Name: antibody staining in c. elegans using &quot;freeze-cracking&quot;
Uploaded: 2013-10-14T21:15:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Antibody Staining in C. Elegans Using "Freeze-Cracking" at JoVE.com

資金は、NSF CCLI番号0633618とオハイオ大学によって提供されました。いくつかの株は、線虫の遺伝学センターから提供された。大学院生Reetobrata Basuさんは、ビデオに表示されます。

注：複数のプロトコルステップは、実験の特定の条件に応じて、セットアップおよび準備のためのオプションが表示されます。このような場合、代替的なステップは、代替の工程を用いたプロトコルは、図1に概説されているA、B、C などとして提示される。 1。ポリリジンコートスライドの調製スライドを3つの異なる種類の製剤、?...

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	<li>Harlow, E., Lane, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Antibodies: A Laboratory Manual. , (1988).</li><li>Mello, C., Fire, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+Transformation.">DNA Transformation.</a> Methods Cell Biol. 48, 451-482 (1995).</li><li>Boulin, T., Etchberger, J. F., Hobert, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reporter+gene+fusions.">Reporter gene fusions.</a> WormBook. , (2006).</li><li>Duerr, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunohistochemistry.">Immunohistochemistry.</a> WormBook. , (2006).</li><li>Finney, M., Ruvkun, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+unc-86+gene+product+couples+cell+lineage+and+cell+identity+in+C.+elegans.">The unc-86 gene product couples cell lineage and cell identity in C. elegans.</a> Cell. 63, 895-905 (1990).</li><li>Garriga, G., Desai, C., Horvitz, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+interactions+control+the+direction+of+outgrowth,+branching+and+fasciculation+of+the+HSN+axons+of+Caenorhabditis+elegans.">Cell interactions control the direction of outgrowth, branching and fasciculation of the HSN axons of Caenorhabditis elegans.</a> Development. 117, 1071-1087 (1993).</li><li>Miller, D. M., Shakes, D. C., Epstein, H. F., Shakes, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunofluorescence+microscopy.">Immunofluorescence microscopy.</a> Caenorhabditis elegans: Modern Biological Analysis of an Organism. , 365-394 (1995).</li><li>Crittenden, S. L., Troemel, E. R., Evans, T. C., Kimble, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GLP-1+is+localized+to+the+mitotic+region+of+the+C.+elegans+germ+line.">GLP-1 is localized to the mitotic region of the C. elegans germ line.</a> Development. 120, 2901-2911 (1994).</li><li>Strome, S., Wood, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunofluorescence+visualization+of+germ-line-specific+cytoplasmic+granules+in+embryos,+larvae,+and+adults+of+Caenorhabditis+elegans.">Immunofluorescence visualization of germ-line-specific cytoplasmic granules in embryos, larvae, and adults of Caenorhabditis elegans.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 79, 1558-1562 (1982).</li><li>Albertson, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Formation+of+the+first+cleavage+spindle+in+nematode+embryos.">Formation of the first cleavage spindle in nematode embryos.</a> Dev. Biol. 101, 61-72 (1984).</li><li>Harlow, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Using Antibodies: A Laboratory Manual. , (1999).</li><li>Ahringer, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reverse+Genetics.">Reverse Genetics.</a> WormBook. , (2006).</li></ol>

凍結割れプロトコルは、Cの抗体染色のためのいくつかの方法の一つである虫。これは、ワームを染色するための比較的簡単な方法を提供していますが、最適な結果を得るための具体的な試薬と実践を必要としません。 （ 図1に概要）の重要なステップは、1）ステップ1と線虫の2）マニュアルの圧縮（ステップ2および3を参照のこと）迅速な固定をする（ステップ3）?...

