Name: production of large numbers of size-controlled tumor spheroids using microwell plates
Uploaded: 2013-11-18T20:00:00
Duration: 10 min 44 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Production of Large Numbers of Size-controlled Tumor Spheroids Using Microwell Plates at JoVE.com

وقد تم تمويل هذا العمل من قبل جامعة كالغاري، في ظل بدء المحقق منحة جديدة للدكتور Ungrin.

ملاحظة: هي لوحات Microwell متوفرة في أشكال مختلفة، اعتمادا على النتائج المرجوة. وتظهر المواصفات فضلا عن المبادئ التوجيهية تقريبي للأرقام الحد الأدنى والحد الأقصى من الخلايا التي ينبغي أن تستخدم مع كل شكل في الجدول 1. وmicrowells أصغر تفتق إلى نقطة حادة، وبالتالي ليس هناك حد أدنى حجم، على الرغم من التباين بين الأجسام الشبه الكروية يصبح أكثر أهمية في أحجام أصغر. الإنتاج الروتيني للالكروية من متوسط ​​اقل من 20 خلايا لكل واضح ومباشر 8. لم يتم مدبب حجم أكبر microwell بالكامل، لذلك يحاول تشكيل الأجسام الشبه الكروية من أعداد صغيرة من الخلايا قد يؤدي إلى أصغر الأجسام الشبه الكروية متعددة في كل microwell. بسبب اختلافات طفيفة في خصائص السطح، وإعداد مع الحل السطحي (الخطوة 1.2) ليست اختيارية عند استخدام لوحات AggreWell 400Ex. ويستند هذا البروتوكول على استخدام AggreWell 400 لوحات - لغيرها من الأشكال سلبياتULT الجدول 1. يتم تحديد عدد الخلايا ليتم تحميلها في كل بئر عن طريق ضرب عدد من microwells أنه يحتوي على عدد من الخلايا لتكون متفاوت لكل كروي. على سبيل المثال، لتوليد الأجسام الشبه الكروية من 1000 خلية لكل منهما، يجب أن يتم تحميل كل بئر مع (1،200 مرات الكروية 1،000 خلايا لكل =) 1.2 × 10 6 خلايا. يجب أن تحسب كثافة الخلية نظرا إلى أن الخلايا سيتم تحميلها في حجم 0.4 مل. وذلك لمثال الكروية شكلت من 1000 خلية لكل منهما، 1.2 × 10 6 خلايا في 0.4 مل يترجم إلى كثافة 3 × 10 6 خلايا لكل مل. 1. تستعد لاستقبال خلايا Microwells <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لوحات Microwell هي عقيمة على النحو المنصوص عليه، ويجب إزالة فقط من عبواتها في بيئة معقمة مثل الوزراء للسلامة الأحيائية الصفحي تدفق. ينبغي الحفاظ على العقم في جميع أنحاء البروتوكول. يجب أن يتعرض للخطر العقم، وresterilized الآبار باستخدام الايثانول 70٪ في استخدام المياهالخطوات التالية اختيارية. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 0.5 مل من الايثانول 70٪ إلى كل بئر غير المستخدمة. بعض microwells سوف فقاعات الهواء فخ، على الرغم من أن هذا يمكن أن يخفض بإضافة السائل في جانب واحد، والسماح لها تنتشر عبر السطح، بدلا من إسقاطه عموديا على السطح. استبدال الغطاء. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بينما بخار الإيثانول يجب تتخلل بسرعة أي فقاعات، وإذا كانت هناك أعداد كبيرة قد يكون من المرغوب فيه لإزالتها. أجهزة الطرد المركزي لمدة 2 دقيقة في 2،000 ز س. لاحظ أنه من المهم لضمان متوازنة الدوار بشكل صحيح في هذه السرعة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قد أزيلت باستخدام مجهر مقلوب منخفضة التكبير، تحقق من فقاعات من microwells. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان لمدة 5 دقائق مع غطاء على في درجة حرارة الغرفة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نضح الإيثانول. ويمكن الآن أن تغسل لوحة مع الماء المعقم أو برنامج تلفزيوني للاستخدام الفوري، أو تجفف الهواء للتخزين. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> من أجل ضمان أن الخلايا لا تتفاعل مع سطح microwell، قد يكون مستعدا باستخدام بالسطح. بشكل عام هومن المستحسن أن تنفيذ هذه الخطوة في البداية، وبعد ذلك مقارنة الكروية ولدت مع وبدون microwells المغلفة بالسطح. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 0.5 مل من محلول الشطف إلى كل بئر. بعض microwells سوف فقاعات الهواء فخ، على الرغم من أن هذا يمكن أن يخفض بإضافة السائل في جانب واحد، والسماح لها تنتشر عبر السطح، بدلا من إسقاطه عموديا على السطح. استبدال الغطاء. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أجهزة الطرد المركزي لمدة 2 دقيقة في 2،000 x ج لإزالة الفقاعات. لاحظ أنه من المهم لضمان متوازنة الدوار بشكل صحيح في هذه السرعة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قد أزيلت باستخدام مجهر مقلوب منخفضة التكبير، تحقق من فقاعات من microwells. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان لمدة ثلاثين دقيقة على الأقل مع غطاء على في درجة حرارة الغرفة، أو بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية. قد يتم تخزين لوحات في أربع درجات مع الحل السطحي في الآبار لحين الحاجة إليها إذا محكمة الغلق لمنع الجفاف. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> غسل لوحة مع الماء المعقم أو برنامج تلفزيوني على الفور قبل استخدامها. لا تسمح لوحاتلتجف بعد الطلاء. </li></ol></li></ol> 2. إعداد خلايا ملاحظة: إن تفاصيل إعداد الخلايا تختلف إلى حد ما مع نوع من الخلايا المحددة التي تجري دراستها. ومع ذلك لاحظنا هذه الشروط أن تكون فعالة مع طائفة واسعة من الخلايا، بما في ذلك خطوط مناقشتها هنا، وكذلك الخلايا الجذعية الجنينية البشرية والفئران (ESC)، والخلايا الجذعية المحفزة التي يسببها الإنسان (التوجيهية)، الخلايا الليفية، الأديم البدائية المفترضة، والخلايا اللحمية. استخدمت مجموعات أخرى هذا النظام بنجاح لمجموعة واسعة من التطبيقات بما في ذلك تكون الغضروف من الخلايا الجذعية الوسيطة 9، الجيل موحدة السلائف العصبية من الخلايا الجذعية المحفزة 10، تحليلات السمية في خلايا الكبد 11 وتقييم تجديد النخاع الشوكي في السلمندر 12. يظهر بروتوكول معين للعمل مع خلايا HT29 هنا. