Name: production of large numbers of size-controlled tumor spheroids using microwell plates
Uploaded: 2013-11-18T20:00:00
Duration: 10 min 44 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Production of Large Numbers of Size-controlled Tumor Spheroids Using Microwell Plates at JoVE.com

Dette arbejde blev finansieret af University of Calgary, under en ny investigator start-up tilskud til Dr. Ungrin.

BEMÆRK: mikrobrøndsplader er tilgængelige i forskellige formater, afhængigt af de ønskede resultater. Specifikationer samt omtrentlige retningslinjer for det minimale og maksimale antal celler, der skal bruges med hver format er vist i tabel 1.. De mindre mikrobrønde tilspidses til en skarp spids, og derfor er der ingen nedre størrelse grænse, selv om variationen mellem spheroids bliver mere markant ved mindre størrelser. Rutinemæssig produktion af spheroids fra et gennemsnit på så lidt som 20 celler hver er ligetil 8. Jo større mikrobrønd størrelse er ikke fuldt tilspidset, forsøger derfor at danne sfæroider fra et lille antal celler kan resultere i flere mindre sfæroider i hver mikrobrønd. På grund af små forskelle i overfladeegenskaber, forberedelse med det overfladeaktive opløsning (trin 1.2) er ikke valgfrit, når du bruger AggreWell 400Ex plader. Denne protokol er baseret på brugen af ​​AggreWell 400 plader - for andre formater ulemperult Tabel 1. Antallet af celler, der skal lægges i hver brønd bestemmes ved at multiplicere antallet af mikrobrønde indeholder antallet af celler, der skal klynger for hver sfæroide. For eksempel for at danne sfæroider fra 1000 celler stykket skal hver brønd være belastet med (1.200 sfæroider gange 1.000 celler hver =) 1,2 x 10 6 celler. Celletæthed skal beregnes, da cellerne vil blive indlæst i et volumen på 0,4 ml. Så for eksempel sfæroider dannet ud fra 1000 celler hver, 1,2 x 10 6 celler i 0,4 ml svarer til en densitet på 3 x 10 6 celler pr ml. 1.. Forberedelse Microwells at modtage celler <ol><li> Mikrobrøndsplader er sterile som fastsat, og bør kun fjernes fra deres emballage i et sterilt miljø som en laminar flow biosikkerhed kabinet. Sterilitet skal opretholdes under hele protokollen. Hvis sterilitet kompromitteres, brøndene resteriliseret anvendelse af 70% ethanol i vand ved brug affølgende valgfrie trin. <ol><li> Tilsæt 0,5 ml 70% ethanol til hver ubrugt godt. Nogle mikrobrønde vil fælde luftbobler, selv om dette kan reduceres ved tilsætning af væske i den ene side, og gør det muligt at sprede sig over overfladen i stedet for slippe den lodret på overfladen. Udskift låget. </li><li> Mens ethanoldamp hurtigt bør gennemtrænge eventuelle bobler, hvis der er et stort antal kan det være ønskeligt at fjerne dem. Centrifuger i 2 minutter ved 2.000 x g. Bemærk, at det er vigtigt at sikre, at rotoren er korrekt afbalanceret med denne hastighed. </li><li> Ved hjælp af en lav-forstørrelse inverteret mikroskop, kontrollere bobler er blevet fjernet fra mikrobrøndene. </li><li> Inkubér i 5 minutter med låget på ved stuetemperatur. </li><li> Aspirer ethanol. Plade kan nu vaskes med sterilt vand eller PBS til øjeblikkelig brug eller lufttørret til opbevaring. </li></ol></li><li> For at sikre, at cellerne ikke interagere med mikrobrønd overflade, kan det fremstilles under anvendelse af et overfladeaktivt middel. Generelt er dettilrådeligt at udføre dette trin i første omgang, og derefter sammenligne spheroids genereret med og uden overfladeaktive-belagt mikrobrønde. <ol><li> Tilsæt 0,5 ml Skylning Solution til hver brønd. Nogle mikrobrønde vil fælde luftbobler, selv om dette kan reduceres ved tilsætning af væske i den ene side, og gør det muligt at sprede sig over overfladen i stedet for slippe den lodret på overfladen. Udskift låget. </li><li> Centrifuger i 2 minutter ved 2000 xg for at fjerne bobler. Bemærk, at det er vigtigt at sikre, at rotoren er korrekt afbalanceret med denne hastighed. </li><li> Ved hjælp af en lav-forstørrelse inverteret mikroskop, kontrollere bobler er blevet fjernet fra mikrobrøndene. </li><li> Inkuber i mindst tredive minutter med låg ved stuetemperatur eller natten over ved 4 ° C. Pladerne kan opbevares ved fire grader med opløsningen af ​​overfladeaktivt middel i brøndene, indtil nødvendig, hvis korrekt forseglet for at hindre udtørring. </li><li> Vask plade med sterilt vand eller PBS umiddelbart før brug. Lad ikke pladerat tørre ud efter belægning. </li></ol></li></ol> 2. Forberedelse Celler BEMÆRK: Detaljerne i cellepræparat vil variere noget med det specifikke celletype blive undersøgt. Men vi har observeret disse betingelser for at være effektiv med en bred vifte af celler, herunder de linjer, der diskuteres her, såvel som humane og murine embryonale stamceller (ESC), humane inducerede pluripotente stamceller (IPSC), fibroblaster, formodet primitive endoderm, og stromaceller. Andre grupper har anvendt dette system har for en lang række applikationer, herunder chondrogenese af mesenchymale stamceller 9 standardiseret generation af neurale prækursorer fra pluripotente stamceller 10, toksikologiske analyser i hepatocytter 