タンパク質の細胞と細胞内局在を決定するために、科学者たちは、伝統的には特定のタンパク質1を認識するように選択された抗体を有する組織のラベルが付いています。 Cなどのいくつかのモデル生物でのエレガンス 、抗体染色は、多くの場合、より迅速に結果が得られた分子遺伝学的技術、により置換されている。これらは、プロモーターと関心と緑色蛍光タンパク質の遺伝子のコード領域の間の遺伝子の融合からなる構築物で形質転換する生物を含む。しかし、分子技術は、真のプロモーターと高コピー数（C. elegansの通常の技術） の2,3での構築物の発現の変化を知ることで問題を含むアーティファクトの数、対象となります。したがって、抗体を用いた染色は、生体内でのタンパク質の機能を研究する多くの科学者のための目標である。 抗体を用いて組織を染色することは、困難な場合がありますので、tibodiesは、特定の立体構造1にそれらの抗原を認識することができる。例えば、抗体は、特定の方法で修正されただけの変性または完全な抗原を認識することができるし、 その場で抗原を認識しない場合があります。線虫における抗体染色の問題は、線虫のクチクラは、組織への抗体のアクセスをブロックし、比較的不透過性のバリアを形成するという事実によって悪化する。 Cの抗体染色のために使用される、いくつかの異なる方法があります。 （私たちの以前の研究4に概説されている） 虫 。無傷で染色する「ワームを、「法は凍結し、比較的硬い固定液（ホルムアルデヒド、グルタルアルデヒド）で解凍するために開発された、凍結融解サイクルは、固定液5の急速な浸透を可能にするためにキューティクルをクラックするのに役立ちます。固定後、キューティクルは、抗体の浸透を可能にするために透過処理した;方法は、薬剤、コラゲナーゼ、またはその両方を低減5-7で処理することを含んでいた。これらのTreatmentsは、形態を保ったが、多くの場合、抗体認識を減少または破壊された。代替方法は、抗体の浸透を可能にするために解剖8が含まれています。 「凍結割れを「抗体染色9月10日を可能にするために半無傷のワームの内部へのアクセスを得るための一つの方法です。コラゲナーゼおよび還元処置を避けながら、凍結割れが固定の様々な条件で行うことができる。線虫は、2接着剤スライドの間に配置された凍結した後、スライドを分離し、下部のスライド上の線虫のほとんどは、トップスライド上のキューティクルの多くを残している。下部スライドは固定剤に配置することができ、付着した線虫を有するスライド全体を、抗体染色手順を介して転送される。この方法は、2つの主要な困難を提示しません。まず、真剣にそれらを変形させることなく、線虫を分割するのに必要な圧力の正確な量を適用することは困難である。第二に、ワームの多くはSではないでしょういずれかのスライドにチェックを入れて、固定液やリンスに失われます。しかし、適切なスライドと実践では、この方法は急速に固定剤および抗体は、多種多様で使用することができる合理的な形態を有する線虫を生じる。 この方法は、実験の目的に応じてわずかに変化させることができる。単一線虫の染色（ 例えば 、単一の形質転換体は、抗体染色を変化させたか否かを決定するために）所望される場合、最大の密着性と摺動する（しかし、より高いバックグラウンド染色）は、（下記参照）、このような余分なポリリジンを有する実験室で調製されたスライドを使用することができる。線虫がこれら注視後にポリリジンにもっと悪い付着するので、ホルムアルデヒドまたはグルタルアルデヒド固定のため、高い密着性スライド（実験室用意ポリリジンスライド）が、使用されるべきである。野生型線虫は、メタノールおよび/またはアセトンで固定されている場合は、下側の接着性と摺動し、低いバックグラウンド染色を用いるべきである（市販またはlaboratoryに準備スライド）。抗体および固定剤の種々の研究室で使用されている場合、必要​​になるまで、スライドの選択は、前もって調製し、保存することができる。 線虫の組織へのアクセスが獲得された後、抗体染色手順は、（より長いインキュベーション組織の特性よりもむしろ細胞1,11で）標準的な方法に従う。