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تبدأ مع قارورة T75 الخلايا HT29، المثقف في DMEM+ 10٪ FBS </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نضح المتوسطة النمو من القارورة، وإضافة 3 مل من التربسين. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان الخلايا لمدة 5 دقائق عند 37 درجة مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وقف التربسين الهضم بإضافة 3 مل من النمو المتوسط. اتخاذ قسامة لعد الخلايا ونقل ما تبقى في أنبوب الطرد المركزي 15 مل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أجهزة الطرد المركزي لمدة 5 دقائق في 200 × ز. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في حين أن الطرد المركزي في التقدم، عد الخلايا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نضح التربسين / خليط المتوسطة واستبدالها مع متوسط ​​نمو جديدة، وحجم تحددها كثافة الخلية المطلوبة والمحسوبة أعلاه. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> (اختياري) تمرير تعليق الخلية من خلال مصفاة من أجل إزالة أي كتل. ملاحظة: ظروف الحصاد خلية سوف تختلف نوعا ما بين السطور. إذا كان البروتوكول تفارق لمثل الركض الخلايا من الفائدة المتاحة، التي ينبغي أن تستخدم كنقطة انطلاق. مع استخدام خطوط الخلايا الحساسة من التربسين قد يؤدي إلى موت الخلايا المفرطة. في هذه الحالات لاحظنا نتائج جيدة باستخدام TrypLE باعتبارها dissociati البديلةعلى كاشف 8. إذا كانت الخلايا تصبح تجمعت خلال التفكك وتفقد قدرتها على البقاء، إضافة إلى الدناز الحل الانزيم قد حل هذه. يمكن خفض أوقات التفكك وتوظيف خطوة سحن لتفريق كتل الخلايا أيضا زيادة قدرتها على البقاء. </li></ol> 3. تشكيل كروي ملاحظة: قد يتم إنشاء الأجسام الشبه الكروية في مجموعة متنوعة من الصيغ المتوسطة، ينبغي إجراء محاكمات ولكن الأولي خارج باستخدام المتوسطة التي كانت الخلايا المستزرعة، للتمييز عواقب التحول إلى نظام الثقافة 3 الابعاد من عواقب تغيير التركيبة المتوسطة. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 0.4 مل من النمو المتوسط ​​إلى كل بئر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أجهزة الطرد المركزي لمدة 2 دقيقة في 2،000 x ج لإزالة الفقاعات. لاحظ أنه من المهم لضمان متوازنة الدوار بشكل صحيح في هذه السرعة قبل الطرد المركزي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قد أزيلت باستخدام مجهر مقلوب منخفضة التكبير، تحقق من فقاعات من microwells. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 0.4 ملتعليق خلية في الكثافة المطلوبة (يحسب أعلاه). المزيج بلطف pipetting صعودا وهبوطا، دون إدخال فقاعات الهواء إلى microwells. فمن المهم للتأكد من أن الخلايا توزع بالتساوي في جميع أنحاء البئر، من أجل الحصول على الأجسام الشبه الكروية متسقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أجهزة الطرد المركزي لمدة 5 دقائق في 200 × ز. إذا ما كانت لوحة يست على مستوى الذات أثناء الطرد المركزي، قد تنشأ تيارات الحمل الحراري التي تؤدي إلى التوزيع غير المتكافئ للخلايا عبر microwells. لذلك، ينبغي أن تكون متوازنة لوحة داخليا وكذلك ضد لوحة أخرى، بحيث يتم توزيع الوزن بالتساوي على كلا الجانبين من لوحة الناقل. </li></ol> ملاحظة: إذا كان يعتبر دليلا على التوزيع غير المتكافئ الخلية، قد يكون من الضروري تطبيق كمية صغيرة من تزييت إلى النقاط المحورية على الناقل لوحة - التشاور مع الشركة المصنعة للأجهزة الطرد المركزي للحصول على تعليمات. ملاحظة: مرة واحدة وقد تم طرد الخلايا في microwells، فهي المقاومات معقولتانت لغسل الخروج من الاقتراحات بسيطة من لوحة. وينبغي تجنب الحركات المفاجئة التي تؤدي إلى الخوض في المتوسط، ولكن نقل لوحة من أجهزة الطرد المركزي إلى المجهر أو الحاضنة لا ينبغي أن يؤدي إلى تشريد خلية كبيرة. <ol start="6" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستخدام مجهر مقلوب، تحقق من أن الخلايا قد تتجمع داخل microwells، وأنها توزع بالتساوي في جميع أنحاء البئر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستخدام مجهر مقلوب، ومراقبة عملية تشكيل كروي. وبعض خطوط الخلايا تشكيل الأجسام الشبه الكروية التعاقد في غضون 24 ساعة، والبعض الآخر قد يستغرق وقتا أطول. يظهر تطور من مجموعة لتجميع الخلايا في HT29 في الشكل 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استعادة الكروية من microwells ونقل إلى الثقافة والتعليق من النفث بها بلطف مع ماصة. بدلا من ذلك، الحفاظ على الأجسام الشبه الكروية في الموقع مع استبدال المتوسطة 8 - ومدة يعتمد على حجمها الأولي ومعدل النمو، الذي مواطنهالمعهد الوطني للإحصاء الوقت حتى تتفوق على microwells التي تم تشكيلها. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ليحل محل المتوسطة دون أن تفقد الكروية والمتوسطة نضح على حافة البئر باستخدام ماصة باستور. جلب ببطء غيض أسفل حتى يبدأ في رسم السائل من الغضروف المفصلي، واتبع الغضروف المفصلي على النحو ينخفض. ثم تضاف متوسطة جديدة ضد الجدار جيدا في نفس المكان. قد يتم فقدان بضعة الكروية، ولكن إذا ويستنشق المتوسطة دائما واستبدالها في نفس الموقف، وهذا العدد لا تزال صغيرة بالمقارنة مع أعداد كبيرة في البئر. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Hirschhaeuser, F., Menne, H., Dittfeld, C., West, J., Mueller-Klieser, W., Kunz-Schughart, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multicellular+tumor+spheroids:+An+underestimated+tool+is+catching+up+again.">Multicellular tumor spheroids: An underestimated tool is catching up again.</a> Journal of Biotechnology. 148 (1), 3-15 (2010).</li><li>Sherar, M. D., Noss, M. B., Foster, F. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrasound+backscatter+microscopy+images+the+internal+structure+of+living+tumour+spheroids.">Ultrasound backscatter microscopy images the internal structure of living tumour spheroids.