11 og vurdering af rygmarv regenerering i salamandre 12. Den specifikke protokol for arbejdet med HT29-celler er vist her. <ol><li> Start med en T75 kolbe af HT29 celler dyrket i DMEM+ 10% FBS </li><li> Aspirer vækstmedium fra kolben, og der tilsættes 3 ml trypsin. </li><li> Cellerne inkuberes i 5 minutter ved 37 ° C. </li><li> Stop trypsinfordøjelse ved at tilsætte 3 ml vækstmedium. Der udtages en alikvot til celletælling og overføre den resterende del i et 15 ml centrifugerør. </li><li> Centrifuger i 5 minutter ved 200 x g. </li><li> Mens centrifugering er i gang, tælle celler. </li><li> Aspirer trypsin / medium-blanding og erstatte med frisk vækstmedium, volumen afhænger af det ønskede celledensitet som beregnet ovenfor. </li><li> (Valgfrit) Pass cellesuspensionen gennem en si for at fjerne eventuelle klumper. BEMÆRK: Cell høstforhold vil variere noget mellem linjerne. Hvis en dissociation protokol for fx passage cellerne af interesse er til rådighed, skal der bruges som udgangspunkt. Med følsomme cellelinjer brug af trypsin kan resultere i overdreven celledød. I disse tilfælde har vi observeret gode resultater ved hjælp af TrypLE som alternativ dissociatipå reagens 8.. Hvis cellerne bliver klumpet under dissociation og taber levedygtighed kan tilsætning DNAse til enzymopløsningen løse dette. Reduktion dissociation gange, og ansætte en findeling skridt til at bryde op celleklumper kan også øge rentabiliteten. </li></ol> 3. Klumpformet Dannelse BEMÆRK: Sfæroider kan dannes i en række mellemstore formuleringer, men indledende tests bør udføres under anvendelse af det medium, hvori cellerne blev dyrket, til at skelne virkningerne af overgangen til en 3-dimensionel dyrkningssystem fra konsekvenserne af at ændre medium sammensætning. <ol><li> Tilføj 0,4 ml vækstmedium til hver brønd. </li><li> Centrifuger i 2 minutter ved 2000 xg for at fjerne bobler. Bemærk, at det er vigtigt at sikre, at rotoren er korrekt afbalanceret ved denne hastighed før centrifugering. </li><li> Ved hjælp af en lav-forstørrelse inverteret mikroskop, kontrollere bobler er blevet fjernet fra mikrobrøndene. </li><li> Tilføj 0,4 mlcellesuspension ved den krævede densitet (beregnet ovenfor). Bland forsigtigt ved pipettering op og ned, uden at indføre luftbobler i mikrobrøndene. Det er vigtigt at sikre, at cellerne er jævnt fordelt over hele brønden, for at opnå konsistente sfæroider. </li><li> Centrifuger i 5 minutter ved 200 x g. Hvis pladen ikke selv-niveau under centrifugering, kan konvektionsstrømme opstå som resulterer i ujævn fordeling af celler tværs mikrobrøndene. Derfor bør pladen afbalanceret internt såvel som mod den anden plade, således at vægten fordeles jævnt på begge sider af pladen bærer. </li></ol> BEMÆRK: Hvis der ses tegn på ujævn celle distribution, kan det være nødvendigt at anvende en lille mængde smøring til pivot punkter på pladen carrier - rådføre sig med centrifuge producenten for anvisninger. BEMÆRK: Når cellerne er blevet centrifugeret i mikrobrøndene, er de rimeligt modstandsdygtigetigt til vask ud fra mindre bevægelser af pladen. Pludselige bevægelser, der resulterer i skvulpende af mediet bør undgås, men overførsel af pladen fra centrifuge til mikroskop eller inkubator ikke bør resultere i en betydelig celle forskydning. <ol start="6"><li> Ved hjælp af et inverteret mikroskop, kontrollere, at cellerne er grupperet inden for de mikrobrønde, og at de er jævnt fordelt over godt. </li><li> Inkuberes natten over ved 37 ° C. </li><li> Anvendelse af et omvendt mikroskop, observere processen klumpformet formation. Nogle cellelinjer vil danne kompakte spheroids indenfor 24 timer, andre kan tage længere tid. Progressionen fra klynge til at aggregere i HT29-celler er vist i figur 2. </li><li> Recover spheroids fra mikrobrøndene og overføre til suspension kultur ved forsigtigt spuling dem ud med en pipette. Alternativt vedligeholde spheroids in situ med medium udskiftning 8 - varigheden afhænger af deres oprindelige størrelse og væksthastighed, som defIne tiden indtil de vokser mikrobrøndene, hvor de blev dannet. <ol><li> At erstatte medium uden at miste spheroids, aspireres medium på kanten af ​​brønden ved hjælp af en Pasteur-pipette. Langsomt bringe spidsen ned, indtil det begynder at trække væske fra menisken, og følg menisken ned som den falder. Derefter tilsættes frisk medium mod brøndvæggen på samme sted. Enkelte spheroids kan gå tabt, men hvis mediet altid aspireres og erstattes i den samme position, vil dette tal være lille i forhold til det store antal i brønden. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Hirschhaeuser, F., Menne, H., Dittfeld, C., West, J., Mueller-Klieser, W., Kunz-Schughart, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multicellular+tumor+spheroids:+An+underestimated+tool+is+catching+up+again.">Multicellular tumor spheroids: An underestimated tool is catching up again.</a> Journal of Biotechnology. 148 (1), 3-15 (2010).</li><li>Sherar, M. D., Noss, M. B., Foster, F. