Name: antibody staining in c. elegans using &quot;freeze-cracking&quot;
Uploaded: 2013-10-14T21:15:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Antibody Staining in C. Elegans Using "Freeze-Cracking" at JoVE.com

Finansieringen ble gitt av NSF CLLI # 0633618 og Ohio University. Noen stammer ble gitt av Caenorhabditis Genetics Center. Graduate student Reetobrata Basu vises i videoen.

MERK: Flere protokoll trinn presenteres med alternativer for oppsett og klargjøring avhengig av de konkrete forholdene i eksperimentet. For disse tilfellene, er alternative fremgangsmåten presentert som A, B, C osv. Den protokoll med alternative fremgangsmåten er skissert i figur 1.. En. Utarbeidelse av polylysin Coated Slides Tre forskjellige typer av lysbilder kan anvendes, avhengig av det ønskede forhold mellom enkel fremstilling, r...

<ol>
	<li>Harlow, E., Lane, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Antibodies: A Laboratory Manual. , (1988).</li><li>Mello, C., Fire, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+Transformation.">DNA Transformation.</a> Methods Cell Biol. 48, 451-482 (1995).</li><li>Boulin, T., Etchberger, J. F., Hobert, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reporter+gene+fusions.">Reporter gene fusions.</a> WormBook. , (2006).</li><li>Duerr, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunohistochemistry.">Immunohistochemistry.</a> WormBook. , (2006).</li><li>Finney, M., Ruvkun, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+unc-86+gene+product+couples+cell+lineage+and+cell+identity+in+C.+elegans.">The unc-86 gene product couples cell lineage and cell identity in C. elegans.</a> Cell. 63, 895-905 (1990).</li><li>Garriga, G., Desai, C., Horvitz, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+interactions+control+the+direction+of+outgrowth,+branching+and+fasciculation+of+the+HSN+axons+of+Caenorhabditis+elegans.">Cell interactions control the direction of outgrowth, branching and fasciculation of the HSN axons of Caenorhabditis elegans.</a> Development. 117, 1071-1087 (1993).</li><li>Miller, D. M., Shakes, D. C., Epstein, H. F., Shakes, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunofluorescence+microscopy.">Immunofluorescence microscopy.</a> Caenorhabditis elegans: Modern Biological Analysis of an Organism. , 365-394 (1995).</li><li>Crittenden, S. L., Troemel, E. R., Evans, T. C., Kimble, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GLP-1+is+localized+to+the+mitotic+region+of+the+C.+elegans+germ+line.">GLP-1 is localized to the mitotic region of the C. elegans germ line.</a> Development. 120, 2901-2911 (1994).</li><li>Strome, S., Wood, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunofluorescence+visualization+of+germ-line-specific+cytoplasmic+granules+in+embryos,+larvae,+and+adults+of+Caenorhabditis+elegans.">Immunofluorescence visualization of germ-line-specific cytoplasmic granules in embryos, larvae, and adults of Caenorhabditis elegans.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 79, 1558-1562 (1982).</li><li>Albertson, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Formation+of+the+first+cleavage+spindle+in+nematode+embryos.">Formation of the first cleavage spindle in nematode embryos.</a> Dev. Biol. 101, 61-72 (1984).</li><li>Harlow, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Using Antibodies: A Laboratory Manual. , (1999).</li><li>Ahringer, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reverse+Genetics.">Reverse Genetics.</a> WormBook. , (2006).</li></ol>

Det fryse cracking protokoll er en av flere metoder for antistoffarging i C. elegans. Den gir en relativt enkel måte å farge ormer, men krever spesifikke reagenser og øve for å oppnå optimale resultater. Kritiske trinn (skissert i figur 1) er: 1) glide preparat (se trinn 1 og 2) manuell kompresjon av nematoder (se trinn 2 og 3) hurtig fiksering (se trinn 3). Først, for å øke adhesjonen av de nematoder til skinnene, er det best å forberede slides med høy molekylvekt (long polymer) poly...