</a> Nature. 330 (6147), 493-495 (1987).</li><li>Foty, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Simple+Hanging+Drop+Cell+Culture+Protocol+for+Generation+of+3D+Spheroids.">A Simple Hanging Drop Cell Culture Protocol for Generation of 3D Spheroids.</a> J. Vis. Exp. (51), 2720 (2011).</li><li>Naber, H. P. H., Wiercinska, E., Ten Dijke, P., Van Laar, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spheroid+Assay+to+Measure+TGF-&#946;-induced+Invasion.">Spheroid Assay to Measure TGF-&#946;-induced Invasion.</a> J. Vis. Exp. (57), e3337 (2011).</li><li>Ungrin, M. D., Joshi, C., Nica, A., Bauwens, C., Reproducible Zandstra, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ultra+high-throughput+formation+of+multicellular+organization+from+single+cell+suspension-derived+human+embryonic+stem+cell+aggregates.">ultra high-throughput formation of multicellular organization from single cell suspension-derived human embryonic stem cell aggregates.</a> PLoS ONE. 3 (2), e1565 (2008).</li><li>Bauwens, C. L., Song, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Geometric+control+of+cardiomyogenic+induction+in+human+pluripotent+stem+cells.">Geometric control of cardiomyogenic induction in human pluripotent stem cells.</a> Tissue Engineering. Part A. 17 (15-16), 1901-1909 (2011).</li><li>Bratt-Leal, A. M., Carpenedo, R. L., Ungrin, M. D., Zandstra, P. W., McDevitt, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Incorporation+of+biomaterials+in+multicellular+aggregates+modulates+pluripotent+stem+cell+differentiation.">Incorporation of biomaterials in multicellular aggregates modulates pluripotent stem cell differentiation.</a> Biomaterials. 32 (1), 48-56 (2011).</li><li>Ungrin, M. D., Clarke, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rational+bioprocess+design+for+human+pluripotent+stem+cell+expansion+and+endoderm+differentiation+based+on+cellular+dynamics.">Rational bioprocess design for human pluripotent stem cell expansion and endoderm differentiation based on cellular dynamics.</a> Biotechnology and Bioengineering. 109 (4), 853-866 (2012).</li><li>Markway, B. D., Tan, G. K., Brooke, G., Hudson, J. E., Cooper-White, J. J., Doran, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+chondrogenic+differentiation+of+human+bone+marrow-derived+mesenchymal+stem+cells+in+low+oxygen+environment+micropellet+cultures.">Enhanced chondrogenic differentiation of human bone marrow-derived mesenchymal stem cells in low oxygen environment micropellet cultures.</a> Cell Transplantation. 19 (1), 29-42 (2010).</li><li>Kozhich, O., Hamilton, R., Mallon, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Standardized+Generation+and+Differentiation+of+Neural+Precursor+Cells+from+Human+Pluripotent+Stem+Cells.">Standardized Generation and Differentiation of Neural Precursor Cells from Human Pluripotent Stem Cells.</a> Stem Cell Reviews and Reports. , 1-6 (2012).</li><li>Fey, S. J., Wrzesinski, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+of+Drug+Toxicity+Using+3D+Spheroids+Constructed+from+an+Immortal+Human+Hepatocyte+Cell+Line.">Determination of Drug Toxicity Using 3D Spheroids Constructed from an Immortal Human Hepatocyte Cell Line.</a> Toxicological Sciences. , (2012).</li><li>Mchedlishvili, L., Mazurov, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconstitution+of+the+central+and+peripheral+nervous+system+during+salamander+tail+regeneration.">Reconstitution of the central and peripheral nervous system during salamander tail regeneration.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. , (2012).</li><li>Butler, C. M., Foty, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+Aggregate+Cohesion+by+Tissue+Surface+Tensiometry.">Measurement of Aggregate Cohesion by Tissue Surface Tensiometry.</a> J. Vis. Exp. (50), e2739 (2011).</li><li>Xu, K., Buchsbaum, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+Mammary+Epithelial+Cells+from+Three-dimensional+Mixed-cell+Spheroid+Co-culture.">Isolation of Mammary Epithelial Cells from Three-dimensional Mixed-cell Spheroid Co-culture.</a> J. Vis. Exp. (62), e3760 (2012).</li><li>Baraniak, P. R., Cooke, M. T., Saeed, R., Kinney, M. A., Fridley, K. M., McDevitt, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stiffening+of+human+mesenchymal+stem+cell+spheroid+microenvironments+induced+by+incorporation+of+gelatin+microparticles.">Stiffening of human mesenchymal stem cell spheroid microenvironments induced by incorporation of gelatin microparticles.</a> Journal of the Mechanical Behavior of Biomedical Materials. 11, 63-71 (2012).</li><li>Purpura, K. A., Bratt-Leal, A. M., Hammersmith, K. A., McDevitt, T. C., Zandstra, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systematic+engineering+of+3D+pluripotent+stem+cell+niches+to+guide+blood+development.">Systematic engineering of 3D pluripotent stem cell niches to guide blood development.</a> Biomaterials. , (2012).</li></ol>