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrasound+backscatter+microscopy+images+the+internal+structure+of+living+tumour+spheroids.">Ultrasound backscatter microscopy images the internal structure of living tumour spheroids.</a> Nature. 330 (6147), 493-495 (1987).</li><li>Foty, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Simple+Hanging+Drop+Cell+Culture+Protocol+for+Generation+of+3D+Spheroids.">A Simple Hanging Drop Cell Culture Protocol for Generation of 3D Spheroids.</a> J. Vis. Exp. (51), 2720 (2011).</li><li>Naber, H. P. H., Wiercinska, E., Ten Dijke, P., Van Laar, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spheroid+Assay+to+Measure+TGF-&#946;-induced+Invasion.">Spheroid Assay to Measure TGF-&#946;-induced Invasion.</a> J. Vis. Exp. (57), e3337 (2011).</li><li>Ungrin, M. D., Joshi, C., Nica, A., Bauwens, C., Reproducible Zandstra, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ultra+high-throughput+formation+of+multicellular+organization+from+single+cell+suspension-derived+human+embryonic+stem+cell+aggregates.">ultra high-throughput formation of multicellular organization from single cell suspension-derived human embryonic stem cell aggregates.</a> PLoS ONE. 3 (2), e1565 (2008).</li><li>Bauwens, C. L., Song, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Geometric+control+of+cardiomyogenic+induction+in+human+pluripotent+stem+cells.">Geometric control of cardiomyogenic induction in human pluripotent stem cells.</a> Tissue Engineering. Part A. 17 (15-16), 1901-1909 (2011).</li><li>Bratt-Leal, A. M., Carpenedo, R. L., Ungrin, M. D., Zandstra, P. W., McDevitt, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Incorporation+of+biomaterials+in+multicellular+aggregates+modulates+pluripotent+stem+cell+differentiation.">Incorporation of biomaterials in multicellular aggregates modulates pluripotent stem cell differentiation.</a> Biomaterials. 32 (1), 48-56 (2011).</li><li>Ungrin, M. D., Clarke, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rational+bioprocess+design+for+human+pluripotent+stem+cell+expansion+and+endoderm+differentiation+based+on+cellular+dynamics.">Rational bioprocess design for human pluripotent stem cell expansion and endoderm differentiation based on cellular dynamics.</a> Biotechnology and Bioengineering. 109 (4), 853-866 (2012).</li><li>Markway, B. D., Tan, G. K., Brooke, G., Hudson, J. E., Cooper-White, J. J., Doran, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+chondrogenic+differentiation+of+human+bone+marrow-derived+mesenchymal+stem+cells+in+low+oxygen+environment+micropellet+cultures.">Enhanced chondrogenic differentiation of human bone marrow-derived mesenchymal stem cells in low oxygen environment micropellet cultures.</a> Cell Transplantation. 19 (1), 29-42 (2010).</li><li>Kozhich, O., Hamilton, R., Mallon, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Standardized+Generation+and+Differentiation+of+Neural+Precursor+Cells+from+Human+Pluripotent+Stem+Cells.">Standardized Generation and Differentiation of Neural Precursor Cells from Human Pluripotent Stem Cells.</a> Stem Cell Reviews and Reports. , 1-6 (2012).</li><li>Fey, S. J., Wrzesinski, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+of+Drug+Toxicity+Using+3D+Spheroids+Constructed+from+an+Immortal+Human+Hepatocyte+Cell+Line.">Determination of Drug Toxicity Using 3D Spheroids Constructed from an Immortal Human Hepatocyte Cell Line.</a> Toxicological Sciences. , (2012).</li><li>Mchedlishvili, L., Mazurov, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconstitution+of+the+central+and+peripheral+nervous+system+during+salamander+tail+regeneration.">Reconstitution of the central and peripheral nervous system during salamander tail regeneration.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. , (2012).</li><li>Butler, C. M., Foty, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+Aggregate+Cohesion+by+Tissue+Surface+Tensiometry.">Measurement of Aggregate Cohesion by Tissue Surface Tensiometry.</a> J. Vis. Exp. (50), e2739 (2011).</li><li>Xu, K., Buchsbaum, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+Mammary+Epithelial+Cells+from+Three-dimensional+Mixed-cell+Spheroid+Co-culture.">Isolation of Mammary Epithelial Cells from Three-dimensional Mixed-cell Spheroid Co-culture.</a> J. Vis. Exp. (62), e3760 (2012).</li><li>Baraniak, P. R., Cooke, M. T., Saeed, R., Kinney, M. A., Fridley, K. M., McDevitt, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stiffening+of+human+mesenchymal+stem+cell+spheroid+microenvironments+induced+by+incorporation+of+gelatin+microparticles.">Stiffening of human mesenchymal stem cell spheroid microenvironments induced by incorporation of gelatin microparticles.</a> Journal of the Mechanical Behavior of Biomedical Materials. 11, 63-71 (2012).</li><li>Purpura, K. A., Bratt-Leal, A. M., Hammersmith, K. A., McDevitt, T. C., Zandstra, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systematic+engineering+of+3D+pluripotent+stem+cell+niches+to+guide+blood+development.">Systematic engineering of 3D pluripotent stem cell niches to guide blood development.</a> Biomaterials. , (2012).</li></ol>