For å bestemme den cellulære og subcellulære lokalisering av proteiner, har forskere tradisjonelt merket vev med antistoffer valgt å spesifikt gjenkjenne spesielle proteiner en. I noen modellorganismer slik som C. elegans, har antistoffarging ofte blitt erstattet av molekylærgenetiske teknikker, som gir resultater raskere. Disse omfatter transformere organismer med konstruksjoner som består av gen-fusjoner mellom promoter og kodende regioner av genet av interesse og grønt fluorescerende protein. Imidlertid molekylære teknikker er gjenstand for en rekke gjenstander, inkludert problemer med å kjenne den virkelige promoter og endringer i ekspresjon av konstruksjoner med høy kopitall (de vanlige teknikkene i C. elegans) 2,3. Derfor, farging med antistoffer er fortsatt et mål for mange forskere som studerer protein funksjon in vivo. Beising vev med antistoffer kan være vanskelig, ettersom entibodies kan bare anerkjenne deres antigen i en bestemt konformasjon en. For eksempel kan antistoffer gjenkjenne bare denaturert eller intakt antigen fast på en bestemt måte, og kan ikke gjenkjenne antigen in situ. Problemet med antistoffarging i nematoder blir forverret av det faktum at hårstråene av nematode danner en relativt ugjennomtrengelig barriere, blokkerer tilgang av antistoffer til vev. Det finnes flere ulike metoder som brukes for antistoffarging i C. elegans (anmeldt i vår tidligere arbeid 4). Å farge intakte &#39;ormer,&#39; ble metoder utviklet for å fryse og tine i en relativt vanskelig fiksativ (formaldehyd eller glutaraldehyd), fryse-tine sykluser bidra til å knekke hårstråene for å tillate rask penetrering av fiksativ fem. Etter fiksering ble hårstråene permeabilized for å tillate gjennomtrengning av antistoffet, inkludert fremgangsmåter behandling med reduksjonsmidler, kollagenase eller begge deler 5-7. Disse treatments bevart morfologi, men ofte redusert eller ødelagt antistoff anerkjennelse. Alternative metoder omfatter disseksjon 8 å tillate antistoff penetrasjon. &quot;Freeze-cracking&quot; er en måte å få tilgang til det indre av den semi-intakt ormen å tillate antistoffarging 9-10. Fryse-cracking kan utføres med en rekke festeforhold samtidig unngå kollagenaseklassene og reduksjon behandlinger. De nematoder er plassert mellom to lim lysbilder, frosset, og deretter lysbildene er separert, etterlot det meste av nematode på bunnen lysbilde og mye av skjellaget på toppen lysbilde. Den nedre glide kan plasseres i fiksativ og hele glide med holdes nematoder blir overført gjennom antistoffarging prosedyre. Metoden gjør presentere to store problemer. For det første er det vanskelig å anvende den riktige mengde av trykket er nødvendig for å splitte de nematoder uten alvorlig å deformere dem. For det andre, er mange av ormer vil ikke stick til enten lysbilde, og vil gå tapt i fiksativ eller skyllinger. Imidlertid, med de riktige lysbilder og praksis, metoden vil raskt gi nematoder med rimelig morfologi som kan brukes sammen med et bredt utvalg av fiksativer og antistoffer. Fremgangsmåten kan varieres noe, avhengig av målet for experimenter. Ved farging av enkelt-nematoder er ønsket (for eksempel for å bestemme om en enkelt transformant har endret antistoff-farging), glir deretter med maksimal adhesjon (men høyere bakgrunnsfarging) kan benyttes, for eksempel laboratorie-fremstilt lysbilder med ekstra polylysin (se nedenfor). For formaldehyd eller glutaraldehyd fiksering, bør høyere vedheft lysbilder (laboratorie forberedt polylysin lysbilder) brukes, siden nematoder holder seg mer dårlig til polylysin etter disse fikseringer. Dersom vill-type nematoder blir fiksert med metanol og / eller aceton, glir da med lavere klebeevne og lavere bakgrunnsfarging skal brukes (kommersielt eller laboratory forberedt lysbilder). Hvis en rekke antistoffer og fiksativ blir brukt i laboratoriet, kan være forberedt på et utvalg av lysbilder på forhånd og lagres inntil nødvendig. Etter å ha tilgang til nematode vevet har blitt oppnådd, antistoff fargingsprosedyrer følge standard-fremgangsmåter (med lengre inkubasjoner som er karakteristisk for vevet i stedet for cellene 1,11).