الدكتور Ungrin لديه مصلحة مالية في التكنولوجيا AggreWell باعتباره مخترع.

أنشأنا نظاما قد يتم إنشاء أعداد كبيرة من الأجسام الشبه الكروية موحدة من خطوط الخلايا متعددة من مصادر مختلفة. لدينا حتى الآن لمواجهة خط خلية ملتصقة التي لا تشكل الأجسام الشبه الكروية في ظل هذه الظروف. لاحظنا سابقا في فقدان الخلية السكان عرضة للanoikis 5،8، ولكن حتى الآن لم تنشأ هذه المسألة مع خطوط الورم. هذا النظام هو تحجيم بشكل تعسفي مع مساحة السطح، مع السلوك متناسقة عبر microwells في 24 جيدا وشكل 6 جيدا، وكذلك المفاعلات الحيوية التي تحتوي على النموذج 50،000 microwells كل قيد التطوير في الوقت الحاضر. يجب كروي التماثل يكون مصدر قلق، ويمكن زيادة فترة حضانة في الخطوة 4.8 ليومين أو ثلاثة أيام. ويمكن أيضا أن المحتضنة الكروية لفترة بعد استخراج من microwells لزيادة التماثل، ولكن في هذه الحالة يجب توخي الحذر للحفاظ على كثافة منخفضة بما فيه الكفاية الثقافة، كما الكروية في اتصال مع واحد واي أخرىليرة لبنانية في كثير من الأحيان تندمج في الهياكل الأكبر حجما. لهذا السبب، حرصنا على الحفاظ سابقا الثقافات داخل microwells التي تشكلت المجاميع، مع الحد الأساسي هو حجم كروي. وهذا بدوره هو وظيفة كل من معدل النمو والحجم الأولي 8، وإذا تم التخطيط الثقافة تمديد داخل لوحة microwell، وهذا ينبغي النظر مقدما. وتشمل خيارات لمنع فرط، ينبغي أن يحدث، إما بدءا الكروية أصغر، أو توظيف microwells أكبر من لوحة AggreWell 800. يجب أن تفشل الكروية لزيادة في التماسك مع مرور الوقت، قد يكون سببا محتملا احدة موت الخلية. خاصة في المجاميع أكبر من الخلايا عملية الأيض نشطة للغاية، ويمكن قيود النقل الجماعي على إيصال الأوكسجين والمواد المغذية الضرورية يؤدي إلى نواة نخرية 2 - بالتالي كروي غير متماسكة قد يكون ببساطة نتيجة لموت الخلايا المفرطة. بدلا من ذلك، قياسات cohe الميكانيكيةوقد استخدمت سيون من الأجسام الشبه الكروية لتقييم القوات ملزمة بين الخلايا، في العلاقة مع المحتملة المتنقل من خط خلية معينة 13. سيكون من المثير للاهتمام أن التحقيق في العلاقة بين شكل كروي والمحتملة المتنقل، ربما باستخدام المعلمات المورفومترية مثل الاستدارة ومحيط لنسبة المساحة. بالإضافة إلى التحقيق في الخواص الميكانيكية والمورفومترية من الأجسام الشبه الكروية، والتجمع في النظام microwell يسمح الإنتاج على نطاق واسع من الأجسام الشبه الكروية مختلط تكوينها، تتألف من مزيج من أنواع خلايا متعددة و / أو المواد الحيوية 6،7. تفاعلات الخلايا السرطانية مع أنواع الخلايا الأخرى مهمة لنموذج أكثر عن كثب سلوك الأورام في الجسم الحي 14، وبالتالي فإنه قد يكون من مصلحة لتوليد الأجسام الشبه الكروية من الخلايا السرطانية في تركيبة مع الخلايا الليفية والخلايا البطانية، على سبيل المثال. ويمكن أيضا أن تدمج المجهرية الدقيقة لمختلف المواد الحيوية، ويمكن أن تؤثر على الإنتاج الاجتماعي للموئلخصائص eroid سواء بصورة مباشرة من خلال تفاعلها مع الخلايا 7،15، وكذلك خزانات للإفراج تسيطر عليها عوامل النمو والسيتوكينات في المناطق الداخلية من 16 كروي. إذا كان هناك أي قلق حول العقم، وعلى سبيل المثال عند العمل مع لوحة microwell التي سبق لها أن استخدمت بعض الآبار والتي قد أمضوا بعض الوقت في حاضنة كجزء من التجربة السابقة، يجوز resterilized الآبار مع الايثانول 70٪ في الماء. مرة واحدة وقد تم تشكيل الأجسام الشبه الكروية، كما انها قد تكون مفصولة من الخلايا الفردية المتبقية عن طريق تمرير تعليق على مصفاة الخلية. الخلايا الفردية سوف تمر من خلال، في حين سيتم الاحتفاظ الكروية. إذا اشتبه كروي من سفك خلايا يحتمل المنتشر على مدى ثقافة، قد يكون من المرغوب فيه أن تنفيذ هذا الإجراء عدة مرات - في البداية لإزالة الخلايا الفردية، وبالتالي إلى عزل purifieد السكان من الخلايا المنبعثة من الأجسام الشبه الكروية.

