingen en Testen voor Wond Reacties in<em&gt; C. elegans</em

The C. elegans epidermis and cuticle form a simple yet sophisticated skin layer that can repair localized damage resulting from wounding. Studies of wound ...

Methods to Assess Subcellular Compartments of Muscle in C. elegans

Methods to Assess Subcellular Compartments of Muscle in C. elegans

Methoden om subcellulaire compartimenten van Muscle beoordelen<em&gt; C. elegans</em

Muscle is a dynamic tissue that responds to changes in nutrition, exercise, and disease state. The loss of muscle mass and function with disease and age ...