Dr. Ungrin har en økonomisk interesse i AggreWell teknologien som en opfinder.

Vi har etableret et system, hvorved et stort antal ensartede spheroids kan genereres fra flere cellelinjer fra forskellige kilder. Vi har endnu ikke mødt en Tilhænger cellelinie, der ikke udgør sphæroider under disse betingelser. Vi har tidligere observeret celle tab i populationer udsat for anoikis 5,8 dog til dato dette problem er ikke opstået med tumorlinjer. Systemet er vilkårligt skalerbart med areal, med adfærd konsistent på tværs af mikrobrønde i 24 brønde og 6-brønds format, såvel som prototype bioreaktorer indeholdende 50.000 mikrobrønde hver øjeblikket under udvikling. Skulle kugleformet asymmetri være en bekymring, kan inkubationstiden i trin 4.8 øges til to eller tre dage. Spheroids kan også inkuberes i en periode efter ekstraktion fra microwells&#39;ne øge symmetri, men i dette tilfælde skal man være omhyggelig for at holde kultur tætheder tilstrækkelig lav, som spheroids i kontakt med hinanden will ofte smelte sammen til større strukturer. Af denne grund har vi tidligere opretholdt kulturer inden for de mikrobrønde, hvor aggregaterne blev dannet med det primære begrænsning er størrelsen af ​​sfæroidet. Dette vil til gengæld er en funktion af både vækst og indledende str. 8, og hvis udvidede kultur i microwell pladen er planlagt, bør dette overvejes på forhånd. Muligheder for at forhindre tilgroning, bør det ske, omfatter enten starter med mindre spheroids, eller anvender de større mikrobrønde i AggreWell 800 plade. Skulle sfæroider ikke at stige i sammenhæng over tid, kan en mulig årsag være celledød. Især i større aggregater af stærkt metabolisk aktive celler, kan massetransport begrænsninger på levering af ilt og essentielle næringsstoffer resultere i en nekrotisk kerne 2 - og dermed en ikke-sammenhængende sfæroider kan simpelthen være en følge af overdreven celledød. Alternativt målinger af den mekaniske samdelse af sfæroider er blevet anvendt til at vurdere intercellulære bindingskræfter i forhold til det metastatiske potentiale af en given celle linie 13. Det ville være interessant at undersøge forholdet mellem klumpformet form og metastatisk potentiale, måske ved hjælp af morfometriske parametre som rundhed og omkreds til areal forhold. Ud over at undersøge de mekaniske og morfometriske egenskaber spheroids, montage i mikrobrønden system giver stor-skala produktion af blandet sammensætning spheroids, bestående af kombinationer af flere celletyper og / eller biomaterialer 6,7. Interaktionerne af tumorceller med andre celletyper er vigtige for tættere modellere adfærd af tumorer in vivo 14, og dermed kan det være af interesse at generere sfæroider fra tumorceller i kombination med fibroblaster og endotelceller, for eksempel. Mikropartikler af forskellige biomaterialer kan også inkorporeres og kan påvirke SPHeroid egenskaber både direkte gennem deres interaktion med celler 7,15, og også som reservoirer til kontrolleret frigivelse af vækstfaktorer og cytokiner i det indre af klumpformet 16. Hvis der er nogen bekymring sterilitet, for eksempel når du arbejder med en microwell plade, hvor nogle brønde tidligere har været anvendt, der kan have brugt en del tid i en inkubator som en del af et tidligere eksperiment, brøndene kan resteriliseres med 70% ethanol i vand. Når der er dannet sfæroider, kan de også være adskilt fra resterende inkorporerede celler ved at passere suspensionen over et cellefilter. Individuelle celler vil passere igennem, mens sfæroider vil blive bevaret. Hvis der er mistanke om at kaste potentielt metastatiske celler i løbet af kulturen sfæroiden, kan det være ønskeligt at udføre denne procedure flere gange - i første omgang for at fjerne ikke-inkorporerede celler, og efterfølgende at isolere oprensetd populationer af celler, givet ud fra sfæroiderne.

