Name: production of large numbers of size-controlled tumor spheroids using microwell plates
Uploaded: 2013-11-18T20:00:00
Duration: 10 min 44 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Production of Large Numbers of Size-controlled Tumor Spheroids Using Microwell Plates at JoVE.com

Dette arbeidet ble finansiert av Universitetet i Calgary, under en ny etterforsker oppstart stipend til Dr. Ungrin.

MERK: Micro plater er tilgjengelige i forskjellige formater, avhengig av ønsket resultat. Spesifikasjoner samt omtrentlige retningslinjer for minimum og maksimum antall celler som skal brukes med hvert format er vist i tabell 1. De mindre mikro smalner av til en skarp spiss, og dermed er det ingen begrensning lavere, selv om variasjoner mellom sfæroider blir mer signifikant ved mindre størrelser. Rutinemessig produksjon av sfæroider fra et gjennomsnitt på så lite som 20 celler hver er grei åtte. Jo større mikrostørrelse er ikke fullt ut konisk, forsøker således å danne sfæroider fra et lite antall celler, kan resultere i flere mindre sfæroider i hver mikrobrønn. På grunn av små forskjeller i overflateegenskaper, i preparat med den overflateaktive oppløsning (trinn 1.2) ikke valgfritt ved bruk AggreWell 400EX platene. Denne protokollen er basert på bruk av AggreWell 400 plater - for andre formater ulemperult Tabell 1. Antallet celler som skal lastes inn i hver brønn blir bestemt ved å multiplisere antallet av mikro den inneholder med antall celler som skal gruppert for hver sfæroide. For eksempel vil generere sfæroider fra 1000 celler stykket, må hver brønn være lastet med (1200 sfæroider ganger tusen celler hver =) 1,2 x 10 6 celler. Celletetthet må beregnes gitt at cellene vil bli lastet inn i et volum på 0,4 ml. Så for eksempel av sfæroider som dannes fra 1000 celler hver, 1,2 x 10 6 celler i 0.4 ml settes til en tetthet på 3 x 10 til 6 celler pr ml. En. Forbereder Mikro å motta Cells <ol><li> Mikro platene er sterilt som forutsatt, og skal bare fjernes fra emballasjen i et sterilt miljø som en laminær-flow biosikkerhet kabinett. Sterilitet bør opprettholdes gjennom hele protokollen. Skulle sterilitet bli kompromittert, brønnene er steriliseres under anvendelse av 70% etanol i vann ved å brukefølgende valgfrie trinn. <ol><li> Tilsett 0,5 ml 70% etanol til hver ubrukt også. Noen mikrobrønner vil felle luftbobler, men dette kan reduseres ved tilsetning av væske i den ene side, og slik at den spres over hele overflaten, i stedet for å slippe det loddrett på overflaten. Bytt lokk. </li><li> Mens etanol dampen bør raskt syre noen bobler, hvis det er et stort antall kan det være ønskelig å fjerne dem. Sentrifuger i 2 min ved 2000 x g. Legg merke til at det er viktig å sikre at rotoren er godt balansert ved denne hastigheten. </li><li> Ved hjelp av en lav-forstørrelse invertert mikroskop, verifisere bobler er fjernet fra mikrobrønnene. </li><li> Inkuber i 5 min med lokket på ved romtemperatur. </li><li> Aspirer etanol. Plate kan nå vaskes med sterilt vann eller PBS for umiddelbar bruk, eller lufttørkes for lagring. </li></ol></li><li> For å sikre at cellene ikke kommuniserer med mikro overflate, kan den fremstilles ved hjelp av et overflateaktivt middel. Generelt er dettilrådelig å utføre dette trinnet først, og deretter sammenligner sfæroider som genereres med og uten surfaktant-belagte mikrobrønner. <ol><li> Tilsett 0,5 ml av rense-oppløsning til hver brønn. Noen mikrobrønner vil felle luftbobler, men dette kan reduseres ved tilsetning av væske i den ene side, og slik at den spres over hele overflaten, i stedet for å slippe det loddrett på overflaten. Bytt lokk. </li><li> Sentrifuger i 2 min ved 2000 x g for å fjerne bobler. Legg merke til at det er viktig å sikre at rotoren er godt balansert ved denne hastigheten. </li><li> Ved hjelp av en lav-forstørrelse invertert mikroskop, verifisere bobler er fjernet fra mikrobrønnene. </li><li> Inkuber i minst tredve minutter under lokket på ved romtemperatur, eller over natten ved 4 ° C. Platene kan lagres i fire grader med den overflateaktive oppløsning i brønnene inntil nødvendig hvis det skal tettes for å hindre uttørking. </li><li> Vask plate med sterilt vann eller PBS umiddelbart før bruk. Ikke la platerå tørke ut etter belegging. </li></ol></li></ol> 2. Forbereder Cells MERK: Detaljene i celleforberedelsen vil variere noe med den spesifikke celletype som studeres. Men vi har observert disse forholdene for å være effektiv med et bredt spekter av celler, inkludert linjene diskutert her, samt menneskelige og murine embryonale stamceller (ESC), menneskeskapte pluripotent stamceller (iPSC), fibroblaster, antatte primitive endoderm, og stromale celler. Andre grupper har ansatt dette systemet med suksess for et bredt spekter av bruksområder, inkludert chondrogenesis fra stamceller 9, standardisert generasjon av nevrale forløpere fra pluripotent stamceller 10, analyserer toksikologisk i hepatocytter 11 og vurdering av ryggmarg regenerering i salaman 12. Den