Name: production of large numbers of size-controlled tumor spheroids using microwell plates
Uploaded: 2013-11-18T20:00:00
Duration: 10 min 44 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Production of Large Numbers of Size-controlled Tumor Spheroids Using Microwell Plates at JoVE.com

Detta arbete har finansierats av University of Calgary, enligt en ny utredare startpeng till Dr Ungrin.

NOTERA: Mikrobrunnsremsorna plattor finns tillgängliga i olika format, beroende på de önskade resultaten. Specifikationer samt ungefärliga riktlinjer för de lägsta och högsta antal celler som bör användas med varje format visas i tabell 1. De mindre mikrobrunnar avsmalna till en vass spets, och därmed finns det ingen storleksgräns lägre, även om variationen mellan spheroids blir mer signifikant vid mindre storlekar. Rutinmässig produktion av sfäroider från ett genomsnitt på så lite som 20 celler vardera är okomplicerad 8. Ju större mikrostorlek är inte fullt avsmalnande, försöker därför att bilda sfäroider från små mängder celler kan resultera i flera mindre sfäroider i varje brunn. På grund av små skillnader i ytegenskaper, är preparatet med lösningen tensid (steg 1,2) inte valfritt vid användning AggreWell 400EX plattor. Detta protokoll är baserad på användning av AggreWell 400 plattor - för andra format nackdelarult Tabell 1. Antalet celler som skall lastas i varje brunn bestäms genom att multiplicera antalet mikrobrunnar den innehåller med antalet celler som skall klustrade för varje sfäroid. Till exempel, för att generera spheroids från 1000 celler styck, skall varje brunn belastas med (1.200 sfäroider gånger 1.000 celler vardera =) 1,2 x 10 6 celler. Celldensitet måste beräknas med hänsyn till att de celler som kommer att läsas in i en volym av 0,4 ml. Så till exempel sfäroider bildats från 1000 celler vardera, 1,2 x 10 6 celler i 0,4 ml översätter till en densitet av 3 x 10 6 celler per ml. 1. Förbereda mikrobrunnar för att ta emot celler <ol><li> Mikroplattor är sterila som tillhandahålls, och bör endast tas bort ur förpackningen i en steril miljö som ett laminärt flöde biosäkerhet skåp. Sterilitet bör bibehållas genom hela protokollet. Bör sterilitet äventyras, brunnarna omsteriliseras använder 70% etanol i vatten med hjälp avFöljande valfria steg. <ol><li> Lägg till 0,5 ml av 70% etanol till varje oanvänd väl. Vissa mikrobrunnarna kommer fälla luftbubblor, även om detta kan minskas genom att tillsätta vätska på ena sidan, och gör det möjligt att sprida sig över ytan, i stället för att släppa den lodrätt på ytan. Sätt tillbaka locket. </li><li> Även etanolånga bör snabbt genomsyra alla bubblor, om det finns stora mängder kan det vara önskvärt att ta bort dem. Centrifugera i 2 min vid 2000 x g.. Observera att det är viktigt att säkerställa att rotorn är korrekt balanseras vid denna hastighet. </li><li> Med hjälp av en låg förstoring inverterat mikroskop, kontrollera bubblor har tagits bort från mikrobrunnarna. </li><li> Inkubera i 5 min med locket på vid rumstemperatur. </li><li> Aspirera etanol. Plansch kan nu tvättas med sterilt vatten eller PBS för omedelbar användning, eller lufttorkas för lagring. </li></ol></li><li> För att säkerställa att celler som inte interagerar med mikrobrunnsytan, kan den framställas med användning av ett ytaktivt medel. I allmänhet är detlämpligt att utföra detta steg initialt, och därefter jämföra spheroids genereras med och utan ytaktiva belagda mikrobrunnarna. <ol><li> Lägg till 0,5 ml av sköljlösning till varje brunn. Vissa mikrobrunnarna kommer fälla luftbubblor, även om detta kan minskas genom att tillsätta vätska på ena sidan, och gör det möjligt att sprida sig över ytan, i stället för att släppa den lodrätt på ytan. Sätt tillbaka locket. </li><li> Centrifugera i 2 min vid 2000 xg för att avlägsna bubblor. Observera att det är viktigt att säkerställa att rotorn är korrekt balanseras vid denna hastighet. </li><li> Med hjälp av en låg förstoring inverterat mikroskop, kontrollera bubblor har tagits bort från mikrobrunnarna. </li><li> Inkubera i minst trettio minuter med locket på vid rumstemperatur eller över natten vid 4 ° C. Plattorna kan förvaras vid fyra grader med den ytaktiva lösningen i brunnarna tills det behövs om ordentligt tätad för att förhindra uttorkning. </li><li> Tvätta