<table border="1">
		<tbody>
		 <tr>
			<td>Name of Reagent/Material</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>poly-L-lysine slide (ESCO brand)</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>12-545-78</td>
			<td>Sigma brand slides also suitable</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>poly-L-lysine hydrobromide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P1524</td>
			<td>IMPORTANT: Brand and high molecular weight of polylysine critical</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>single frosted edge slides</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>48312-002</td>
			<td>Other brands are suitable</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>sodium azide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S2002-25G</td>
			<td>TOXIC, wear gloves and mask while weighing out powder to make 10% stock. Wear gloves when pipeting stock solution</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>coplin staining jar</td>
			<td>VWR</td>
			<td>47751-792</td>
			<td>Other brands are suitable</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>5-slide mailer</td>
			<td>Electron Microscopy Science</td>
			<td>71549-01</td>
			<td>One of many different brands of small slide holder, suitable for staining</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>VWR</td>
			<td>MK262159</td>
			<td>IMPORTANT: Regular formalin solutions (37% formaldehyde) are NOT suitable. Either 1) Dissolve crysatlaline paraformaldehyde in phosphate buffer and store in small aliquots frozen. Or 2) buy electron microscopy grade paraformaldehyde in aliquots. TOXIC -wear gloves; dispose of excess down sink with water.</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Glutaraldehyde solution, 25% in water</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G 5882</td>
			<td>IMPORTANT: purchase electron microscopy grade glutaraldehyde in ampules; TOXIC -wear gloves; dispose of excess down sink with water.</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>VWR</td>
			<td>EM-9410</td>
			<td>Other brands are suitable</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>ICN820451</td>
			<td>Other brands are suitable</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Donkey Serum, lyophilized</td>
			<td>Jackson Immunoresearch</td>
			<td>017-000-121</td>
			<td>Other brands are suitable</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Cy3 Donkey anti-Mouse IgG multi-labeling</td>
			<td>Jackson Immunoresearch</td>
			<td>715-165-150</td>
			<td>This company is recommended for high quality multi-label (affinity depleted) antibodies. Select appropriate dye and antigen (animal used to raise primary antibody). </td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>n-propyl gallate</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>ICN10274750</td>
			<td>Other brands are suitable</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>DAPI, 4',6'-diamidino-2-phenylindole dihydrochloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D 9542</td>
			<td>TOXIC. Wear gloves and dispense into small aliquots and feeze to minimize exposure</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Whatman #1 15 cm diameter filters</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>09805G</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Coverslip #1 1/2 rectangle 24 x 60 mm</td>
			<td>VWR</td>
			<td>48393-252</td>
			<td>#1 1/2 thickness is optically best</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Microscope slide folder</td>
			<td>VWR</td>
			<td>48429-092</td>
			<td>Other brands are suitable</td>
		 </tr>
		</tbody>
 </table>

antibody staining in c. elegans using &quot;freeze-cracking&quot;

Å farge C. elegans med antistoffer, må den relativt ugjennomtrengelig hårstråene omgås ved kjemiske eller mekaniske metoder. &quot;Freeze-cracking&quot; er en metode som brukes til å fysisk dra hårstråene fra nematoder ved å komprimere nematoder mellom to heft lysbilder, fryse dem, og dra lysbildene fra hverandre. Fryse-cracking er en enkel og rask måte for å få tilgang til vev uten kjemisk behandling, og kan brukes med en rekke fiksativ. Men det fører til tap av mange av prøvene og den nødvendige kompresjon mekanisk forvrenger prøven. Praksis er nødvendig for å maksimere utvinningen av prøver med god morfologi. Fryse-cracking kan optimaliseres for spesifikke fiksering forhold, gjenvinning av prøver, eller lav ikke-spesifikk farging, men ikke for alle parametre samtidig. For antistoffer som krever svært harde festeforhold og tolerere de kjemiske behandlinger for å kjemisk permeabilize skjellaget, treatment av intakte nematoder i løsning kan være å foretrekke. Dersom antistoffet krever en lettere løsning, eller dersom de optimale fiksering betingelser er ukjente, gir fryse-cracking en meget nyttig måte å raskt analysen antistoffet, og kan gi spesifikke subcellulære og cellulær lokalisering informasjon for antigenet av interesse.