spesifikke protokollen for å arbeide med HT29 celler er vist her. <ol><li> Start med en T75 kolbe HT29 celler, dyrket i DMEM+ 10% FBS </li><li> Aspirer vekstmedium fra kolbe, og tilsett 3 ml trypsin. </li><li> Inkuber cellene i 5 min ved 37 ° C. </li><li> Stopp trypsin fordøyelse ved å tilsette 3 ml dyrkningsmedium. Ta en porsjon for celletelling, og overføre det resterende til et 15 ml sentrifugerør. </li><li> Sentrifuger i 5 min ved 200 x g. </li><li> Selv om sentrifugering pågår, tell cellene. </li><li> Aspirer trypsin / medium blandingen og erstatte med frisk vekstmedium, volum bestemmes av den ønskede celletetthet som beregnet ovenfor. </li><li> (VALGFRITT) Pass cellesuspensjonen gjennom en sil for å fjerne eventuelle klumper. MERK: Cell innhøstingsforhold vil variere noe mellom linjene. Hvis en dissosiasjon protokoll for eksempel passering celler av interesse er tilgjengelig, bør det brukes som et utgangspunkt. Med sensitive cellelinjer bruk av trypsin kan resultere i overdreven celledød. I disse tilfellene har vi sett gode resultater ved hjelp TrypLE som et alternativ dissociatipå reagens åtte. Dersom cellene blir clumped under dissosiasjon og tape levedyktighet, kan tilsetningen av DNAse til enzym-oppløsningen løse dette. Redusere dissosiasjonstider og ansette en utgnidning skritt å bryte opp celle klumper kan også øke levedyktighet. </li></ol> Tre. Spheroid Dannelse MERK: Spheroids kan genereres i en rekke mellom formuleringer, men innledende forsøk bør utføres under anvendelse av det mediet som cellene ble dyrket, for å skille følger av overgangen til en tre-dimensjonale kultursystemet fra konsekvensene av å endre medium sammensetning. <ol><li> Tilsett 0,4 ml av vekstmedium til hver brønn. </li><li> Sentrifuger i 2 min ved 2000 x g for å fjerne bobler. Legg merke til at det er viktig å sikre at rotoren er godt balansert på denne hastigheten forut for sentrifugering. </li><li> Ved hjelp av en lav-forstørrelse invertert mikroskop, verifisere bobler er fjernet fra mikrobrønnene. </li><li> Legg 0,4 mlcellesuspensjon ved den nødvendige densitet (beregnet ovenfor). Bland forsiktig ved pipettering opp og ned, uten å innføre luftbobler inn i mikrobrønner. Det er viktig å sørge for at cellene er jevnt fordelt over hele brønnen, for å oppnå konsistente sfæroider. </li><li> Sentrifuger i 5 min ved 200 x g. Hvis platen ikke selv nivå under sentrifugering, kan konveksjonsstrømmene oppstå som resultat i ujevn fordeling av celler på tvers av mikrobrønner. Derfor bør platen balanseres internt, så vel som mot den andre plate, slik at vekten blir jevnt fordelt på begge sider av platebæreren. </li></ol> MERK: Hvis tegn på ujevn cellefordeling er sett, kan det være nødvendig å bruke en liten mengde smøring til dreiepunktene på plate carrier - ta kontakt med sentrifuge produsenten for å få instruksjoner. MERK: Når cellene har blitt sentrifugert inn i mikro, de er rimelig resistig å vaske ut fra mindre bevegelser av platen. Brå bevegelser som resulterer i sloshing av mediet bør unngås, men overføringen av platen fra sentrifugen mikroskop eller inkubator bør ikke resultere i signifikant celle fortrengning. <ol start="6"><li> Ved hjelp av en invertert mikroskop, kontrollere at cellene har gruppert innenfor mikro, og at de er jevnt fordelt over brønnen. </li><li> Inkuber over natten ved 37 ° C. </li><li> Ved hjelp av et invertert mikroskop, observere prosessen av sfæroide formasjonen. Noen cellelinjer vil danne kompakte sfæroider innen 24 timer, andre kan ta lengre tid. Progresjonen av klyngen til å aggregere i HT29-celler er vist i figur 2.. </li><li> Gjenopprette sfæroider fra mikrobrønnene og overføre til suspensjon kultur ved forsiktig jetting dem ut med en pipette. Alternativt, vedlikeholde sfæroider in situ med middels erstatning 8 - avhengig av varigheten av sin opprinnelig størrelse og vekst, som define tid før de vokser fra mikrobrønnene der de ble dannet. <ol><li> For å skifte medium uten å miste sfæroider, aspirer medium på kanten av brønnen ved hjelp av en Pasteur pipette. Sakte bringe spissen ned til den begynner å trekke væske fra menisken, og følge menisken ned som den synker. Deretter legger friskt medium mot brønnveggen på samme sted. Et par sfæroider kan gå tapt, men dersom mediet er alltid aspirert og erstattet i den samme stilling, vil dette tallet være liten i forhold til det store antall i brønnen. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Hirschhaeuser, F., Menne, H., Dittfeld, C., West, J., Mueller-Klieser, W., Kunz-Schughart, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multicellular+tumor+spheroids:+An+underestimated+tool+is+catching+up+again.">Multicellular tumor spheroids: An underestimated tool is catching up again.</a> Journal of Biotechnology. 148 (1), 3-15 (2010).</li><li>Sherar, M. D., Noss, M. B., Foster, F. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrasound+backscatter+microscopy+images+the+internal+structure+of+living+tumour+spheroids.">Ultrasound backscatter microscopy images the internal structure of living tumour spheroids.