Name: antibody staining in c. elegans using &quot;freeze-cracking&quot;
Uploaded: 2013-10-14T21:15:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Antibody Staining in C. Elegans Using "Freeze-Cracking" at JoVE.com

Fonlama NSF CCLI # 0633618 ve Ohio Üniversitesi tarafından sağlandı. Bazı suşları Caenorhabditis Genetiği Merkezi tarafindan temin edilmiştir. Lisansüstü öğrenci Reetobrata Basu video görüntülenir.

NOT: Birden fazla protokol adımları set-up ve deney özel koşullarına bağlı olarak hazırlanması için seçenekleri ile sunulmaktadır. Bu gibi durumlar için, alternatif adımlar alternatif adımlar Protokol, Şekil 1 &#39;de ana hatları ile A, B, C, vb olarak sunulmuştur. 1.. Polilisin Kaplı Slaytlar hazırlanması Slaytlar üç farklı hazırlama, göreceli yapışma ve antikorun spesifik olmayan bağlanma kolaylığı arasın...

<ol>
	<li>Harlow, E., Lane, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Antibodies: A Laboratory Manual. , (1988).</li><li>Mello, C., Fire, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+Transformation.">DNA Transformation.</a> Methods Cell Biol. 48, 451-482 (1995).</li><li>Boulin, T., Etchberger, J. F., Hobert, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reporter+gene+fusions.">Reporter gene fusions.</a> WormBook. , (2006).</li><li>Duerr, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunohistochemistry.">Immunohistochemistry.</a> WormBook. , (2006).</li><li>Finney, M., Ruvkun, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+unc-86+gene+product+couples+cell+lineage+and+cell+identity+in+C.+elegans.">The unc-86 gene product couples cell lineage and cell identity in C. elegans.</a> Cell. 63, 895-905 (1990).</li><li>Garriga, G., Desai, C., Horvitz, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+interactions+control+the+direction+of+outgrowth,+branching+and+fasciculation+of+the+HSN+axons+of+Caenorhabditis+elegans.">Cell interactions control the direction of outgrowth, branching and fasciculation of the HSN axons of Caenorhabditis elegans.</a> Development. 117, 1071-1087 (1993).</li><li>Miller, D. M., Shakes, D. C., Epstein, H. F., Shakes, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunofluorescence+microscopy.">Immunofluorescence microscopy.</a> Caenorhabditis elegans: Modern Biological Analysis of an Organism. , 365-394 (1995).</li><li>Crittenden, S. L., Troemel, E. R., Evans, T. C., Kimble, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GLP-1+is+localized+to+the+mitotic+region+of+the+C.+elegans+germ+line.">GLP-1 is localized to the mitotic region of the C. elegans germ line.</a> Development. 120, 2901-2911 (1994).</li><li>Strome, S., Wood, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunofluorescence+visualization+of+germ-line-specific+cytoplasmic+granules+in+embryos,+larvae,+and+adults+of+Caenorhabditis+elegans.">Immunofluorescence visualization of germ-line-specific cytoplasmic granules in embryos, larvae, and adults of Caenorhabditis elegans.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 79, 1558-1562 (1982).</li><li>Albertson, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Formation+of+the+first+cleavage+spindle+in+nematode+embryos.">Formation of the first cleavage spindle in nematode embryos.</a> Dev. Biol. 101, 61-72 (1984).</li><li>Harlow, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Using Antibodies: A Laboratory Manual. , (1999).</li><li>Ahringer, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reverse+Genetics.">Reverse Genetics.</a> WormBook. , (2006).</li></ol>

Dondurularak-kırma protokol C antikor lekelemesi için çeşitli yöntemlerden biridir elegans. Bu solucanlar leke için nispeten basit bir yol sağlar, ancak belirli reaktifler gerektiren ve optimum sonuçlar için pratik yapar. (Şekil 1&#39;de) Kritik adımlar şunlardır: 1) slayt hazırlama () adım 3 (bkz. adım 2 ve 3) hızlı tespiti (bkz. adım 1 ve nematod 2) elle sıkıştırma bkz. İlk olarak, slaytlara nematodların yapışmasını en üst düzeye çıkarmak için, bunun...

