Name: antibody staining in c. elegans using &quot;freeze-cracking&quot;
Uploaded: 2013-10-14T21:15:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Antibody Staining in C. Elegans Using "Freeze-Cracking" at JoVE.com

Финансирование было предоставлено NSF CCLI # 0633618 и университета Огайо. Некоторые штаммы были предоставлены Caenorhabditis генетический центр. Аспирант Reetobrata Басу появляется в видео.

ПРИМЕЧАНИЕ: Несколько шагов протокола представлены варианты настройки и подготовки в зависимости от конкретных условий эксперимента. Для этих случаев альтернативные шаги представлены в виде A, B, C и т.д. Протокол с альтернативными шагами изложен на рисунке 1. <p class="jove_title...

<ol>
	<li>Harlow, E., Lane, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Antibodies: A Laboratory Manual. , (1988).</li><li>Mello, C., Fire, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+Transformation.">DNA Transformation.</a> Methods Cell Biol. 48, 451-482 (1995).</li><li>Boulin, T., Etchberger, J. F., Hobert, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reporter+gene+fusions.">Reporter gene fusions.</a> WormBook. , (2006).</li><li>Duerr, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunohistochemistry.">Immunohistochemistry.</a> WormBook. , (2006).</li><li>Finney, M., Ruvkun, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+unc-86+gene+product+couples+cell+lineage+and+cell+identity+in+C.+elegans.">The unc-86 gene product couples cell lineage and cell identity in C. elegans.</a> Cell. 63, 895-905 (1990).</li><li>Garriga, G., Desai, C., Horvitz, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+interactions+control+the+direction+of+outgrowth,+branching+and+fasciculation+of+the+HSN+axons+of+Caenorhabditis+elegans.">Cell interactions control the direction of outgrowth, branching and fasciculation of the HSN axons of Caenorhabditis elegans.</a> Development. 117, 1071-1087 (1993).</li><li>Miller, D. M., Shakes, D. C., Epstein, H. F., Shakes, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunofluorescence+microscopy.">Immunofluorescence microscopy.</a> Caenorhabditis elegans: Modern Biological Analysis of an Organism. , 365-394 (1995).</li><li>Crittenden, S. L., Troemel, E. R., Evans, T. C., Kimble, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GLP-1+is+localized+to+the+mitotic+region+of+the+C.+elegans+germ+line.">GLP-1 is localized to the mitotic region of the C. elegans germ line.</a> Development. 120, 2901-2911 (1994).</li><li>Strome, S., Wood, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunofluorescence+visualization+of+germ-line-specific+cytoplasmic+granules+in+embryos,+larvae,+and+adults+of+Caenorhabditis+elegans.">Immunofluorescence visualization of germ-line-specific cytoplasmic granules in embryos, larvae, and adults of Caenorhabditis elegans.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 79, 1558-1562 (1982).</li><li>Albertson, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Formation+of+the+first+cleavage+spindle+in+nematode+embryos.">Formation of the first cleavage spindle in nematode embryos.</a> Dev. Biol. 101, 61-72 (1984).</li><li>Harlow, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Using Antibodies: A Laboratory Manual. , (1999).</li><li>Ahringer, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reverse+Genetics.">Reverse Genetics.</a> WormBook. , (2006).</li></ol>

Протокол замораживания взлома является одним из нескольких методов окрашивания антител в С. Элеганс. Это обеспечивает относительно простой способ окрасить червей, но требует специфических реагентов и практики для достижения оптимальных результатов. Критические шаги (изложенны?...