</a> Nature. 330 (6147), 493-495 (1987).</li><li>Foty, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Simple+Hanging+Drop+Cell+Culture+Protocol+for+Generation+of+3D+Spheroids.">A Simple Hanging Drop Cell Culture Protocol for Generation of 3D Spheroids.</a> J. Vis. Exp. (51), 2720 (2011).</li><li>Naber, H. P. H., Wiercinska, E., Ten Dijke, P., Van Laar, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spheroid+Assay+to+Measure+TGF-&#946;-induced+Invasion.">Spheroid Assay to Measure TGF-&#946;-induced Invasion.</a> J. Vis. Exp. (57), e3337 (2011).</li><li>Ungrin, M. D., Joshi, C., Nica, A., Bauwens, C., Reproducible Zandstra, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ultra+high-throughput+formation+of+multicellular+organization+from+single+cell+suspension-derived+human+embryonic+stem+cell+aggregates.">ultra high-throughput formation of multicellular organization from single cell suspension-derived human embryonic stem cell aggregates.</a> PLoS ONE. 3 (2), e1565 (2008).</li><li>Bauwens, C. L., Song, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Geometric+control+of+cardiomyogenic+induction+in+human+pluripotent+stem+cells.">Geometric control of cardiomyogenic induction in human pluripotent stem cells.</a> Tissue Engineering. Part A. 17 (15-16), 1901-1909 (2011).</li><li>Bratt-Leal, A. M., Carpenedo, R. L., Ungrin, M. D., Zandstra, P. W., McDevitt, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Incorporation+of+biomaterials+in+multicellular+aggregates+modulates+pluripotent+stem+cell+differentiation.">Incorporation of biomaterials in multicellular aggregates modulates pluripotent stem cell differentiation.</a> Biomaterials. 32 (1), 48-56 (2011).</li><li>Ungrin, M. D., Clarke, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rational+bioprocess+design+for+human+pluripotent+stem+cell+expansion+and+endoderm+differentiation+based+on+cellular+dynamics.">Rational bioprocess design for human pluripotent stem cell expansion and endoderm differentiation based on cellular dynamics.</a> Biotechnology and Bioengineering. 109 (4), 853-866 (2012).</li><li>Markway, B. D., Tan, G. K., Brooke, G., Hudson, J. E., Cooper-White, J. J., Doran, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+chondrogenic+differentiation+of+human+bone+marrow-derived+mesenchymal+stem+cells+in+low+oxygen+environment+micropellet+cultures.">Enhanced chondrogenic differentiation of human bone marrow-derived mesenchymal stem cells in low oxygen environment micropellet cultures.</a> Cell Transplantation. 19 (1), 29-42 (2010).</li><li>Kozhich, O., Hamilton, R., Mallon, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Standardized+Generation+and+Differentiation+of+Neural+Precursor+Cells+from+Human+Pluripotent+Stem+Cells.">Standardized Generation and Differentiation of Neural Precursor Cells from Human Pluripotent Stem Cells.</a> Stem Cell Reviews and Reports. , 1-6 (2012).</li><li>Fey, S. J., Wrzesinski, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+of+Drug+Toxicity+Using+3D+Spheroids+Constructed+from+an+Immortal+Human+Hepatocyte+Cell+Line.">Determination of Drug Toxicity Using 3D Spheroids Constructed from an Immortal Human Hepatocyte Cell Line.</a> Toxicological Sciences. , (2012).</li><li>Mchedlishvili, L., Mazurov, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconstitution+of+the+central+and+peripheral+nervous+system+during+salamander+tail+regeneration.">Reconstitution of the central and peripheral nervous system during salamander tail regeneration.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. , (2012).</li><li>Butler, C. M., Foty, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+Aggregate+Cohesion+by+Tissue+Surface+Tensiometry.">Measurement of Aggregate Cohesion by Tissue Surface Tensiometry.</a> J. Vis. Exp. (50), e2739 (2011).</li><li>Xu, K., Buchsbaum, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+Mammary+Epithelial+Cells+from+Three-dimensional+Mixed-cell+Spheroid+Co-culture.">Isolation of Mammary Epithelial Cells from Three-dimensional Mixed-cell Spheroid Co-culture.</a> J. Vis. Exp. (62), e3760 (2012).</li><li>Baraniak, P. R., Cooke, M. T., Saeed, R., Kinney, M. A., Fridley, K. M., McDevitt, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stiffening+of+human+mesenchymal+stem+cell+spheroid+microenvironments+induced+by+incorporation+of+gelatin+microparticles.">Stiffening of human mesenchymal stem cell spheroid microenvironments induced by incorporation of gelatin microparticles.</a> Journal of the Mechanical Behavior of Biomedical Materials. 11, 63-71 (2012).</li><li>Purpura, K. A., Bratt-Leal, A. M., Hammersmith, K. A., McDevitt, T. C., Zandstra, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systematic+engineering+of+3D+pluripotent+stem+cell+niches+to+guide+blood+development.">Systematic engineering of 3D pluripotent stem cell niches to guide blood development.</a> Biomaterials. , (2012).</li></ol>