Proteinlerin hücre ve hücre içi lokalizasyonu belirlemek için, bilim adamları, belirli geleneksel özellikle 1 proteinleri tanıyan seçilmiş antikorlar ile dokuların etiketli var. C gibi bazı model organizmalar elegans, antikor boyama, genellikle daha hızlı sonuç moleküler genetik teknikler ile değiştirilmiştir. Bunlar, promotör ve ilgi ve yeşil floresan protein geninin kodlama bölgeleri arasında gen füzyonlarının oluşan yapıları ile transforme organizmaları içerir. Bununla birlikte, moleküler teknikler doğru promotör ve yüksek kopya sayısında (C. elegans alışılmış teknikler) 2,3 at yapıları ifadesindeki değişiklikler bilerek ile ilgili sorunlar gibi eşyaların, bir dizi tabidir. Bu nedenle, antikorlarla boyama in vivo protein işlevi araştırmalarında pek çok bilim adamı için bir hedef olmaya devam etmektedir. Antikorları ile dokular boyandığında, zor olabilir çünkü birantikorlarının verilmesinin sadece belirli bir konformasyonda 1 kendi antijeni tanıyabilir. Örneğin, antikorlar belirli bir şekilde sabit, sadece denatüre ya da sağlam antijeni tanıyabilir ve yerinde antijeni tanımayabilir. Nematod antikor lekelenme problemi nematodun kütikül dokulara antikor erişimi engelleme, nispeten geçirimsiz bir bariyer oluşturur gerçeği ile daha da artmaktadır. C. antikor lekeleme için kullanılan birkaç farklı yöntem vardır elegans (önceki çalışmaları gözden 4). Sağlam leke &#39;solucan&#39; yöntemleri donma ve nispeten sert sabitleştirici (formaldehit ya da glutaraldehit) olarak çözülme geliştirildi; donma-çözülme döngüleri sabitleyici 5 hızlı nüfuz etmesini sağlamak için manikür çatlamak yardımcı. Yöntem maddeler, kolajenaz ya da her ikisi 5-7 azaltılması ile tedavisi dahil, tespit edildikten sonra, kütikül antikorun girmesine izin vermek üzere permeabilize edilmiştir. Bu treatments morfolojisi korunmuş, ancak genellikle antikor tanınmasını azalır ya da yok. Alternatif yöntemler, antikor girmesine izin vermek üzere diseksiyon 8 içerir. &quot;Freeze-kırma&quot; Antikor 9-10 boyama sağlamak için yarı sağlam solucan iç kısmına erişmek için bir yoldur. Kollajenaz ve azaltma tedavisini kaçınarak Freeze-çatlama tespit çeşitli koşullar ile yapılabilir. Nematodlar, iki yapıştırıcı slaytlar arasında yerleştirilmiş dondurulur ve daha sonra slaytlar ayrılır, alt slayt üzerinde nematod çoğu ve üst kızak üzerindeki kütikül çok ayrılıyor. Alt sürgü sabitleyici yerleştirilebilir ve yapışık nematodlar ile tüm kaydırma antikor lekeleme prosedürü aracılığıyla aktarılır. Yöntem mevcut iki büyük zorluklar yok. İlk olarak, bu ciddi bunları deforme olmadan nematod bölmek için gerekli olan basınç, doğru miktarda uygulamak zordur. İkinci olarak, solucanların çok s olmazya slayt kene ve sabitleştirici veya durular kaybolur. Ancak, uygun slaytlar ve uygulama ile, yöntem, hızlı bir şekilde tespit ediciler ve antikorların çeşitli kullanılabilir makul bir morfolojisi olan nematodlar verecektir. Yöntem, deneyci amacına bağlı olarak, biraz değiştirilebilir. Tek bir nematod boyama (örneğin, tek bir transformant antikoru boyamasını değişmiş olup olmadığını belirlemek için) isteniyorsa, o zaman maksimum yapışma ile slaytlar (ancak yüksek bir arka plan boyaması) (aşağıya bakınız) bu tür ilave polilisin ile laboratuarda hazırlanmış slaytlar olarak kullanılabilir. Nematodlar, bu tespitler sonra polilisin daha zayıf bağlı Başlangıcı formaldehid veya glutaraldehid tespit için, daha yüksek bir yapışma slaytlar (laboratuar hazırlanan slaytlar polilisin) kullanılmalıdır. Vahşi tip nematodları, metanol ve / veya aseton ile tespit edilmektedir, daha sonra daha düşük bir yapışma özelliğine sahip slaytlar ve alt arka plan boyaması kullanılmalıdır (ticari veya l) slaytlar aboratory hazırlanmış. Antikorlar ve fiksatif çeşitli laboratuarda kullanılıyorsa, slaytlar bir seçim vaktinden önce hazırlanabilir ve gerekli olana kadar saklanır. Nematod dokuya erişim elde edilmiştir sonra, antikor, boyama işlemleri (daha uzun dokuların karakteristik inkubasyon yerine hücreleri 1,11) ile standart yöntemler takip edin.