هناك مجموعة متزايدة من الأدلة على أن الخلايا السرطانية تتصرف بشكل مختلف في ثلاث ثقافات الأبعاد مما يفعلون عندما مثقف على البلاستيك، وأن العوامل العلاجية التي تم تحديدها على منصات الأنسجة الثقافة التقليدية قد تفقد فعاليتها عندما انتقلت إلى نظام أكثر من الناحية الفسيولوجية ذات الصلة 1. ولذلك فمن المستحسن أن دراسة سلوك الخلايا السرطانية في ظل هذه الظروف، وذلك لاكتساب نظرة ثاقبة البيولوجيا الكامنة وراءها، وأيضا لزيادة معدل نجاح الانتقال كلاء علاجية جديدة من مرفق الفرز إلى العيادة. نظام واحد نموذجا مفيدا مع تاريخ طويل توظف مجموعات ثلاثية الأبعاد للخلايا السرطانية المعروفة باسم الورم 1،2 الكروية. من الناحية المثالية، فإن التقنيات لتشكيل كروي يسمح إنتاج أعداد كبيرة من الأجسام الشبه الكروية موحدة حجمها وتكوينها يتم التحكم من قبل المجرب. في حين شنقا الإفلات وكذلك لوحة نهج 3،4 قادرون على تحقيق بعض هذه إعادةيتطلبه، الإنتاجية تقتصر عادة، وتوليد أعداد كبيرة من الأجسام الشبه الكروية يصبح مهمة كثيفة العمالة. وقد وضعنا مؤخرا نظاما لحل تحديات مماثلة في مجال الطب التجديدي 5. توظيف التجميع القسري ضمن سلسلة من المكتظ الآبار ميكرون النطاق (انظر الشكل 1)، وهذا النهج يسمح توليد الأجسام الشبه الكروية من أرقام التعسفي من الخلايا، بما في ذلك مخاليط من أنواع خلايا متعددة 6، فضلا عن إدماج مختلف المواد الحيوية 7. تتشكل الأجسام الشبه الكروية بأعداد كبيرة - الآلاف إلى مئات الآلاف أو أكثر - ويمكن استخراجها مباشرة أو الاحتفاظ بها في microwells التي تشكلت مع تبادل متوسطة لمدة واحد على الأقل 8 إلى اثنين (المراقبة غير منشورة) أسابيع. وبالتالي هي مناسبة هذا النظام بشكل جيد لتوليد أعداد كبيرة من الأجسام الشبه الكروية الورم موحدة وقابلة للتكرار لتقييم EFFEctiveness من وكلاء انتيتومور رواية أو التحقيقات البيولوجية الأساسية.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Name of Reagent/Material</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AggreWell 400 plate</td>
			<td>StemCell Technologies Inc.</td>
			<td>27845/27945</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rinsing Solution</td>
			<td>StemCell Technologies Inc.</td>
			<td>07010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell strainer (37 <span id="docs-internal-guid-263ae0a0-aa3d-bddd-2a36-2ae1901f1604" style="font-size:15px;font-family:Arial;color:#000000;background-color:#ffffff;font-weight:normal;font-style:normal;font-variant:normal;text-decoration:none;vertical-align:baseline;">&#181;m)</td>
			<td>StemCell Technologies Inc.</td>
			<td>27215</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>VWR / LONZA</td>
			<td>CA12001-676</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-Versene (EDTA)</td>
			<td>VWR / LONZA</td>
			<td>CA12001-660</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>VWR / LONZA</td>
			<td>CA12002-212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>VWR / LONZA</td>
			<td>CA-95042-112</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrypLE</td>
			<td>Invitrogen / Life Technologies</td>
			<td>12605010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted microscope</td>
			<td>VWR / Motic</td>
			<td>CA19000-610</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Allegra X15R centrifuge with carriers for standard well plates</td>
			<td>VWR / Beckman</td>
			<td>CABKA99465, CABK369704, CABK392806</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminar flow biosafety cabinet</td>
			<td>ESBE / Baker</td>
			<td>BKR-SG603AHEUVSP</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