Dr. Ungrin har en økonomisk interesse i AggreWell teknologi som oppfinner.

Vi har etablert et system der et stort antall ensartede sfæroider kan frembringes fra flere cellelinjer fra forskjellige kilder. Vi har ennå å møte en tilhenger cellelinje som ikke danner sfæroider under disse forholdene. Vi har tidligere observert celle tap i populasjoner utsatt for anoikis 5,8, men til dags dato dette problemet har ikke oppstått med tumor linjer. Systemet er vilkårlig skalerbar med overflateareal, med konsekvent adferd tvers mikrobrønner i 24-brønns-og 6-brønners-formatet, samt prototype bioreaktorer inneholdende 50 000 mikrobrønner hver for tiden under utvikling. Skulle sfæroide asymmetri være et problem, kan det hende at inkubasjonstiden i trinn 4.8 økes til to eller tre dager. Sfæroider kan også bli inkubert i en periode etter ekstraksjon fra mikrobrønnene for å øke symmetri, men i dette tilfelle forsiktighet må utvises for å holde kulturen tettheter tilstrekkelig lavt, som sfæroider i kontakt med hverandre will ofte smelter sammen i større strukturer. På grunn av dette har vi tidligere opprettholdt kulturer innenfor mikrobrønnene hvor aggregatene ble dannet, med den primære begrensning er størrelsen av den sfæroide. Dette i sin tur er en funksjon av både vekst og opprinnelig størrelse 8, og hvis utvidet kultur innenfor mikroplaten er planlagt, bør dette vurderes på forhånd. Alternativer for å hindre gjengroing, bør det forekommer, er enten starter med mindre sfæroider, eller ansette de større mikro av AggreWell 800 plate. Skulle sfæroider ikke klarer å øke i koherens over tid, kan en potensiell årsak være celledød. Særlig i større aggregater av meget metabolsk aktive celler, kan massetransport begrensninger på levering av oksygen og essensielle næringsstoffer resultere i en nekrotisk kjerne 2 - således en ikke-kohesiv sfæroide kan ganske enkelt være en konsekvens av overdreven celledød. Alternativt kan målingene av mekaniske sammenhensjon av sfæroider som er blitt brukt for å vurdere intercellulære bindingsstyrker, i forhold til metastatisk potensiale for en gitt cellelinje 13.. Det ville være interessant å undersøke forholdet mellom spheroid form og metastatisk potensial, kanskje ved hjelp av morfometriske parametere som rundhet og omkretsen til området ratio. I tillegg til å undersøke de mekaniske og morfometriske egenskaper av sfæroider, konfeksjonering i mikrobrønnsystem gjør det mulig i stor skala produksjon av blandet komposisjon sfæroider, som består av kombinasjoner av forskjellige celletyper og / eller biomaterialer 6,7. Vekselvirkningen av tumorceller med andre celletyper som er viktige for nærmere modellere oppførselen av tumorer in vivo 14, og dermed kan det være av interesse for å generere sfæroider fra tumorceller i kombinasjon med fibroblaster og endotelceller, f.eks. Mikropartikler av forskjellige biomaterialer kan også være innarbeidet, og kan påvirke SPHeroid egenskaper både direkte gjennom deres interaksjon med cellene 7,15, og også som reservoar for kontrollert frigjøring av vekstfaktorer og cytokiner i det indre av den sfæroide 16.. Hvis det er noen bekymring om sterilitet, for eksempel når man arbeider med en mikroplate i hvilken noen brønner har tidligere vært brukt, som kan ha blitt brukt en gang i en inkubator som en del av et tidligere eksperiment, brønnene kan steriliseres på nytt med 70% etanol i vann. Når sfæroider er blitt dannet, kan de også bli separert fra gjenværende unincorporated celler ved å sende suspensjonen over et celle sil. Individuelle celler vil passere gjennom, mens de sfæroider vil bli beholdt. Hvis det er mistanke om den sfæroide av shedding potensielt metastatiske celler i løpet av kulturen, kan det være ønskelig å utføre denne fremgangsmåten flere ganger - først å fjerne unincorporated celler, og senere for å isolere renseded populasjoner av celler som avgis av sfæroider.