plattan med sterilt vatten eller PBS omedelbart före användning. Låt inte plattoratt torka ut efter beläggning. </li></ol></li></ol> 2. Förberedelser Celler OBS: Detaljerna i framställningen cell kommer att variera något med den specifika celltypen som studeras. Vi har dock observerat dessa villkor för att vara effektiv med ett brett spektrum av celler, inklusive linjerna diskuteras här, såväl som humana och murina embryonala stamceller (ESC), mänskliga inducerade pluripotenta stamceller (IPSC), fibroblaster, förmodad primitiva endoderm, och stromaceller. Andra grupper har använt detta system framgångsrikt för ett brett spektrum av tillämpningar, inklusive kondrogenes från mesenkymala stamceller 9, standardiserad generation av neurala prekursorer från pluripotenta stamceller 10, analyserar toxikologiska i hepatocyter 11 och utvärdering av ryggmärgen förnyelse i salamandrar 12. Det specifika protokoll för bearbetning av HT29-celler visas här. <ol><li> Börja med en T75 kolv med HT29 celler, odlade i DMEM+ 10% FBS </li><li> Sug tillväxtmedium från kolv och tillsätt 3 ml trypsin. </li><li> Inkubera cellerna under 5 min vid 37 ° C. </li><li> Stoppa trypsin matsmältningen genom att tillsätta 3 ml odlingsmedium. Tag en alikvot för cellräkning och överför resten till ett 15 ml centrifugrör. </li><li> Centrifugera i 5 minuter vid 200 x g.. </li><li> Medan centrifugering pågår, räkna celler. </li><li> Sug trypsin / mediumblandningen och ersätt med färskt odlingsmedium, volym bestäms av den önskade celldensiteten enligt beräkningen ovan. </li><li> (TILLVAL) Passera cellsuspension genom en sil för att få bort eventuella klumpar. OBS: Cellskördeförhållanden varierar något mellan raderna. Om en dissociation protokoll för t.ex. ympa om de celler av intresse är tillgänglig, bör det användas som utgångspunkt. Med känsliga cellinjer använda trypsin kan leda till omfattande celldöd. I dessa fall har vi observerat goda resultat med användning TrypLE som alternativ dissociatipå reagens 8. Om cellerna blir hopklumpade under dissociation och förlorar livskraft, kan tillägg av DNAs till enzymlösningen lösa detta. Minska dissociation gånger och anställa en rivning steg för att bryta upp cellklumpar kan också öka lönsamheten. </li></ol> 3. Sfäroid Formation OBSERVERA: sfäroider kan alstras i en mängd olika medelformuleringar emellertid inledande försök bör genomföras med hjälp av mediet i vilket cellerna odlades, särskilja följder av övergår till en 3-dimensionell odlingssystem från konsekvenserna av att ändra medelkompositionen. <ol><li> Lägg till 0,4 ml odlingsmedium till varje brunn. </li><li> Centrifugera i 2 min vid 2000 xg för att avlägsna bubblor. Observera att det är viktigt att säkerställa att rotorn är korrekt balanseras vid denna hastighet före centrifugering. </li><li> Med hjälp av en låg förstoring inverterat mikroskop, kontrollera bubblor har tagits bort från mikrobrunnarna. </li><li> Lägg till 0,4 mlcellsuspension vid den erforderliga densiteten (beräknad ovan). Blanda försiktigt genom att pipettera upp och ner, utan att införa luftbubblor i mikrobrunnarna. Det är viktigt att se till att cellerna är jämnt fördelade i hela brunnen, för att erhålla konsekventa sfäroider. </li><li> Centrifugera i 5 minuter vid 200 x g.. Om plattan inte själv-nivå under centrifugeringen, kan konvektionsströmmar uppstår som leder till ojämn fördelning av celler över mikrobrunnarna. Därför bör plattan vara balanserad internt såväl som mot den andra plattan, så att vikten är jämnt fördelad på båda sidor av skivhållaren. </li></ol> OBS: Om tecken på ojämn cellfördelning ses, kan det vara nödvändigt att använda en liten mängd av smörjning till svängpunkterna på plattan bäraren - rådgöra med centrifug tillverkaren för instruktioner. ANMÄRKNING: När cellerna har centrifugeras till mikrobrunnarna, de är tillräckligt motståndtigt att uttvättning från smärre rörelser hos plattan. Plötsliga rörelser som resulterar i sloshing av mediet bör undvikas, men överföringen av plattan från centrifugen till mikroskop eller inkubatorn ska inte leda till betydande cellförskjutning. <ol start="6"><li> Med hjälp av ett inverterat mikroskop, kontrollera att cellerna har klustrade inom mikrobrunnarna, och att de är jämnt fördelade över brunnen. </li><li> Inkubera