Når ormer er riktig komprimert, sprakk, og lett fast, kan praktisk talt hele ormen være tilgjengelig for antistoffarging (se figur 2). Plasseringen av kjernen som antydet med DAPI farging indikerer hvilke deler av spiralen er intakte Når ormer er utsatt for en hardere fikseringsmiddel, som for eksempel formaldehyd, kan morfologien av ormen bli forvrengt (sett fra unaturlig bølget utseende Musklene i figurene 3A-D). Et annet vanlig problem er ujevn fiksering eller penetrasjon av best...

Watch this Scientific Journal Video about Antibody Staining in C. Elegans Using "Freeze-Cracking" at JoVE.com

Antibody Staining in C. Elegans Using "Freeze-Cracking"

Antistoffarging i<em&gt; C. Elegans</em&gt; Ved hjelp av &quot;Freeze-Cracking&quot;

&quot;Fryse-cracking&quot;, en fremgangsmåte for å utsette det indre vev av nematode C. elegans til antistoffer for protein lokalisering, er demonstrert.

To stain C.  elegans with antibodies, the relatively impermeable cuticle must be  bypassed by chemical or mechanical methods.  "Freeze-cracking" is one ...

Research

JoVE Journal

Biology

Antibody Staining in C. Elegans Using &quot;Freeze-Cracking&quot;

Generation of Stable Transgenic C. elegans Using Microinjection

Transgenic Caenorhabditis elegans can be readily created via microinjection of a DNA plasmid solution into the gonad 1.  The plasmid DNA rearranges to ...

Method for Whole Mount Antibody Staining in Chick

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ...

Generation of Transgenic C. elegans by Biolistic Transformation

Generation of Transgenic C. elegans by Biolistic Transformation

The number of laboratories using the free living nematode C. elegans is rapidly growing. The popularity of this biological model is attributed to a rapid ...

Imaging C. elegans Embryos using an Epifluorescent Microscope and Open Source Software

Imaging C. elegans Embryos using an Epifluorescent Microscope and Open Source Software

Cellular processes, such as chromosome assembly, segregation and cytokinesis,are inherently dynamic. Time-lapse imaging of living cells, using ...

Determining Genetic Expression Profiles in C. elegans Using Microarray and Real-time PCR

Determining Genetic Expression Profiles in C. elegans Using Microarray and Real-time PCR

Synapses are composed of a presynaptic active zone in the signaling cell and a postsynaptic terminal in the target cell. In the case of chemical synapses, ...

RNAi Screening to Identify Postembryonic Phenotypes in C. elegans

RNAi Screening to Identify Postembryonic Phenotypes in C. elegans

RNAi Screening for å identifisere Postembryonic fenotyper i C. elegans</em

C. elegans has proven to be a valuable model system for the discovery and functional characterization of many genes and gene pathways1. More sophisticated ...

C. elegans Chemotaxis Assay

C. elegans Chemotaxis Assay

C. elegans Chemotaxis analysen

Many organisms use chemotaxis to seek out food sources, avoid noxious substances, and find mates.  Caenorhabditis elegans has impressive chemotaxis ...

An Anoxia-starvation Model for Ischemia/Reperfusion in C. elegans

An Anoxia-starvation Model for Ischemia/Reperfusion in C. elegans

En Anoksi-sult Modell for iskemi / Reperfusjon i<em&gt; C. elegans</em

Protocols for anoxia/starvation in the genetic model organism C. elegans simulate ischemia/reperfusion. Worms are separated from bacterial food and placed ...

Methods for Skin Wounding and Assays for Wound Responses in C. elegans

Methods for Skin Wounding and Assays for Wound Responses in C. elegans

Metoder for Skin såre og Analyser for Wound Responses i<em&gt; C. elegans</em

The C. elegans epidermis and cuticle form a simple yet sophisticated skin layer that can repair localized damage resulting from wounding. Studies of wound ...

Methods to Assess Subcellular Compartments of Muscle in C. elegans

Methods to Assess Subcellular Compartments of Muscle in C. elegans

Metoder for å vurdere subcellulære avdelinger av muskel i<em&gt; C. elegans</em

Muscle is a dynamic tissue that responds to changes in nutrition, exercise, and disease state. The loss of muscle mass and function with disease and age ...