Det er en økende mengde bevis for at kreftceller oppfører seg forskjellig i tredimensjonale kulturer enn de gjør når dyrket på plast, og at terapeutiske midler identifisert på konvensjonelle vev-kultur plattformer kan miste effekt når overført til en mer fysiologisk-relevant system en. Det er derfor ønskelig å studere oppførselen av kreftceller under disse betingelser, både for å få innsikt i den underliggende biologi, og også for å øke den suksessrate på overgangen nye terapeutiske midler fra sikteanlegg til klinikken. Et nyttig modellsystem med en lang historie benytter tredimensjonal klynger av kreftceller er kjent som tumor sfæroider 1,2. Ideelt sett ville teknikker for sfæroide dannelse tillate produksjon av et stort antall sfæroider som har ensartede størrelse og sammensetning er kontrollert av experimenter. Selv om oppheng-slipp og godt platen nærmer seg 3,4 er i stand til å utføre noen av disse rekrav, gjennomstrømning er generelt begrenset, og generering av et stort antall sfæroider blir en arbeidskrevende oppgave. Vi har nylig utviklet et system for å løse tilsvarende utfordringer i regenerativ medisin feltet fem. Anvendelse av tvungen aggregering i løpet av en rekke tett pakkede mikron stilte brønner (se figur 1), tillater denne metode generering av sfæroider av vilkårlige antall celler, inkludert blandinger av flere celletyper 6, samt inkorporering av forskjellige biomaterialer 7. Sfæroider blir dannet i store mengder - flere tusen til flere hundre tusen eller mer - og kan ekstraheres umiddelbart eller opprettholdt i mikrobrønner i hvilken det er dannet med mellomutveksling for minst ett åtte til to (upublisert observasjon) uker. Dette systemet er derfor godt egnet til produksjon av store mengder uniform og reproduserbare tumor sfæroider for vurderingen av effectiveness av nye antitumor agenter eller grunnleggende biologiske undersøkelser.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Name of Reagent/Material</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AggreWell 400 plate</td>
			<td>StemCell Technologies Inc.</td>
			<td>27845/27945</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rinsing Solution</td>
			<td>StemCell Technologies Inc.</td>
			<td>07010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell strainer (37 <span id="docs-internal-guid-263ae0a0-aa3d-bddd-2a36-2ae1901f1604" style="font-size:15px;font-family:Arial;color:#000000;background-color:#ffffff;font-weight:normal;font-style:normal;font-variant:normal;text-decoration:none;vertical-align:baseline;">&#181;m)</td>
			<td>StemCell Technologies Inc.</td>
			<td>27215</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>VWR / LONZA</td>
			<td>CA12001-676</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-Versene (EDTA)</td>
			<td>VWR / LONZA</td>
			<td>CA12001-660</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>VWR / LONZA</td>
			<td>CA12002-212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>VWR / LONZA</td>
			<td>CA-95042-112</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrypLE</td>
			<td>Invitrogen / Life Technologies</td>
			<td>12605010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted microscope</td>
			<td>VWR / Motic</td>
			<td>CA19000-610</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Allegra X15R centrifuge with carriers for standard well plates</td>
			<td>VWR / Beckman</td>
			<td>CABKA99465, CABK369704, CABK392806</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminar flow biosafety cabinet</td>
			<td>ESBE / Baker</td>
			<td>BKR-SG603AHEUVSP</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