Der er en stigende mængde af beviser, at tumorceller opfører sig anderledes i tredimensionelle kulturer, end de gør, når de dyrkes på plastik, og at terapeutiske midler identificeret på konventionelle cellekultur platforme kan miste effekt, når skiftet til en mere fysiologisk relevant systemet 1.. Det er derfor ønskeligt at undersøge opførslen af ​​kræftceller under disse betingelser, både for at få indblik i deres underliggende biologi, og også at øge succesraten for overgangen nye terapeutiske midler fra screeningen facilitet til klinikken. Et nyttigt modelsystem med en lang historie beskæftiger tredimensionelle klynger af kræftceller er kendt som tumor sfæroider 1,2. Ideelt set ville teknikker til kugleformet dannelse tillade produktion af et stort antal ensartede sfæroider, hvis størrelse og sammensætning styres af eksperimentatoren. Mens hængende-drop og vel-plade nærmer sig 3,4 er i stand til at opfylde nogle af disse rekrav, gennemløb er generelt begrænset, og generering af et stort antal spheroids bliver en arbejdskrævende opgave. Vi har for nylig udviklet et system til at løse lignende udfordringer i regenerativ medicin felt 5.. Anvender tvunget aggregering i en række af tætpakkede micron skala brønde (se figur 1), er denne fremgangsmåde tillader generering af sfæroider vilkårlige antal af celler, herunder blandinger af flere celletyper 6, samt inkorporering af forskellige biomaterialer 7. Spheroids dannes i stort antal - tusinder til flere hundrede tusinde eller mere - og kan udvindes straks eller holdes i mikrobrøndene, hvor de blev dannet med medium bytte for mindst et 8 til to (upubliceret observation) uger. Dette system er derfor velegnet til generering af et stort antal ensartet og reproducerbar tumor spheroids for vurderingen af ​​effectiveness af nye antitumormidler eller grundlæggende biologiske undersøgelser.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Name of Reagent/Material</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AggreWell 400 plate</td>
			<td>StemCell Technologies Inc.</td>
			<td>27845/27945</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rinsing Solution</td>
			<td>StemCell Technologies Inc.</td>
			<td>07010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell strainer (37 <span id="docs-internal-guid-263ae0a0-aa3d-bddd-2a36-2ae1901f1604" style="font-size:15px;font-family:Arial;color:#000000;background-color:#ffffff;font-weight:normal;font-style:normal;font-variant:normal;text-decoration:none;vertical-align:baseline;">&#181;m)</td>
			<td>StemCell Technologies Inc.</td>
			<td>27215</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>VWR / LONZA</td>
			<td>CA12001-676</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-Versene (EDTA)</td>
			<td>VWR / LONZA</td>
			<td>CA12001-660</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>VWR / LONZA</td>
			<td>CA12002-212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>VWR / LONZA</td>
			<td>CA-95042-112</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrypLE</td>
			<td>Invitrogen / Life Technologies</td>
			<td>12605010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted microscope</td>
			<td>VWR / Motic</td>
			<td>CA19000-610</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Allegra X15R centrifuge with carriers for standard well plates</td>
			<td>VWR / Beckman</td>
			<td>CABKA99465, CABK369704, CABK392806</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminar flow biosafety cabinet</td>
			<td>ESBE / Baker</td>
			<td>BKR-SG603AHEUVSP</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

