Name: antibody staining in c. elegans using &quot;freeze-cracking&quot;
Uploaded: 2013-10-14T21:15:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Antibody Staining in C. Elegans Using "Freeze-Cracking" at JoVE.com

Finansieringen kom från NSF CCLI # 0633618 och Ohio University. Vissa stammar lämnades av Caenorhabditis Genetics Center. Doktorand Reetobrata Basu visas i videon.

OBS: Flera protokollsteg presenteras med alternativ för installation och förberedelse beroende på de särskilda villkoren för experimentet. För dessa fall finns alternativa åtgärder presenteras som A, B, C, etc. Protokollet med alternativa åtgärder som skisseras i figur 1. 1. Beredning av Polylysin Coated Slides Tre olika typer av bilder kan användas, beroende på den önskade avvägningen mellan enkel framställning, relativ vid...

<ol>
	<li>Harlow, E., Lane, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Antibodies: A Laboratory Manual. , (1988).</li><li>Mello, C., Fire, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+Transformation.">DNA Transformation.</a> Methods Cell Biol. 48, 451-482 (1995).</li><li>Boulin, T., Etchberger, J. F., Hobert, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reporter+gene+fusions.">Reporter gene fusions.</a> WormBook. , (2006).</li><li>Duerr, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunohistochemistry.">Immunohistochemistry.</a> WormBook. , (2006).</li><li>Finney, M., Ruvkun, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+unc-86+gene+product+couples+cell+lineage+and+cell+identity+in+C.+elegans.">The unc-86 gene product couples cell lineage and cell identity in C. elegans.</a> Cell. 63, 895-905 (1990).</li><li>Garriga, G., Desai, C., Horvitz, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+interactions+control+the+direction+of+outgrowth,+branching+and+fasciculation+of+the+HSN+axons+of+Caenorhabditis+elegans.">Cell interactions control the direction of outgrowth, branching and fasciculation of the HSN axons of Caenorhabditis elegans.</a> Development. 117, 1071-1087 (1993).</li><li>Miller, D. M., Shakes, D. C., Epstein, H. F., Shakes, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunofluorescence+microscopy.">Immunofluorescence microscopy.</a> Caenorhabditis elegans: Modern Biological Analysis of an Organism. , 365-394 (1995).</li><li>Crittenden, S. L., Troemel, E. R., Evans, T. C., Kimble, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GLP-1+is+localized+to+the+mitotic+region+of+the+C.+elegans+germ+line.">GLP-1 is localized to the mitotic region of the C. elegans germ line.</a> Development. 120, 2901-2911 (1994).</li><li>Strome, S., Wood, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunofluorescence+visualization+of+germ-line-specific+cytoplasmic+granules+in+embryos,+larvae,+and+adults+of+Caenorhabditis+elegans.">Immunofluorescence visualization of germ-line-specific cytoplasmic granules in embryos, larvae, and adults of Caenorhabditis elegans.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 79, 1558-1562 (1982).</li><li>Albertson, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Formation+of+the+first+cleavage+spindle+in+nematode+embryos.">Formation of the first cleavage spindle in nematode embryos.</a> Dev. Biol. 101, 61-72 (1984).</li><li>Harlow, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Using Antibodies: A Laboratory Manual. , (1999).</li><li>Ahringer, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reverse+Genetics.">Reverse Genetics.</a> WormBook. , (2006).</li></ol>

Den fryst sprickbildning protokollet är en av flera metoder för antikroppsfärgning i C. elegans. Det ger ett relativt enkelt sätt att färga maskar, men kräver specifika reagenser och träna för bästa resultat. Kritiska steg (som beskrivs i figur 1) är: 1) glaspreparering (se steg 1 och 2) manuell kompression av nematoder (se steg 2 och 3) snabb fixering (se steg 3). Först, för att maximera vidhäftningen av nematoderna till bilderna, är det bäst att förbereda bilder med hög molek...