production of large numbers of size-controlled tumor spheroids using microwell plates

Tumor sfæroider blir stadig mer anerkjent som en viktig in vitro-modell for oppførselen av tumorceller i tre dimensjoner. Mer fysiologisk relevant enn konvensjonelle tilhenger-arks kulturer, de er mer nøyaktig rekapitulere kompleksiteten og interaksjoner stede i reelle svulster. For å kunne utnytte denne modellen for å bedre vurdere tumorbiologi, eller effekten av nye terapeutiske midler, er det nødvendig å være i stand til å generere sfæroider reproduserbart, på en kontrollert måte og i et betydelig antall. Den AggreWell systemet består av en høytetthets matrise av pyramideformede mikrobrønner, i hvilken en suspensjon av enkeltceller ble sentrifugert. Antallet celler clustering på bunnen av hver mikrobrønn, og antallet og forholdet mellom forskjellige celletyper som er involvert avhenger kun av egenskapene til suspensjonen innføres ved experimenter. Dermed er vi i stand til å generere tumor sfæroider av vilkårlig størrelse og sammensetning medut som ønsker å endre den underliggende plattform teknologi. De hundrevis av mikrobrønner per kvadratcentimeter av kultur areal i sin tur sikrer at svært høye produksjonsnivåer kan oppnås via en grei, nonlabor krevende prosess. Vi forventer derfor at denne protokollen skal være bredt nyttig for forskere i svulsten spheroid feltet.