<table border="1">
		<tbody>
		 <tr>
			<td>Name of Reagent/Material</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>poly-L-lysine slide (ESCO brand)</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>12-545-78</td>
			<td>Sigma brand slides also suitable</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>poly-L-lysine hydrobromide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P1524</td>
			<td>IMPORTANT: Brand and high molecular weight of polylysine critical</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>single frosted edge slides</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>48312-002</td>
			<td>Other brands are suitable</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>sodium azide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S2002-25G</td>
			<td>TOXIC, wear gloves and mask while weighing out powder to make 10% stock. Wear gloves when pipeting stock solution</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>coplin staining jar</td>
			<td>VWR</td>
			<td>47751-792</td>
			<td>Other brands are suitable</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>5-slide mailer</td>
			<td>Electron Microscopy Science</td>
			<td>71549-01</td>
			<td>One of many different brands of small slide holder, suitable for staining</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>VWR</td>
			<td>MK262159</td>
			<td>IMPORTANT: Regular formalin solutions (37% formaldehyde) are NOT suitable. Either 1) Dissolve crysatlaline paraformaldehyde in phosphate buffer and store in small aliquots frozen. Or 2) buy electron microscopy grade paraformaldehyde in aliquots. TOXIC -wear gloves; dispose of excess down sink with water.</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Glutaraldehyde solution, 25% in water</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G 5882</td>
			<td>IMPORTANT: purchase electron microscopy grade glutaraldehyde in ampules; TOXIC -wear gloves; dispose of excess down sink with water.</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>VWR</td>
			<td>EM-9410</td>
			<td>Other brands are suitable</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>ICN820451</td>
			<td>Other brands are suitable</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Donkey Serum, lyophilized</td>
			<td>Jackson Immunoresearch</td>
			<td>017-000-121</td>
			<td>Other brands are suitable</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Cy3 Donkey anti-Mouse IgG multi-labeling</td>
			<td>Jackson Immunoresearch</td>
			<td>715-165-150</td>
			<td>This company is recommended for high quality multi-label (affinity depleted) antibodies. Select appropriate dye and antigen (animal used to raise primary antibody). </td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>n-propyl gallate</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>ICN10274750</td>
			<td>Other brands are suitable</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>DAPI, 4',6'-diamidino-2-phenylindole dihydrochloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D 9542</td>
			<td>TOXIC. Wear gloves and dispense into small aliquots and feeze to minimize exposure</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Whatman #1 15 cm diameter filters</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>09805G</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Coverslip #1 1/2 rectangle 24 x 60 mm</td>
			<td>VWR</td>
			<td>48393-252</td>
			<td>#1 1/2 thickness is optically best</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Microscope slide folder</td>
			<td>VWR</td>
			<td>48429-092</td>
			<td>Other brands are suitable</td>
		 </tr>
		</tbody>
 </table>

antibody staining in c. elegans using &quot;freeze-cracking&quot;

C.を染色する抗体を用いた虫は 、比較的不透過性のキューティクルは、化学的または機械的な方法でバイパスする必要があります。 「凍結割れを「物理的に二つのスライド間の接着性の線虫を圧縮し、それらを凍結し、そして離れてスライドを引っ張ることにより線虫のクチクラをプルするために使用される一つの方法である。凍結割れは、化学処理をせずに、組織へのアクセスを獲得するための簡単​​かつ迅速な方法を提供し、様々な固定剤と共に使用することができる。しかしながら、標本の多くの損失をもたらし、必要な圧縮は、機械的にサンプルを歪める。実際には、良好な形態を有するサンプルの回収を最大化するために必要とされる。凍結割れは、特定の固定条件、​​サンプルの回収、または低非特異的染色のために最適ではなく、すべてのパラメータの一度にすることができます。非常に難しいの固定条件を必要とし、化学的にキューティクルを透過性にするために必要な化学処理を容認する抗体について、treatmen溶液中のインタクトな線虫のtが好ましい場合がある。抗体が必要な場合は軽量化の修正や最適な固定条件が不明である場合には、凍結割れが急速に抗体をアッセイすると、目的の抗原に特異的な細胞内および細胞内局在情報を得ることができる非常に便利な方法を提供します。