production of large numbers of size-controlled tumor spheroids using microwell plates

يتم التعرف على نحو متزايد باعتبارها الكروية الورم في المختبر نموذجا هاما للسلوك الخلايا السرطانية في ثلاثة أبعاد. أكثر أهمية من الناحية الفسيولوجية من الثقافات ورقة ملتصقة التقليدية، فإنها ألخص أكثر دقة وتعقيد التفاعلات الموجودة في الأورام الحقيقي. من أجل تسخير هذا النموذج لتقييم أفضل لبيولوجيا الأورام، أو فعالية من وكلاء علاجية جديدة، فمن الضروري أن تكون قادرة على توليد الأجسام الشبه الكروية بتكاثر، في الطريقة التي تسيطر عليها وبأعداد كبيرة. ويتكون النظام من مجموعة AggreWell عالية الكثافة من microwells على شكل هرم، الذي يتم طرد تعليق خلايا مفردة. أعداد خلايا تجميع في الجزء السفلي من كل microwell، وعدد ونسبة من أنواع الخلايا متميزة تشارك تعتمد فقط على خصائص التعليق قدم من قبل المجرب. وبالتالي، فإننا قادرون على توليد الأجسام الشبه الكروية الورم من حجم التعسفي وتكوينها معمن الحاجة إلى تعديل منصة تكنولوجيا الأساسي. مئات microwells لكل سنتيمتر مربع من مساحة سطح الثقافة بدورها ضمان مستويات إنتاج مرتفعة للغاية يمكن تحقيقها من خلال عملية مكثفة nonlabor مباشرة. وبالتالي فإننا نتوقع أن هذا البروتوكول سوف يكون مفيدا على نطاق واسع للباحثين في مجال كروي الورم.