production of large numbers of size-controlled tumor spheroids using microwell plates

Tumor spheroids anerkendes i stigende grad som en vigtig in vitro model for opførsel af tumorceller i tre dimensioner. Mere fysiologisk relevant end konventionelle klæbende ark kulturer, de mere præcist rekapitulere og interaktioner stede i reelle tumorer. For at udnytte denne model for bedre at kunne vurdere tumor biologi, eller effekten af ​​nye terapeutiske midler, er det nødvendigt at være i stand til at generere spheroids reproducerbart, på en kontrolleret måde og i betydeligt antal. Den AggreWell systemet består af et high-density vifte af pyramideformede mikrobrønde, i hvilket en suspension af enkelte celler centrifugeres. Antallet af celler, klynger ved bunden af ​​hver mikrobrønd, og antallet og forholdet mellem forskellige celletyper, der er involveret kun afhænger egenskaberne af suspension, der indføres af eksperimentatoren. Således er vi i stand til at generere tumor spheroids vilkårlige størrelse og sammensætning medud at skulle ændre den underliggende platform teknologi. De hundredvis af mikrobrønde per kvadratcentimeter kultur overfladeareal til gengæld sikre, at ekstremt høje produktionsniveau kan opnås via en enkel, nonlabor-intensiv proces. Vi forventer derfor, at denne protokol vil være stort set nyttigt til forskere i tumoren området klumpformet.