ワームが適切に圧縮ひび割れ、軽く固定した場合、事実上、全体のワームは、抗体染色がアクセスすることができます（ 図2を参照）。 DAPI染色によって示されるように、核の位置は、ワームの部分がワームをホルムアルデヒドなどの硬い固定液に供された場合の不自然波状の出現によって示されるように、ワームの形態は（歪む無傷であるかを示す図3A〜Dの筋肉）?...

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Antibody Staining in C. Elegans Using "Freeze-Cracking"

抗体染色中<em&gt; C.虫</em&gt;「フリーズクラッキング」使用

「凍結割れ、「線虫C.の内部組織を露出させるための方法をタンパク質の局在化のための抗体に虫が 、実証されている。

To stain C.  elegans with antibodies, the relatively impermeable cuticle must be  bypassed by chemical or mechanical methods.  "Freeze-cracking" is one ...

Research

JoVE Journal

Biology

Antibody Staining in C. Elegans Using &quot;Freeze-Cracking&quot;

Generation of Stable Transgenic C. elegans Using Microinjection

マイクロインジェクションを使用して安定したトランスジェニック線虫の世代

Transgenic Caenorhabditis elegans can be readily created via microinjection of a DNA plasmid solution into the gonad 1.  The plasmid DNA rearranges to ...

Method for Whole Mount Antibody Staining in Chick

チックの全マウントの抗体染色のための方法

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ...

Generation of Transgenic C. elegans by Biolistic Transformation

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トランスジェニックの世代 C.エレガンスバイオリスティック変換による

The number of laboratories using the free living nematode C. elegans is rapidly growing. The popularity of this biological model is attributed to a rapid ...

Imaging C. elegans Embryos using an Epifluorescent Microscope and Open Source Software

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イメージング C.エレガンス</em落射蛍光顕微鏡とオープンソースソフトウェアを使用して>胚

Cellular processes, such as chromosome assembly, segregation and cytokinesis,are inherently dynamic. Time-lapse imaging of living cells, using ...

Determining Genetic Expression Profiles in C. elegans Using Microarray and Real-time PCR

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で遺伝子発現プロファイルを決定 C.エレガンスマイクロアレイとリアルタイムPCRを用いて

Synapses are composed of a presynaptic active zone in the signaling cell and a postsynaptic terminal in the target cell. In the case of chemical synapses, ...

RNAi Screening to Identify Postembryonic Phenotypes in C. elegans

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の後胚表現型を識別するためのRNAiスクリーニング C.エレガンス</em

C. elegans has proven to be a valuable model system for the discovery and functional characterization of many genes and gene pathways1. More sophisticated ...

C. elegans Chemotaxis Assay

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C. elegansの走化性アッセイ

Many organisms use chemotaxis to seek out food sources, avoid noxious substances, and find mates.  Caenorhabditis elegans has impressive chemotaxis ...

An Anoxia-starvation Model for Ischemia/Reperfusion in C. elegans

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における虚血/再灌流のための無酸素飢餓モデル<em&gt; C.虫</em

Protocols for anoxia/starvation in the genetic model organism C. elegans simulate ischemia/reperfusion. Worms are separated from bacterial food and placed ...

Methods for Skin Wounding and Assays for Wound Responses in C. elegans

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創傷応答のためのスキン傷つけ処理のための方法およびアッセイ<em&gt; C。エレガンス</em

The C. elegans epidermis and cuticle form a simple yet sophisticated skin layer that can repair localized damage resulting from wounding. Studies of wound ...

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筋肉の細胞内コンパートメントを評価するための方法<em&gt; C。エレガンス</em

Muscle is a dynamic tissue that responds to changes in nutrition, exercise, and disease state. The loss of muscle mass and function with disease and age ...