För att bestämma den cellulära och subcellulära lokalisering av proteiner, har forskare traditionellt märkta vävnader med antikroppar som valts för att specifikt känna igen särskilda proteiner 1. I vissa modellorganismer såsom C. elegans har antikroppsfärgning ofta ersatts av molekylärgenetiska tekniker, vilka ger resultat snabbare. Dessa innefattar transformerande organismer med konstrukt bestående av genfusioner mellan promotor och kodande regioner av genen av intresse och grönt fluorescerande protein. Molekylära tekniker är dock föremål för ett antal artefakter, bland annat problem med att känna den sanna promotorn och förändringar i uttryck av konstruktioner på ett stort antal kopior (de vanliga teknikerna i C. elegans) 2,3. Därför färgning med antikroppar förblir ett mål för många forskare som studerar proteiners funktion in vivo. Färgning vävnader med antikroppar som kan vara svårt, eftersom entibodies får bara erkänna deras antigen i en viss konforma 1. Till exempel kan antikroppar känner igen endast denatureras eller intakt antigen fast på ett visst sätt och kanske inte känner igen antigenet in situ. Problemet med antikroppar färgning i nematoder förvärras av det faktum att nagelbanden av nematoden bildar en relativt ogenomtränglig barriär, blockera åtkomst av antikroppar till vävnaderna. Det finns flera olika metoder som används för antikroppsfärgning i C. elegans (över i vårt tidigare arbete 4). Att färga intakta &quot;maskar,&quot; har metoder utvecklats för att frysa och tina i ett relativt hårt fixativ (formaldehyd eller glutaraldehyd), de frys-tö cykler hjälpa knäcka nagelbanden för att möjliggöra en snabb penetration av fixativ 5. Efter fixering till ytterhud permeabiliseras för att medge penetrering av antikroppen; metoder inkluderade behandling med reduktionsmedel, kollagenas, eller både och 5-7. Dessa treatments bevarade morfologi, men ofta reduceras eller förstörda antikroppsigenkänning. Alternativa metoder inkluderar dissektion 8 för att möjliggöra penetration antikropp. &quot;Freeze-cracking&quot; är ett sätt att få tillgång till det inre av det halv intakt mask för att tillåta antikroppsfärgning 9-10. Fryst krackningen kan genomföras med en mängd olika fixeringsförhållanden samtidigt som man undviker kollagenas-och reduktionsbehandlingar. Nematoderna är placerade mellan två lim diabilder, frysta och sedan objektglasen separerades, lämnar de flesta av nematoden på botten sliden och mycket av ytterhud på översta objektglaset. Den nedre bild kan placeras i fixativ och hela bilden med vidhäftade nematoder överförs genom antikroppsfärgningsproceduren. Metoden ställer dock två stora problem. För det första är det svårt att tillämpa rätt mängd tryck som krävs för att dela upp de nematoder utan att allvarligt deformera dem. För det andra, många av maskarna kommer inte skryssa antingen glida, och kommer att gå förlorade i fixativ eller sköljningar. Men med de riktiga diabilder och praxis, varvid förfarandet kommer snabbt erhållande nematoder med rimlig morfologi som kan användas med en mängd olika fixativ och antikroppar. Metoden kan varieras något, beroende på målet för den som utför experimentet. Om färgning av enstaka nematoder önskas (t.ex. för att fastställa om en enda trans har förändrat antikroppsfärgning), glider sedan med maximal vidhäftning (men högre bakgrundsfärgning) kan användas, till exempel laboratorie förberedda bilder med extra polylysin (se nedan). För formaldehyd eller glutaraldehyd fixering bör högre vidhäftnings diabilder (laboratorie förberedda polylysin diabilder) användas, eftersom nematoder hålla sig sämre till polylysin efter dessa upptagningar. Om vildtyp nematoder slås fast med metanol och / eller aceton, glider sedan med lägre friktion och lägre bakgrundsfärgning bör användas (kommersiella eller laboratory förberedda diabilder). Om en mängd olika antikroppar och fixativ som används i laboratoriet, kan ett urval av glas förberedas i förväg och lagras tills det behövs. Efter tillgång till nematoden vävnad har vunnits, antikroppsfärgningsförfaranden följer standardmetoder (med längre inkubationer karakteristiska av vävnader snarare än celler 1,11).