<table border="1">
		<tbody>
		 <tr>
			<td>Name of Reagent/Material</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>poly-L-lysine slide (ESCO brand)</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>12-545-78</td>
			<td>Sigma brand slides also suitable</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>poly-L-lysine hydrobromide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P1524</td>
			<td>IMPORTANT: Brand and high molecular weight of polylysine critical</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>single frosted edge slides</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>48312-002</td>
			<td>Other brands are suitable</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>sodium azide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S2002-25G</td>
			<td>TOXIC, wear gloves and mask while weighing out powder to make 10% stock. Wear gloves when pipeting stock solution</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>coplin staining jar</td>
			<td>VWR</td>
			<td>47751-792</td>
			<td>Other brands are suitable</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>5-slide mailer</td>
			<td>Electron Microscopy Science</td>
			<td>71549-01</td>
			<td>One of many different brands of small slide holder, suitable for staining</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>VWR</td>
			<td>MK262159</td>
			<td>IMPORTANT: Regular formalin solutions (37% formaldehyde) are NOT suitable. Either 1) Dissolve crysatlaline paraformaldehyde in phosphate buffer and store in small aliquots frozen. Or 2) buy electron microscopy grade paraformaldehyde in aliquots. TOXIC -wear gloves; dispose of excess down sink with water.</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Glutaraldehyde solution, 25% in water</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G 5882</td>
			<td>IMPORTANT: purchase electron microscopy grade glutaraldehyde in ampules; TOXIC -wear gloves; dispose of excess down sink with water.</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>VWR</td>
			<td>EM-9410</td>
			<td>Other brands are suitable</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>ICN820451</td>
			<td>Other brands are suitable</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Donkey Serum, lyophilized</td>
			<td>Jackson Immunoresearch</td>
			<td>017-000-121</td>
			<td>Other brands are suitable</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Cy3 Donkey anti-Mouse IgG multi-labeling</td>
			<td>Jackson Immunoresearch</td>
			<td>715-165-150</td>
			<td>This company is recommended for high quality multi-label (affinity depleted) antibodies. Select appropriate dye and antigen (animal used to raise primary antibody). </td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>n-propyl gallate</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>ICN10274750</td>
			<td>Other brands are suitable</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>DAPI, 4',6'-diamidino-2-phenylindole dihydrochloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D 9542</td>
			<td>TOXIC. Wear gloves and dispense into small aliquots and feeze to minimize exposure</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Whatman #1 15 cm diameter filters</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>09805G</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Coverslip #1 1/2 rectangle 24 x 60 mm</td>
			<td>VWR</td>
			<td>48393-252</td>
			<td>#1 1/2 thickness is optically best</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Microscope slide folder</td>
			<td>VWR</td>
			<td>48429-092</td>
			<td>Other brands are suitable</td>
		 </tr>
		</tbody>
 </table>

antibody staining in c. elegans using &quot;freeze-cracking&quot;

C leke antikorlar ile elegans, nispeten geçirimsiz manikür kimyasal veya mekanik yöntemlerle atlanmalıdır. &quot;Freeze-çatlama&quot; fiziksel, iki yapışık slaytlar arasındaki nematod sıkıştırarak onları dondurma, ve ayrı slaytlar çekerek nematodlardan manikür çekmek için kullanılan bir yöntemdir. Dondurarak çatlama kimyasal muamele olmadan dokulara erişmek için basit ve hızlı bir yol sağlar ve fiksatif çeşitli kullanılabilir. Ancak, bu örneklerin birçok kaybına yol açar ve gerekli sıkıştırma mekanik olarak örnek deforme eder. Pratikte iyi bir morfolojisi olan numunelerin kurtarma en üst düzeye çıkarmak için gereklidir. Dondurarak çatlama özel sabitleme koşulları, numune kazanımı veya düşük spesifik olmayan boyama için optimize edilmiş, ancak tüm parametreler için aynı anda olabilir. Çok sert sabitleme koşulları gerektiren ve kimyasal manikür permeabilize için gerekli kimyasal tedaviler, Arıtma tahammül antikorlarınçözelti içinde sağlam nematodların t tercih edilebilir. Antikor hafif bir düzeltme gerektiren veya optimum sabitleme koşulları bilinmediği takdirde, dondurularak çatlama hızlı bir antikor ve tahlil, ilgi konusu antijen için spesifik hücre içi ve hücre lokalizasyonu bilgi verebilir çok yararlı bir şekilde kalmasını sağlar.