Для определения клеточного и внутриклеточную локализацию белков, ученые традиционно помечены ткани с антителами, выбранными специфически распознавать специфические белки 1. В некоторых модельных организмов, таких как C. Элеганс, окрашивание антител часто заменяется молекулярно-генетических методов, которые быстрее дают результаты. Они включают трансформирующие организмов с конструкциями, состоящими из гена слияния между промотором и кодирования областей интересующего гена и зеленый флуоресцентный белок. Тем не менее, молекулярные методы с учетом ряда артефактов, в том числе проблем с зная истинного промотор и изменения в экспрессии конструктов на большого числа копий (обычные методы в C. Элеганс) 2,3. Поэтому окрашивание с антителами остается целью для многих ученых, изучающих функцию белка в естественных условиях. Окрашивание ткани с антителами может быть трудно, посколькуtibodies может признать только их антиген в определенной конформации 1. Например, антитела могут распознавать только денатурированный или интактный антиген фиксированный в определенном направлении и не может распознавать антиген на месте. Проблема окрашивания антител у нематод усугубляется тем, что кутикула нематод образует относительно непроницаемый барьер, блокируя доступ антител к тканям. Есть несколько различных методов, используемых для окрашивания антител в С. Элеганс (отзывы в нашей предыдущей работе 4). Чтобы окрасить нетронутыми &quot;червей,&quot; методы были разработаны, чтобы заморозить и разморозить в относительно жестком фиксатором (формальдегида или глутаральдегида); циклы замораживания-оттаивания помочь взломать кутикулу, чтобы позволить быстрое проникновение закрепляющего 5. После фиксации кутикула был проницаемыми, чтобы позволить проникновение антитела; методы включали лечение с восстанавливающими агентами, коллагеназы, или обоих 5-7. Эти тreatments сохранились морфологию, но часто сводится или уничтожены признание антител. Альтернативные методы включают рассечение 8, чтобы позволить проникновение антител. &quot;Заморозить взлома&quot; является одним из способов получить доступ к внутренней части полу-нетронутыми червя, чтобы антитела окрашивания 9-10. Freeze-крекинг может быть выполнена с различными условий фиксации, избегая при этом коллагеназы и сокращению процедуры. Нематоды помещают между двумя клеев слайдов, замораживают, а затем скользит разделены, в результате чего большую часть нематод на нижней стекло и большую часть кутикулы на верхнем слайде. В нижней слайд могут быть помещены в фиксаторе и весь слайд с прилипших нематод передается с помощью процедуры окрашивания антителом. Метод действительно представляет две основные трудности. Во-первых, это трудно применить правильное количество давления, необходимого, чтобы разделить нематод без серьезного деформируя их. Во-вторых, многие из червей не будет сотметка о любом слайде, и будут потеряны в фиксатора или полосканий. Тем не менее, с соответствующими слайдами и практике метод быстро дает нематод с достаточной морфологии который может быть использован с широким спектром фиксаторов и антител. Способ может быть изменена незначительно, в зависимости от цели экспериментатора. Если окрашивание отдельных нематод нужен (например, чтобы определить, был ли изменен один трансформант окрашивание антител), а затем скользит с максимальной адгезии (но выше фона окрашивание) может быть использована, например, в лабораторных подготовлен слайдов с дополнительной полилизина (см. ниже). Для формальдегида или глутаральдегида фиксации, более высокие горки адгезии (лабораторные подготовлены Полилизиновые слайды) следует использовать, так как нематоды придерживаться более плохо с полилизином после этих записей. Если нематоды дикого типа в настоящее время фиксировали метанолом и / или ацетоном, затем слайды с низкой адгезией и ниже окрашивание фона следует использовать (коммерческая или лaboratory подготовлены слайды). Если разнообразие антител и фиксаторов используются в лаборатории, выбор слайдов могут быть получены заранее и хранить до необходимости. После доступ к нематоде ткани был накоплен, процедуры окрашивания антител следовать стандартные методы (с более длинными инкубации, характерных для тканей, а не клеток 1,11).