<table border="1">
		<tbody>
		 <tr>
			<td>Name of Reagent/Material</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>poly-L-lysine slide (ESCO brand)</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>12-545-78</td>
			<td>Sigma brand slides also suitable</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>poly-L-lysine hydrobromide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P1524</td>
			<td>IMPORTANT: Brand and high molecular weight of polylysine critical</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>single frosted edge slides</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>48312-002</td>
			<td>Other brands are suitable</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>sodium azide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S2002-25G</td>
			<td>TOXIC, wear gloves and mask while weighing out powder to make 10% stock. Wear gloves when pipeting stock solution</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>coplin staining jar</td>
			<td>VWR</td>
			<td>47751-792</td>
			<td>Other brands are suitable</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>5-slide mailer</td>
			<td>Electron Microscopy Science</td>
			<td>71549-01</td>
			<td>One of many different brands of small slide holder, suitable for staining</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>VWR</td>
			<td>MK262159</td>
			<td>IMPORTANT: Regular formalin solutions (37% formaldehyde) are NOT suitable. Either 1) Dissolve crysatlaline paraformaldehyde in phosphate buffer and store in small aliquots frozen. Or 2) buy electron microscopy grade paraformaldehyde in aliquots. TOXIC -wear gloves; dispose of excess down sink with water.</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Glutaraldehyde solution, 25% in water</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G 5882</td>
			<td>IMPORTANT: purchase electron microscopy grade glutaraldehyde in ampules; TOXIC -wear gloves; dispose of excess down sink with water.</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>VWR</td>
			<td>EM-9410</td>
			<td>Other brands are suitable</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>ICN820451</td>
			<td>Other brands are suitable</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Donkey Serum, lyophilized</td>
			<td>Jackson Immunoresearch</td>
			<td>017-000-121</td>
			<td>Other brands are suitable</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Cy3 Donkey anti-Mouse IgG multi-labeling</td>
			<td>Jackson Immunoresearch</td>
			<td>715-165-150</td>
			<td>This company is recommended for high quality multi-label (affinity depleted) antibodies. Select appropriate dye and antigen (animal used to raise primary antibody). </td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>n-propyl gallate</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>ICN10274750</td>
			<td>Other brands are suitable</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>DAPI, 4',6'-diamidino-2-phenylindole dihydrochloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D 9542</td>
			<td>TOXIC. Wear gloves and dispense into small aliquots and feeze to minimize exposure</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Whatman #1 15 cm diameter filters</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>09805G</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Coverslip #1 1/2 rectangle 24 x 60 mm</td>
			<td>VWR</td>
			<td>48393-252</td>
			<td>#1 1/2 thickness is optically best</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Microscope slide folder</td>
			<td>VWR</td>
			<td>48429-092</td>
			<td>Other brands are suitable</td>
		 </tr>
		</tbody>
 </table>

antibody staining in c. elegans using &quot;freeze-cracking&quot;

Att färga C. elegans med antikroppar, måste den relativt ogenomträngliga nagelband kringgås genom kemiska eller mekaniska metoder. &quot;Freeze-cracking&quot; är en metod som används för att fysiskt dra i nagelbanden från nematoder genom att komprimera nematoder mellan två tillhörande bilder, frysa dem och dra bilderna isär. Fryst krackning ger ett enkelt och snabbt sätt att få tillgång till vävnaderna utan kemisk behandling och kan användas med en mängd olika fixeringsmedel. Däremot leder det till förlust av många av proverna och den nödvändiga kompressionen snedvrider mekaniskt provet. Öva krävs för att maximera återvinningen av prover med god morfologi. Fryst sprickbildning kan optimeras för specifika fixeringsförhållanden, återvinning av prover, eller låg ospecifik färgning, men inte för alla parametrar på en gång. För antikroppar som kräver mycket hårda fixeringsförhållanden och tål de kemiska behandlingar som behövs för att kemiskt permeabilize nagelbanden, treatment av intakta nematoder i lösning kan vara att föredra. Om antikroppen kräver en lättare fix eller om de optimala fixeringsförhållandena är okänd, tillhandahåller frys krackning ett mycket användbart sätt att snabbt analysera antikroppen och kan ge specifika subcellulära och cellulära lokaliseringen informationen för antigenet av intresse.

När maskarna är ordentligt komprimerade, knäckt, och lätt fast, kan i stort sett hela masken vara tillgänglig för antikroppsfärgning (se figur 2). Placeringen av kärnorna vilket indikeras av DAPI färgning visar vilka delar av masken är intakta När maskarna utsätts för en hårdare fixeringsmedel, såsom formaldehyd, kan morfologi masken blir förvrängd (som ses av onaturligt vågig utseende muskler i figurerna 3A-D). Ett annat vanligt problem är ojämn fixering eller penet...