قد بسهولة أن تتولد الأجسام الشبه الكروية من خطوط الورم متعددة من أصول مختلفة واستخراج التشريحية في الثقافة الايقاف. الشكل 3 يوضح التحكم في حجم متسقة يمكن الحصول عليها عن طريق هذا الأسلوب، مع السكان كروي موحد للغاية تحت كل حالة. الخلافات خط واضح في السلوك واضحة أيضا، مع خلايا سرطان القولون HT29 وTE6 خلايا سرطان المريء تشكيل الأجسام الشبه الكروية المكتظ مع حدود محددة بشكل حاد، في حين أعطى الخلايا السرطانية LNCaP البروستاتا تؤدي إلى الكروية أقل تماسكا مع حدود غير منتظمة (انظر مناقشة لأسباب ممكن ). أدى القوى الداخلية أقوى في المجاميع أكثر تماسكا أيضا في انهيار إلى شكل أكثر توازنا حتى حين لا يزال في microwells التي تشكلت، في حين أن المجاميع LNCaP، لا سيما على حجم أكبر والاحتفاظ بها بشكل واضح هندسة مربع هرمي لل microwells. العلاقة بين أرقام خلية الإدخال وفيز<html> سوف حجم كال من كروي الناتجة تعتمد على عدد من المتغيرات. وربما يتم تخفيض كميات النظرية على أساس المنتج من حجم لكل خلية وعدد الخلايا التي تستخدمها فقدان الخلية، والتي بدورها قد تشمل فقدان الخلايا خلال مرحلة وحيدة الخلية تعليق، فضلا عن فقدان من المجاميع الصغيرة بشكل مفرط بسبب عدم كفاية أعداد الدول المجاورة، ومن المجاميع الكبيرة بشكل مفرط بسبب نقل القيود ونخر في قلب. كما تتأثر بأي حجم الانتشار التي قد تحدث أثناء عملية التجميع. كما سوف تختلف هذه المعايير من خط الخلية إلى خلية خط، إذا رغبت الكروية ذات الأبعاد المادية محددة يجب تحديد العدد الصحيح من الخلايا لإدخال تجريبيا. كما تقريب الأولى، ومن المتوقع أن يزيد مع الجذر التكعيبي لعدد من الخلايا أدرجت قطر كروي - على سبيل المثال بزيادة 8 أضعاف في عدد الخلايا ينبغي أن يؤدي إلى مضاعفة قطر كروي. <html> _content &quot;FO: المحافظة على together.within صفحة =&quot; دائما &quot;&gt; <img alt="الشكل 1" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50665/50665fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50665/50665fig1.jpg" /> الشكل 1. التخطيطي الإنتاج كروي. ويتكون النظام من microwell مجموعة من معبأة بإحكام مربع هرمي microwells (625 سم 2 في ل400 <span id="docs-internal-guid-263ae0a0-aa35-f9c7-69a1-8c5aa197db53" style="font-size:15px;font-family:Arial;color:#000000;background-color:#ffffff;font-weight:normal;font-style:normal;font-variant:normal;text-decoration:none;vertical-align:baseline;">μ حجم م)، في الخلايا التي قد تكون بالطرد المركزي. يتم إحضارها الخلايا معا عن طريق الجدران الجانبية المنحدرة، ويتم التحكم في حجم كروي الناجم عن كثافة متفاوتة من تعليق الخلية المستخدمة. 50665fig2highres.jpg &quot;سرك =&quot; / files/ftp_upload/50665/50665fig2.jpg &quot;/&gt; الشكل 2. تجميع خلايا عنقودية في الأجسام الشبه الكروية. وتم تشكيل الأجسام الشبه الكروية من سبعمائة HT29 خلايا لكل منهما. مباشرة بعد الطرد المركزي (A)، وتتجمع خلايا فضفاضة في الجزء السفلي من كل microwell. لاحظ أن مجموعات ويقابل بشكل موحد نحو أسفل اليمين في هذه الحالة. هذا مقبول بشرط تظل أحجام كتلة متناسقة عبر صفيف. إذا رأيت اختلافات حجم الكتلة كبيرا من جانب واحد من مجموعة إلى أخرى، انظر ملاحظة في الخطوة 3.5. بعد حضانة لمدة 24 ساعة (B)، تسببت قوات لاصقة بين الخلايا مجموعات لتجميع وتشكيل الأجسام الشبه الكروية متماسكة، والتي قد ثم يتم استخراج (C). <img alt="الرقم 3" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50665/50665fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50665/50665fig3.jpg" /><b<html> ص /&gt; الشكل 3. الأجسام الشبه الكروية ولدت في لوحات microwell. وتم تشكيل الأجسام الشبه الكروية من سبعمائة (A، C، E) أو ألف وخمسمائة (B، D، F) خلايا سرطان القولون HT29 (A، B)، LNCaP خلايا سرطان البروستاتا (C، D) أو TE6 خلايا سرطان المريء (E، F). ملاحظة اتساق الكروية ضمن إعداد، وأيضا الاختلاف بين خطوط الخلايا - ولا سيما المجاميع LNCaP فضفاض بالمقارنة مع معبأة أكثر كثافة HT29 والخلايا TE6. يمثل شريط مقياس 200 ميكرون. <table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td></td><td colspan="3"> تنسيق Microwell </td></tr><tr><td></td><td> AggreWell 400 </td><td> AggreWell 40EX </td><td> AggreWell 800 </td></tr><tr><td> عرض Microwell (al;color:#000000;background-color:#ffffff;font-weight:normal;font-style:normal;font-variant:normal;text-decoration:none;vertical-align:baseline;&quot;&gt;µm ) </td><td> 400 </td><td> 400 </td><td> 800 </td></tr><tr><td> Microwells لكل سم 2 </td><td> 625 </td><td> 625 </td><td> 156.25 </td></tr><tr><td> Microwells لكل بئر </td><td> 1،200 </td><td> 4،700 </td><td> 300 </td></tr><tr><td> الخلايا الحد الأدنى لكل microwell * </td><td> N / A </td><td> N / A </td><td> 2000 </td></tr><tr><td> خلايا الأقصى في microwell * </td><td> 2،000 </td><td> 2،000 </td><td> 10،000 </td></tr><tr><td> الحد الأدنى خلايا لكل بئر * </td><td> N / A </td><td> N / A </td><td> 6 × 10 5 </td></tr><tr><td> خلايا أقصى لكل بئر * </td><td> 2.4 × 10 6 </td><td> 9.4 × 10 6 </td><td> 3 × 10 6 </td></tr><tr><td> 1.1.1 - 70٪ حجم الإيثانول (مل) </td><td> 0.5 </td><td> 2.0 </td><td> 0.5 </td></tr><tr><td> 1.2.1 - الشطف حجم الحل (مل) </td><td> 0.5 </td><td> 2.0 </td><td> 0.5 </td></tr><tr><td> 3.2 - حجم متوسط ​​التحميل المسبق (مل) </td><td> 0.4 </td><td> 1.6 </td><td> 0.4 </td></tr><tr><td> 3.5 - حجم التحميل الخليوي (مل) </td><td> 0.4 </td><td> 1.6 </td><td> 0.4 </td></tr><tr><td colspan="4"> * أرقام من الخلايا في microwell ليست سوى تقريب هذه القيمة كما سوف تختلف مع حجم الخلايا المحددة المستخدمة، وينبغي أن تحدد تجريبيا </td></tr></tbody></table> الجدول 1. AggreWell الخيارات والتعديلات البروتوكول.