Sfæroider fra flere tumorlinjer af forskellige anatomiske oprindelse kan let genereres og ekstraheret i suspensionskultur. Figur 3 illustrerer ensartet størrelse kontrol opnås via denne fremgangsmåde, med meget ensartede kugleformede populationer under hver betingelse. Klare forskelle mellem line i adfærd er også synlige, med HT29 tyktarmskræft celler og TE6 esophageal kræftceller danner tætpakkede spheroids med skarpt definerede grænser, mens LNCaP prostatacancerceller gav anledning til mindre sammenhængende spheroids med uregelmæssige grænser (se Diskussion af mulige årsager ). Jo stærkere indre kræfter i mere sammenhængende aggregater også resulteret i kollaps til en mere symmetrisk form, selv mens du stadig i mikrobrøndene, hvor de blev dannet, mens LNCaP aggregater, især på større størrelse, synligt beholde pladsen pyramidestubformet geometri mikrobrønde. Forholdet mellem input celletal og fysisk<html> ical størrelse af den resulterende sfæroid vil afhænge af en række variabler. Teoretiske mængder baseret på produktet af volumenet per celle, og antallet af anvendte celler kan reduceres ved celletab, som igen kan omfatte tab af celler under enkelt-cellesuspension fase, såvel som tab af alt små aggregater på grund af utilstrækkeligt antal naboer og fra overdrevent store aggregater grund til at transportere begrænsninger og nekrose i kernen. Størrelse vil også blive påvirket af nogen spredning, der kan opstå under sammenlægning proces. Da disse parametre vil variere fra cellelinje til cellelinje, hvis der ønskes sfæroider specifikke fysiske dimensioner det korrekte antal celler til at indføre, skal bestemmes eksperimentelt. Som en første tilnærmelse, forventes klumpformet diameter at stige med kubikroden af antallet af celler indarbejdet - fx en 8-dobling i antallet af celler bør resultere i en fordobling af klumpformet diameter. <html> _content &quot;fo: keep-together.within-side =&quot; altid &quot;&gt; <img alt="Figur 1" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50665/50665fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50665/50665fig1.jpg" /> Figur 1. Skematisk af klumpformet produktion. Mikrobrønden Systemet består af en vifte af tætpakkede kvadrat-pyramideformet mikrobrønde (625 per cm 2 for 400 <span id="docs-internal-guid-263ae0a0-aa35-f9c7-69a1-8c5aa197db53" style="font-size:15px;font-family:Arial;color:#000000;background-color:#ffffff;font-weight:normal;font-style:normal;font-variant:normal;text-decoration:none;vertical-align:baseline;">μ m størrelse), i hvilke celler kan centrifugeres. Cellerne bragt sammen af ​​de skrånende sidevægge, og størrelsen af ​​det resulterende sfæroid styres ved at variere densiteten af ​​cellesuspensionen anvendes. 50665fig2highres.jpg &quot;src =&quot; / files/ftp_upload/50665/50665fig2.jpg &quot;/&gt; Figur 2. Montering af klynger af celler i sfæroider. Spheroids blev dannet fra syvhundrede HT29 celler hver. Umiddelbart efter centrifugering (A), celler løst grupperet i bunden af hver mikrobrønd. Bemærk, at de klynger ensartet forskudt mod den nedre højre i denne sag. Dette er acceptabelt, forudsat klyngestørrelser forbliver konsistent på tværs af array. Hvis der ses forskelle betydelig klynge størrelse fra den ene side af opstillingen til den anden, se note i trin 3.5. Efter inkubation i 24 timer (B), har intercellulære adhæsive kræfter forårsaget klyngerne til at aggregere og danne sammenhængende sfæroider, som derefter kan ekstraheres (C). <img alt="Figur 3" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50665/50665fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50665/50665fig3.jpg" /><b<html> r /&gt; Figur 3.. Sfæroider genereres i mikrobrøndsplader. Sfæroider blev dannet fra syv hundrede (A, C, E) eller 1500 (B, D, F) HT29 coloncancer-celler (A, B), LNCaP prostatacancerceller (C, D) eller TE6 esophageal kræftceller (E, F). Bemærk sammenhængen i sfæroiderne indenfor et præparat, og også variationen mellem cellelinjer - især de løse LNCaP aggregater i forhold til de mere tætpakkede HT29 og TE6 celler. Målestokken repræsenterer 200 um. <table border="1"><tbody><tr><td></td><td colspan="3"> Microwell format </td></tr><tr><td></td><td> AggreWell 400 </td><td> AggreWell 40EX </td><td> AggreWell 800 </td></tr><tr><td> Microwell bredde (al;color:#000000;background-color:#ffffff;font-weight:normal;font-style:normal;font-variant:normal;text-decoration:none;vertical-align:baseline;&quot;&gt;µm ) </td><td> 400 </td><td> 400 </td><td> 800 </td></tr><tr><td> Microwells pr cm2 </td><td> 625 </td><td> 625 </td><td> 156,25 </td></tr><tr><td> Microwells per brønd </td><td> 1.200 </td><td> 4.700 </td><td> 300 </td></tr><tr><td> Minimum celler pr mikrobrønd * </td><td> N / A </td><td> N / A </td><td> 2000 </td></tr><tr><td> Maksimalt celler pr mikrobrønd * </td><td> 2.000 </td><td> 2.000 </td><td> 10.000 </td></tr><tr><td> Minimum brønd * </td><td> N / A </td><td> N / A </td><td> 6 x 10 5 </td></tr><tr><td> Maksimalt brønd * </td><td> 2,4 x 10 6 </td><td> 9,4 x 10 6 </td><td> 3 x 10 6 </td></tr><tr><td> 1.1.1 - 70% ethanol volumen (ml) </td><td> 0.5 </td><td> 2,0 </td><td> 0.5. </td></tr><tr><td> 1.2.1 - Skylning løsning volumen (ml) </td><td> 0.5 </td><td> 2,0 </td><td> 0.5 </td></tr><tr><td> 3.2 - Medium preload volumen (ml) </td><td> 0.4 </td><td> 1.6 </td><td> 0.4 </td></tr><tr><td> 3.5 - Cell lastning volumen (ml) </td><td> 0.4 </td><td> 1.6 </td><td> 0.4 </td></tr><tr><td colspan="4"> * Antallet af celler pr mikrobrønd er kun en tilnærmelse, da denne værdi vil variere med størrelsen af ​​de specifikke celler, der anvendes, og skal bestemmes empirisk </td></tr></tbody></table> Tabel 1. AggreWell muligheder og protokol modifikationer.