Watch this Scientific Journal Video about Antibody Staining in C. Elegans Using "Freeze-Cracking" at JoVE.com

Antibody Staining in C. Elegans Using "Freeze-Cracking"

Antikropp färgning i<em&gt; C. Elegans</em&gt; Använda &quot;Freeze-Cracking&quot;

&quot;Freeze-cracking,&quot; en metod för att exponera de inre vävnaderna i nematoden C. elegans till antikroppar för proteinlokalisering, demonstreras.

To stain C.  elegans with antibodies, the relatively impermeable cuticle must be  bypassed by chemical or mechanical methods.  "Freeze-cracking" is one ...

Research

JoVE Journal

Biology

Antibody Staining in C. Elegans Using &quot;Freeze-Cracking&quot;

Generation of Stable Transgenic C. elegans Using Microinjection

Generering av Stabil Transgena C. elegans Använda mikroinjektion

Transgenic Caenorhabditis elegans can be readily created via microinjection of a DNA plasmid solution into the gonad 1.  The plasmid DNA rearranges to ...

Method for Whole Mount Antibody Staining in Chick

Metod för hela berget antikropp färgning i Chick

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ...

Generation of Transgenic C. elegans by Biolistic Transformation

Generation of Transgenic C. elegans by Biolistic Transformation

Generering av Transgena C. elegans Genom Biolistic Transformation

The number of laboratories using the free living nematode C. elegans is rapidly growing. The popularity of this biological model is attributed to a rapid ...

Imaging C. elegans Embryos using an Epifluorescent Microscope and Open Source Software

Imaging C. elegans Embryos using an Epifluorescent Microscope and Open Source Software

Imaging C. elegans Embryon med en Epifluorescent Mikroskop och Open Source Software

Cellular processes, such as chromosome assembly, segregation and cytokinesis,are inherently dynamic. Time-lapse imaging of living cells, using ...

Determining Genetic Expression Profiles in C. elegans Using Microarray and Real-time PCR

Determining Genetic Expression Profiles in C. elegans Using Microarray and Real-time PCR

Fastställande genuttryck profiler i C. elegans Använda Microarray och Real-time PCR

Synapses are composed of a presynaptic active zone in the signaling cell and a postsynaptic terminal in the target cell. In the case of chemical synapses, ...

RNAi Screening to Identify Postembryonic Phenotypes in C. elegans

RNAi Screening to Identify Postembryonic Phenotypes in C. elegans

RNAi screening identifiera Postembryonic fenotyper i C. elegans</em

C. elegans has proven to be a valuable model system for the discovery and functional characterization of many genes and gene pathways1. More sophisticated ...

C. elegans Chemotaxis Assay

C. elegans Chemotaxis Assay

C. elegans kemotaxianalys

Many organisms use chemotaxis to seek out food sources, avoid noxious substances, and find mates.  Caenorhabditis elegans has impressive chemotaxis ...

An Anoxia-starvation Model for Ischemia/Reperfusion in C. elegans

An Anoxia-starvation Model for Ischemia/Reperfusion in C. elegans

En Anoxia-svält modell för ischemi / reperfusion i<em&gt; C. elegans</em

Protocols for anoxia/starvation in the genetic model organism C. elegans simulate ischemia/reperfusion. Worms are separated from bacterial food and placed ...

Methods for Skin Wounding and Assays for Wound Responses in C. elegans

Methods for Skin Wounding and Assays for Wound Responses in C. elegans

Metoder för Skin såra och Analyser för Wound-svar i<em&gt; C. elegans</em

The C. elegans epidermis and cuticle form a simple yet sophisticated skin layer that can repair localized damage resulting from wounding. Studies of wound ...

Methods to Assess Subcellular Compartments of Muscle in C. elegans

Methods to Assess Subcellular Compartments of Muscle in C. elegans

Metoder för att bedöma Subcellulära Fack för Muscle in<em&gt; C. elegans</em

Muscle is a dynamic tissue that responds to changes in nutrition, exercise, and disease state. The loss of muscle mass and function with disease and age ...