Sfæroider fra forskjellige tumorlinjer av forskjellig opprinnelse anatomiske kan lett bli generert og ekstrahert inn i suspensjonskultur. Figur 3 illustrerer jevn størrelse kontroll fremskaffes via denne metoden, med sterkt ensartede sfæroide populasjoner under hver betingelse. Klare inter-linje forskjeller i atferd er også synlig, med HT29 tykktarmskreftceller og TE6 esophageal kreftcellene danner tettpakkede sfæroider med skarpe grenser, mens LNCaP prostatakreftceller ga opphav til mindre sammenhengende sfæroider med uregelmessige grenser (se diskusjon for mulige årsaker ). De sterkere indre krefter i de mer koherente aggregater resulterte også i kollapset til en mer symmetrisk formen selv mens fortsatt i mikrobrønner i hvilken det er dannet, mens de LNCAP aggregater, spesielt ved de større størrelser, synlig beholde kvadratisk pyramideformet geometri i mikrobrønner. Forholdet mellom inngangscellenumrene og Phys<html> ical størrelsen av den resulterende sfæriske legemet vil avhenge av en rekke variabler. Teoretiske volumer basert på produktet av volumet per celle og antall celler som anvendes kan reduseres ved celletap, som i sin tur kan omfatte tap av celler i løpet av enkeltcellesuspensjon trinn, så vel som tap som følge av overdrevet små aggregater på grunn utilstrekkelig antall naboer og fra overdrevent store aggregater på grunn av transportbegrensninger og nekrose i kjernen. Størrelse vil også bli påvirket av enhver spredning som kan oppstå i løpet av samlingsprosess. Ettersom disse parametre vil variere fra cellelinje til cellelinje, hvis sfæroider med spesifikke fysikalske dimensjoner er ønsket riktig antall celler å innføre må bestemmes eksperimentelt. Som en første tilnærming, er sfæroide diameter forventes å øke med kubikkroten av antallet av celler som inkorporerte - for eksempel en 8 gangers økning i antall celler bør resultere i en dobling av sfæroide diameter. <html> _content &quot;fo: keep-together.within-page =&quot; always &quot;&gt; <img alt="Figur 1" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50665/50665fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50665/50665fig1.jpg" /> Figur 1. Skjematisk av sfæroide produksjon. Mikrosystemet består av en rekke tett pakket kvadratisk pyramideformet mikrobrønner (625 per cm 2 til 400 <span id="docs-internal-guid-263ae0a0-aa35-f9c7-69a1-8c5aa197db53" style="font-size:15px;font-family:Arial;color:#000000;background-color:#ffffff;font-weight:normal;font-style:normal;font-variant:normal;text-decoration:none;vertical-align:baseline;">μ m størrelse), i hvilket cellene kan bli sentrifugert. Cellene blir samlet ved den skrå sidevegger, og størrelsen av det resulterende sfæriske legemet kontrolleres ved å variere tettheten av cellesuspensjonen som anvendes. 50665fig2highres.jpg &quot;src =&quot; / files/ftp_upload/50665/50665fig2.jpg &quot;/&gt; Figur 2. Montering av grupperte celler i sfæroider Spheroids ble dannet fra syv hundre HT29 celler hver.. Umiddelbart etter sentrifugering (A), blir cellene løst gruppert i bunnen av hver mikrobrønn. Legg merke til at klyngene er jevnt forskjøvet mot den nedre høyre i dette tilfellet. Dette er akseptabelt gitt blokkstørrelser, forblir konsistente på tvers av tabellen. Hvis vesentlig cluster størrelsesforskjeller er sett fra den ene side av rekken til den andre, se note i trinn 3.5. Etter inkubering i 24 timer (B), har intercellulære adhesive krefter forårsaket partikkelbuntene til å aggregere og danne sammenhengende sfæroider, som deretter kan trekkes ut (C). <img alt="Figur 3" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50665/50665fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50665/50665fig3.jpg" /><b<html> r /&gt; Figur 3. Sfæroider som genereres i mikroplater Spheroids ble dannet fra. Syv hundre (A, C, E), eller femtenhundre (B, D, F) HT29 kolon kreftceller (A, B), LNCaP prostatakreftceller (C, D) eller TE6 esophageal kreftceller (E, F). Legg merke til konsistensen av sfæroider i et preparat, og også variasjonen mellom cellelinjer - spesielt de løse LNCAP aggregater i forhold til den mer tettpakket HT29 og TE6 celler. Scale bar representerer 200 mikrometer. <table border="1"><tbody><tr><td></td><td colspan="3"> Mikroformat </td></tr><tr><td></td><td> AggreWell 400 </td><td> AggreWell 40EX </td><td> AggreWell 800 </td></tr><tr><td> Mikro bredde (al;color:#000000;background-color:#ffffff;font-weight:normal;font-style:normal;font-variant:normal;text-decoration:none;vertical-align:baseline;&quot;&gt;µm ) </td><td> 400 </td><td> 400 </td><td> 800 </td></tr><tr><td> Mikro per cm 2 </td><td> 625 </td><td> 625 </td><td> 156,25 </td></tr><tr><td> Mikro per brønn </td><td> 1200 </td><td> 4700 </td><td> 300 </td></tr><tr><td> Minste celler per mikro * </td><td> N / A </td><td> N / A </td><td> 2000 </td></tr><tr><td> Maksimale celler per mikro * </td><td> 2000 </td><td> 2000 </td><td> 10000 </td></tr><tr><td> Minste celler per brønn * </td><td> N / A </td><td> N / A </td><td> 6 x 10 5 </td></tr><tr><td> Maksimale celler per brønn * </td><td> 2,4 x 10 6 </td><td> 9,4 x 10 6 </td><td> 3 x 10 til 6 </td></tr><tr><td> 1.1.1 - 70% Etanol volum (ml) </td><td> 0,5 </td><td> 2,0 </td><td> 0.5 </td></tr><tr><td> 1.2.1 - Skylleløsningsvolum (ml) </td><td> 0,5 </td><td> 2,0 </td><td> 0,5 </td></tr><tr><td> 3,2 - Medium preload volum (ml) </td><td> 0,4 </td><td> 1.6 </td><td> 0,4 </td></tr><tr><td> 3,5 - Cell lastevolum (ml) </td><td> 0,4 </td><td> 1.6 </td><td> 0,4 </td></tr><tr><td colspan="4"> * Antall celler pr mikro er bare et anslag som denne verdi vil variere med størrelsen av de spesifikke cellene som anvendes, og må bestemmes empirisk </td></tr></tbody></table> Tabell 1. AggreWell alternativer og protokoll modifikasjoner.