<table border="1">
		<tbody>
		 <tr>
			<td>Name of Reagent/Material</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>poly-L-lysine slide (ESCO brand)</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>12-545-78</td>
			<td>Sigma brand slides also suitable</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>poly-L-lysine hydrobromide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P1524</td>
			<td>IMPORTANT: Brand and high molecular weight of polylysine critical</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>single frosted edge slides</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>48312-002</td>
			<td>Other brands are suitable</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>sodium azide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S2002-25G</td>
			<td>TOXIC, wear gloves and mask while weighing out powder to make 10% stock. Wear gloves when pipeting stock solution</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>coplin staining jar</td>
			<td>VWR</td>
			<td>47751-792</td>
			<td>Other brands are suitable</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>5-slide mailer</td>
			<td>Electron Microscopy Science</td>
			<td>71549-01</td>
			<td>One of many different brands of small slide holder, suitable for staining</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>VWR</td>
			<td>MK262159</td>
			<td>IMPORTANT: Regular formalin solutions (37% formaldehyde) are NOT suitable. Either 1) Dissolve crysatlaline paraformaldehyde in phosphate buffer and store in small aliquots frozen. Or 2) buy electron microscopy grade paraformaldehyde in aliquots. TOXIC -wear gloves; dispose of excess down sink with water.</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Glutaraldehyde solution, 25% in water</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G 5882</td>
			<td>IMPORTANT: purchase electron microscopy grade glutaraldehyde in ampules; TOXIC -wear gloves; dispose of excess down sink with water.</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>VWR</td>
			<td>EM-9410</td>
			<td>Other brands are suitable</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>ICN820451</td>
			<td>Other brands are suitable</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Donkey Serum, lyophilized</td>
			<td>Jackson Immunoresearch</td>
			<td>017-000-121</td>
			<td>Other brands are suitable</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Cy3 Donkey anti-Mouse IgG multi-labeling</td>
			<td>Jackson Immunoresearch</td>
			<td>715-165-150</td>
			<td>This company is recommended for high quality multi-label (affinity depleted) antibodies. Select appropriate dye and antigen (animal used to raise primary antibody). </td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>n-propyl gallate</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>ICN10274750</td>
			<td>Other brands are suitable</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>DAPI, 4',6'-diamidino-2-phenylindole dihydrochloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D 9542</td>
			<td>TOXIC. Wear gloves and dispense into small aliquots and feeze to minimize exposure</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Whatman #1 15 cm diameter filters</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>09805G</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Coverslip #1 1/2 rectangle 24 x 60 mm</td>
			<td>VWR</td>
			<td>48393-252</td>
			<td>#1 1/2 thickness is optically best</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Microscope slide folder</td>
			<td>VWR</td>
			<td>48429-092</td>
			<td>Other brands are suitable</td>
		 </tr>
		</tbody>
 </table>

antibody staining in c. elegans using &quot;freeze-cracking&quot;

Чтобы окрасить C. Элеганс с антителами, относительно непроницаемой кутикулы должны быть обойдены с помощью химических или механических методов. &quot;Заморозить взлома&quot; является одним из методов, используемое для физического тянуть кутикулу от нематод путем сжатия нематоды между двумя прикрепленных горками, замораживая их, и потянув слайды друг от друга. Freeze-крекинга обеспечивает простой и быстрый способ получить доступ к тканям без химической обработки и могут быть использованы с различными фиксаторов. Однако, это приводит к потере многих образцов и требуемое сжатие механически искажает образец. Практика требуется, чтобы максимизировать восстановление образцов с хорошей морфологией. Freeze-крекинг могут быть оптимизированы для конкретных условий фиксации, сбора проб или низкой неспецифической окрашивания, но не по всем параметрам сразу. Для антител, которые требуют очень жестких условий фиксации и терпеть химических обработок, необходимых для химически проницаемыми кутикулу, ЛЕЧЕНИИможет быть предпочтительным т интактных нематод в растворе. Если антитело требует более легкий исправление или, если оптимальные условия фиксации неизвестны, сублимационной крекинг обеспечивает очень полезный способ быстро анализе антитело и может дать определенную внутриклеточную и клеточный информации для локализации представляющим интерес антигеном.

Когда черви правильно сжатый, трещины, и слегка фиксированной, практически весь червь может быть доступным для окрашивания антител (см. рисунок 2). Расположение ядер, как показано окрашивание DAPI указывает, какие части червя целы Когда черви подвергают более жесткой фиксатора, т...