Solucanlar düzgün, sıkıştırılmış kırık ve hafif sabit tutulduğunda, hemen hemen tüm solucan (bkz. Şekil 2) antikor boyama için erişilebilir olabilir. DAPI lekelemesi ile gösterildiği gibi çekirdek konumu solucanın parçaları solucanlar formaldehit gibi daha sert bir sabitleyici, tâbi tutulduğu zaman en doğal olmayan dalgalı görünümü ile görüldüğü gibi, solucan morfolojisi (bozulabilir sağlam olduğu gösterilmektedir Şekil 3A-D kas). Başka bir yaygı...

Watch this Scientific Journal Video about Antibody Staining in C. Elegans Using "Freeze-Cracking" at JoVE.com

Antibody Staining in C. Elegans Using "Freeze-Cracking"

Antikor boyamasında<em&gt; C. Elegans</em&gt; &quot;Freeze-Cracking kullanma&quot;

&quot;Freeze-kırma,&quot; nematod C iç dokuları sergilemek için bir yöntem protein lokalizasyonu için antikorlara elegans, gösterilmiştir.

To stain C.  elegans with antibodies, the relatively impermeable cuticle must be  bypassed by chemical or mechanical methods.  "Freeze-cracking" is one ...

Research

JoVE Journal

Biology

Antibody Staining in C. Elegans Using &quot;Freeze-Cracking&quot;

Generation of Stable Transgenic C. elegans Using Microinjection

Mikroenjeksiyon Kararlı Transgenik C. elegans Üretimi

Transgenic Caenorhabditis elegans can be readily created via microinjection of a DNA plasmid solution into the gonad 1.  The plasmid DNA rearranges to ...

Method for Whole Mount Antibody Staining in Chick

Chick Tüm Dağı Antikor Boyama Yöntemi

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ...

Generation of Transgenic C. elegans by Biolistic Transformation

Generation of Transgenic C. elegans by Biolistic Transformation

Transgenik, Üretimi C. elegans Biyolistik Dönüşüm

The number of laboratories using the free living nematode C. elegans is rapidly growing. The popularity of this biological model is attributed to a rapid ...

Imaging C. elegans Embryos using an Epifluorescent Microscope and Open Source Software

Imaging C. elegans Embryos using an Epifluorescent Microscope and Open Source Software

Görüntüleme C. elegans Embriyolar Epifluorescent Mikroskop ve Açık Kaynak Yazılım

Cellular processes, such as chromosome assembly, segregation and cytokinesis,are inherently dynamic. Time-lapse imaging of living cells, using ...

Determining Genetic Expression Profiles in C. elegans Using Microarray and Real-time PCR

Determining Genetic Expression Profiles in C. elegans Using Microarray and Real-time PCR

Genetik İfade Profilleri Belirlenmesi C. elegans Mikroarray ve Real-time PCR

Synapses are composed of a presynaptic active zone in the signaling cell and a postsynaptic terminal in the target cell. In the case of chemical synapses, ...

RNAi Screening to Identify Postembryonic Phenotypes in C. elegans

RNAi Screening to Identify Postembryonic Phenotypes in C. elegans

Içinde Postembryonic Fenotiplerin Belirleme RNAi Tarama C. elegans</em

C. elegans has proven to be a valuable model system for the discovery and functional characterization of many genes and gene pathways1. More sophisticated ...

C. elegans Chemotaxis Assay

C. elegans Chemotaxis Assay

C. elegans Kemotaksis Deneyi

Many organisms use chemotaxis to seek out food sources, avoid noxious substances, and find mates.  Caenorhabditis elegans has impressive chemotaxis ...

An Anoxia-starvation Model for Ischemia/Reperfusion in C. elegans

An Anoxia-starvation Model for Ischemia/Reperfusion in C. elegans

Iskemi / reperfüzyon içinde bir anoksisi-açlık Modeli<em&gt; C. elegans</em

Protocols for anoxia/starvation in the genetic model organism C. elegans simulate ischemia/reperfusion. Worms are separated from bacterial food and placed ...

Methods for Skin Wounding and Assays for Wound Responses in C. elegans

Methods for Skin Wounding and Assays for Wound Responses in C. elegans

Içinde Yara Yanıtları Cilt yaralayarak Yöntemleri ve Testler<em&gt; ° C. elegans</em

The C. elegans epidermis and cuticle form a simple yet sophisticated skin layer that can repair localized damage resulting from wounding. Studies of wound ...

Methods to Assess Subcellular Compartments of Muscle in C. elegans

Methods to Assess Subcellular Compartments of Muscle in C. elegans

Yöntemler içinde Muscle hücrealtı Kompartmanları DeğerlendirecekÜSKÜP<em&gt; ° C. elegans</em

Muscle is a dynamic tissue that responds to changes in nutrition, exercise, and disease state. The loss of muscle mass and function with disease and age ...