Watch this Scientific Journal Video about Production of Large Numbers of Size-controlled Tumor Spheroids Using Microwell Plates at JoVE.com

Production of Large Numbers of Size-controlled Tumor Spheroids Using Microwell Plates

Vi introduserer en protokoll for generering av store tall (tusen til flere hundre tusen) med lik størrelse-og komposisjonsstyrt svulst sfæroider, ved hjelp av kommersielt tilgjengelige mikroplater.

Produksjon av et stort antall Size-kontrollerte Tumor Spheroids Bruke Micro Plates

Tumor spheroids are increasingly recognized as an important in vitro model for the behavior of tumor cells in three dimensions. More physiologically ...

Research

JoVE Journal

Bioengineering

A Simple Hanging Drop Cell Culture Protocol for Generation of 3D Spheroids

Studies of cell-cell cohesion and cell-substratum adhesion have historically been performed on monolayer cultures adherent to rigid substrates. Cells ...

Nonhuman Primate Lung Decellularization and Recellularization Using a Specialized Large-organ Bioreactor

Nonhuman Primate Lung Decellularization og Recellularization Ved hjelp av en Specialized Stor-orgel bioreaktor

There are an insufficient number of lungs available to meet current and future organ transplantation needs. Bioartificial tissue regeneration is an ...

Nutrient Regulation by Continuous Feeding for Large-scale Expansion of Mammalian Cells in Spheroids

Nutrient Regulering av Kontinuerlig Fôring for storstilt utvidelse av pattedyrceller i Spheroids

In this demonstration, spheroids formed from the &#946;-TC6 insulinoma cell line were cultured as a model of manufacturing a mammalian islet cell product ...

Robotic Production of Cancer Cell Spheroids with an Aqueous Two-phase System for Drug Testing

Robotic Produksjon av Cancer Cell Spheroids med en vandig To-fase system for Drug Testing

Cancer cell spheroids present a relevant in vitro model of avascular tumors for anti-cancer drug testing applications. A detailed protocol for producing ...

Cloning and Large-Scale Production of High-Capacity Adenoviral Vectors Based on the Human Adenovirus Type 5

Kloning og storskala produksjon av høykapasitets adenovirusvektorer Basert på Human adenovirus type 5

High-capacity adenoviral vectors (HCAdV) devoid of all viral coding sequences represent one of the most advanced gene delivery vectors due to their high ...

Creation of Cardiac Tissue Exhibiting Mechanical Integration of Spheroids Using 3D Bioprinting

Opprettelse av hjertevæv som viser mekanisk integrasjon av sfæroider ved hjelp av 3D bioprinting

This protocol describes 3D bioprinting of cardiac tissue without the use of biomaterials, using only cells. Cardiomyocytes, endothelial cells and ...

Assembly and Tracking of Microbial Community Development within a Microwell Array Platform

Montering og sporing av mikrobiel samfunnsutvikling innenfor en Microwell Array-plattform

The development of microbial communities depends on a combination of complex deterministic and stochastic factors that can dramatically alter the spatial ...

Production of Chemicals by Klebsiella pneumoniae Using Bamboo Hydrolysate as Feedstock

Production of Chemicals by Klebsiella pneumoniae Using Bamboo Hydrolysate as Feedstock

Produksjon av kjemikalier av<em&gt; Klebsiella pneumoniae</em&gt; Bruke bambushydrolysat som råstoff

Bamboo is an important biomass, and bamboo hydrolysate is used by Klebsiella pneumoniae as a feedstock for chemical production. Here, bamboo powder was ...

Generic Protocol for Optimization of Heterologous Protein Production Using Automated Microbioreactor Technology

Generisk protokoll for optimalisering av Heterologous Protein produksjonen ved hjelp av automatisert Microbioreactor teknologi

A core business in industrial biotechnology using microbial production cell factories is the iterative process of strain engineering and optimization of ...

Affordable Oxygen Microscopy-Assisted Biofabrication of Multicellular Spheroids

Rimelig oksygenmikroskopiassistert biofabrikasjon av multicellulære sfæroider

Multicellular spheroids are important tools for studying tissue and cancer physiology in 3D and are frequently used in tissue engineering as tissue ...