Watch this Scientific Journal Video about Production of Large Numbers of Size-controlled Tumor Spheroids Using Microwell Plates at JoVE.com

Production of Large Numbers of Size-controlled Tumor Spheroids Using Microwell Plates

ونحن نقدم بروتوكول لتوليد أعداد كبيرة (آلاف إلى مئات الآلاف) من حجم موحد وتكوين الأجسام الشبه الكروية التي تسيطر عليها الورم، وذلك باستخدام لوحات microwell متاحة تجاريا.

إنتاج أعداد كبيرة من الأجسام الشبه الكروية التي تسيطر عليها حجم الورم عن طريق لوحات Microwell

Tumor spheroids are increasingly recognized as an important in vitro model for the behavior of tumor cells in three dimensions. More physiologically ...

Research

JoVE Journal

Bioengineering

A Simple Hanging Drop Cell Culture Protocol for Generation of 3D Spheroids

إسقاط خلية بسيطة الشنق بروتوكول الثقافة للجيل 3D الأجسام الشبه الكروية

Studies of cell-cell cohesion and cell-substratum adhesion have historically been performed on monolayer cultures adherent to rigid substrates. Cells ...

Nonhuman Primate Lung Decellularization and Recellularization Using a Specialized Large-organ Bioreactor

There are an insufficient number of lungs available to meet current and future organ transplantation needs. Bioartificial tissue regeneration is an ...

Nutrient Regulation by Continuous Feeding for Large-scale Expansion of Mammalian Cells in Spheroids

تنظيم المغذيات عن طريق تغذية مستمرة لتوسيع نطاق واسع من خلايا الثدييات في الأجسام الشبه الكروية

In this demonstration, spheroids formed from the &#946;-TC6 insulinoma cell line were cultured as a model of manufacturing a mammalian islet cell product ...

Robotic Production of Cancer Cell Spheroids with an Aqueous Two-phase System for Drug Testing

الإنتاج الآلي للسرطان خلية الأجسام الشبه الكروية مع نظام مائي مرحلتين لاختبار المخدرات

Cancer cell spheroids present a relevant in vitro model of avascular tumors for anti-cancer drug testing applications. A detailed protocol for producing ...

Cloning and Large-Scale Production of High-Capacity Adenoviral Vectors Based on the Human Adenovirus Type 5

الاستنساخ واسع النطاق إنتاج ذات قدرة عالية ناقلات الفيروسة الغدانية استنادا إلى نوع اتش 5 الإنسان

High-capacity adenoviral vectors (HCAdV) devoid of all viral coding sequences represent one of the most advanced gene delivery vectors due to their high ...

Creation of Cardiac Tissue Exhibiting Mechanical Integration of Spheroids Using 3D Bioprinting

إنشاء الأنسجة القلبية عرض التكامل الميكانيكي للكروية باستخدام بيوبرينتينغ 3D

This protocol describes 3D bioprinting of cardiac tissue without the use of biomaterials, using only cells. Cardiomyocytes, endothelial cells and ...

Assembly and Tracking of Microbial Community Development within a Microwell Array Platform

تجميع وتتبع التنمية المجتمعية الميكروبية داخل منصة ميكرويل صفيف

The development of microbial communities depends on a combination of complex deterministic and stochastic factors that can dramatically alter the spatial ...

Production of Chemicals by Klebsiella pneumoniae Using Bamboo Hydrolysate as Feedstock

Production of Chemicals by Klebsiella pneumoniae Using Bamboo Hydrolysate as Feedstock

إنتاج المواد الكيميائية من قبل<em&gt; كليبسيلا بنيومونياي</em&gt; استخدام الخيزران هدروليزيت كمادة وسيطة

Bamboo is an important biomass, and bamboo hydrolysate is used by Klebsiella pneumoniae as a feedstock for chemical production. Here, bamboo powder was ...

Generic Protocol for Optimization of Heterologous Protein Production Using Automated Microbioreactor Technology

بروتوكول عام للاستفادة المثلى إنتاج البروتين مغايرة باستخدام تقنية ميكروبيوريكتور الآلي

A core business in industrial biotechnology using microbial production cell factories is the iterative process of strain engineering and optimization of ...

Affordable Oxygen Microscopy-Assisted Biofabrication of Multicellular Spheroids

التصنيع الحيوي بمساعدة الأكسجين بمساعدة الأكسجين بأسعار معقولة للكرويات متعددة الخلايا

Multicellular spheroids are important tools for studying tissue and cancer physiology in 3D and are frequently used in tissue engineering as tissue ...