Watch this Scientific Journal Video about Antibody Staining in C. Elegans Using "Freeze-Cracking" at JoVE.com

Antibody Staining in C. Elegans Using "Freeze-Cracking"

Антитела Окрашивание в<em&gt; С. Элеганс</em&gt; Использование &quot;Freeze-Крекинг&quot;

&quot;Freeze-трещин,&quot; метод подвергая внутренние ткани нематод C. Элеганс к антител для локализации белка, демонстрируется.

To stain C.  elegans with antibodies, the relatively impermeable cuticle must be  bypassed by chemical or mechanical methods.  "Freeze-cracking" is one ...

Research

JoVE Journal

Biology

Antibody Staining in C. Elegans Using &quot;Freeze-Cracking&quot;

Generation of Stable Transgenic C. elegans Using Microinjection

Генерация Стабильный Трансгенные Элеганс C. Использование Микроинъекция

Transgenic Caenorhabditis elegans can be readily created via microinjection of a DNA plasmid solution into the gonad 1.  The plasmid DNA rearranges to ...

Method for Whole Mount Antibody Staining in Chick

Метод полного окрашивания антител горе в Чик

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ...

Generation of Transgenic C. elegans by Biolistic Transformation

Generation of Transgenic C. elegans by Biolistic Transformation

Поколение трансгенных С. Элеганс По Biolistic преобразования

The number of laboratories using the free living nematode C. elegans is rapidly growing. The popularity of this biological model is attributed to a rapid ...

Imaging C. elegans Embryos using an Epifluorescent Microscope and Open Source Software

Imaging C. elegans Embryos using an Epifluorescent Microscope and Open Source Software

Изображений С. Элеганс Эмбрионы использованием Epifluorescent Микроскоп и открытое программное обеспечение

Cellular processes, such as chromosome assembly, segregation and cytokinesis,are inherently dynamic. Time-lapse imaging of living cells, using ...

Determining Genetic Expression Profiles in C. elegans Using Microarray and Real-time PCR

Determining Genetic Expression Profiles in C. elegans Using Microarray and Real-time PCR

Определение генетических профилей выражения в С. Элеганс Использование Microarray и ПЦР в реальном времени

Synapses are composed of a presynaptic active zone in the signaling cell and a postsynaptic terminal in the target cell. In the case of chemical synapses, ...

RNAi Screening to Identify Postembryonic Phenotypes in C. elegans

RNAi Screening to Identify Postembryonic Phenotypes in C. elegans

RNAi скрининга для выявления Постэмбриональное фенотипы в С. Элеганс</em

C. elegans has proven to be a valuable model system for the discovery and functional characterization of many genes and gene pathways1. More sophisticated ...

C. elegans Chemotaxis Assay

C. elegans Chemotaxis Assay

C. Элеганс Анализ хемотаксиса

Many organisms use chemotaxis to seek out food sources, avoid noxious substances, and find mates.  Caenorhabditis elegans has impressive chemotaxis ...

An Anoxia-starvation Model for Ischemia/Reperfusion in C. elegans

An Anoxia-starvation Model for Ischemia/Reperfusion in C. elegans

Аноксия-голодание модель ишемии / реперфузии в<em&gt; С. Элеганс</em

Protocols for anoxia/starvation in the genetic model organism C. elegans simulate ischemia/reperfusion. Worms are separated from bacterial food and placed ...

Methods for Skin Wounding and Assays for Wound Responses in C. elegans

Methods for Skin Wounding and Assays for Wound Responses in C. elegans

Методы для кожи телесные повреждения и анализы для заживления ответы в<em&gt; C. Элеганс</em

The C. elegans epidermis and cuticle form a simple yet sophisticated skin layer that can repair localized damage resulting from wounding. Studies of wound ...

Methods to Assess Subcellular Compartments of Muscle in C. elegans

Methods to Assess Subcellular Compartments of Muscle in C. elegans

Методы оценки субклеточных отсеков Muscle в<em&gt; С. Элеганс</em

Muscle is a dynamic tissue that responds to changes in nutrition, exercise, and disease state. The loss of muscle mass and function with disease and age ...