Watch this Scientific Journal Video about Production of Large Numbers of Size-controlled Tumor Spheroids Using Microwell Plates at JoVE.com

Production of Large Numbers of Size-controlled Tumor Spheroids Using Microwell Plates

Vi introducerer en protokol til generering af store tal (tusind til flere hundrede tusinde) af ensartet størrelse-og sammensætning-kontrollerede tumor spheroids, ved hjælp af kommercielt tilgængelige mikrobrøndsplader.

Produktion af et stort antal Size-kontrollerede Tumor Spheroids Brug mikrobrøndsplader

Tumor spheroids are increasingly recognized as an important in vitro model for the behavior of tumor cells in three dimensions. More physiologically ...

Research

JoVE Journal

Bioengineering

A Simple Hanging Drop Cell Culture Protocol for Generation of 3D Spheroids

Studies of cell-cell cohesion and cell-substratum adhesion have historically been performed on monolayer cultures adherent to rigid substrates. Cells ...

Nonhuman Primate Lung Decellularization and Recellularization Using a Specialized Large-organ Bioreactor

Human primat Lung Decellularization og Recellularization bruge en specialiseret Large-orgel bioreaktor

There are an insufficient number of lungs available to meet current and future organ transplantation needs. Bioartificial tissue regeneration is an ...

Nutrient Regulation by Continuous Feeding for Large-scale Expansion of Mammalian Cells in Spheroids

Næringsstof forordning ved Kontinuerlig Fodring for Storstilet Udvidelse af pattedyrsceller in Spheroids

In this demonstration, spheroids formed from the &#946;-TC6 insulinoma cell line were cultured as a model of manufacturing a mammalian islet cell product ...

Robotic Production of Cancer Cell Spheroids with an Aqueous Two-phase System for Drug Testing

Robotic Produktion af Cancer Cell Sfæroider med en vandig tofasesystem for Drug Testing

Cancer cell spheroids present a relevant in vitro model of avascular tumors for anti-cancer drug testing applications. A detailed protocol for producing ...

Cloning and Large-Scale Production of High-Capacity Adenoviral Vectors Based on the Human Adenovirus Type 5

Kloning og storstilet produktion af høj kapacitet adenovirusvektorer Baseret på menneskelige adenovirus type 5

High-capacity adenoviral vectors (HCAdV) devoid of all viral coding sequences represent one of the most advanced gene delivery vectors due to their high ...

Creation of Cardiac Tissue Exhibiting Mechanical Integration of Spheroids Using 3D Bioprinting

Oprettelse af hjertevæv, der udviser mekanisk integration af sfæroider ved hjælp af 3D bioprinting

This protocol describes 3D bioprinting of cardiac tissue without the use of biomaterials, using only cells. Cardiomyocytes, endothelial cells and ...

Assembly and Tracking of Microbial Community Development within a Microwell Array Platform

Samling og sporing af mikrobiell fællesskabsudvikling inden for en Microwell Array Platform

The development of microbial communities depends on a combination of complex deterministic and stochastic factors that can dramatically alter the spatial ...

Production of Chemicals by Klebsiella pneumoniae Using Bamboo Hydrolysate as Feedstock

Production of Chemicals by Klebsiella pneumoniae Using Bamboo Hydrolysate as Feedstock

Produktion af kemikalier af<em&gt; Klebsiella pneumoniae</em&gt; Brug af bambushydrolysat som fødevare

Bamboo is an important biomass, and bamboo hydrolysate is used by Klebsiella pneumoniae as a feedstock for chemical production. Here, bamboo powder was ...

Generic Protocol for Optimization of Heterologous Protein Production Using Automated Microbioreactor Technology

Generisk protokol for optimering af heterolog Protein produktion ved hjælp af automatiserede Microbioreactor teknologi

A core business in industrial biotechnology using microbial production cell factories is the iterative process of strain engineering and optimization of ...

Affordable Oxygen Microscopy-Assisted Biofabrication of Multicellular Spheroids

Overkommelig iltmikroskopiassisteret biofabrikation af multicellulære sfæroider

Multicellular spheroids are important tools for studying tissue and cancer physiology in 3D and are frequently used in tissue engineering as tissue ...