över natten vid 37 ° C. </li><li> Med hjälp av ett inverterat mikroskop, observera processen av sfäroid formation. Vissa cellinjer bildar kompakta spheroids inom 24 timmar, andra kan ta längre tid. Progressionen från klustret att aggregera i HT29-celler visas i Figur 2. </li><li> Åter spheroids från mikrobrunnarna och överför till suspensionskultur genom att försiktigt spruta ut dem med en pipett. Alternativt, underhålla spheroids in situ med medel ersättare 8 - hur länge beror på deras ursprungliga storlek och tillväxthastighet, som define tiden tills de växer ifrån mikrobrunnarna i vilka de bildades. <ol><li> För att byta medium utan att förlora spheroids, aspirera mediet vid kanten av brunnen med hjälp av en Pasteur-pipett. Sakta föra spetsen nedåt tills den börjar dra vätska från menisken, och följ menisken ner så det droppar. Sedan till färskt medium mot brunnsväggen på samma ställe. Några sfäroider kan gå förlorade, så om mediet alltid aspireras och ersätts i samma läge, kommer detta antal att förbli små i jämförelse med det stora antalet i brunnen. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Hirschhaeuser, F., Menne, H., Dittfeld, C., West, J., Mueller-Klieser, W., Kunz-Schughart, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multicellular+tumor+spheroids:+An+underestimated+tool+is+catching+up+again.">Multicellular tumor spheroids: An underestimated tool is catching up again.</a> Journal of Biotechnology. 148 (1), 3-15 (2010).</li><li>Sherar, M. D., Noss, M. B., Foster, F. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrasound+backscatter+microscopy+images+the+internal+structure+of+living+tumour+spheroids.">Ultrasound backscatter microscopy images the internal structure of living tumour spheroids.</a> Nature. 330 (6147), 493-495 (1987).</li><li>Foty, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Simple+Hanging+Drop+Cell+Culture+Protocol+for+Generation+of+3D+Spheroids.">A Simple Hanging Drop Cell Culture Protocol for Generation of 3D Spheroids.</a> J. Vis. Exp. (51), 2720 (2011).</li><li>Naber, H. P. H., Wiercinska, E., Ten Dijke, P., Van Laar, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spheroid+Assay+to+Measure+TGF-&#946;-induced+Invasion.">Spheroid Assay to Measure TGF-&#946;-induced Invasion.</a> J. Vis. Exp. (57), e3337 (2011).</li><li>Ungrin, M. D., Joshi, C., Nica, A., Bauwens, C., Reproducible Zandstra, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ultra+high-throughput+formation+of+multicellular+organization+from+single+cell+suspension-derived+human+embryonic+stem+cell+aggregates.">ultra high-throughput formation of multicellular organization from single cell suspension-derived human embryonic stem cell aggregates.</a> PLoS ONE. 3 (2), e1565 (2008).</li><li>Bauwens, C. L., Song, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Geometric+control+of+cardiomyogenic+induction+in+human+pluripotent+stem+cells.">Geometric control of cardiomyogenic induction in human pluripotent stem cells.</a> Tissue Engineering. Part A. 17 (15-16), 1901-1909 (2011).</li><li>Bratt-Leal, A. M., Carpenedo, R. L., Ungrin, M. D., Zandstra, P. W., McDevitt, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Incorporation+of+biomaterials+in+multicellular+aggregates+modulates+pluripotent+stem+cell+differentiation.">Incorporation of biomaterials in multicellular aggregates modulates pluripotent stem cell differentiation.</a> Biomaterials. 32 (1), 48-56 (2011).</li><li>Ungrin, M. D., Clarke, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rational+bioprocess+design+for+human+pluripotent+stem+cell+expansion+and+endoderm+differentiation+based+on+cellular+dynamics.">Rational bioprocess design for human pluripotent stem cell expansion and endoderm differentiation based on cellular dynamics.</a> Biotechnology and Bioengineering. 109 (4), 853-866 (2012).</li><li>Markway, B. D., Tan, G. K., Brooke, G., Hudson, J. E., Cooper-White, J. J., Doran, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+chondrogenic+differentiation+of+human+bone+marrow-derived+mesenchymal+stem+cells+in+low+oxygen+environment+micropellet+cultures.">Enhanced chondrogenic differentiation of human bone marrow-derived mesenchymal stem cells in low oxygen environment micropellet cultures.</a> Cell Transplantation. 19 (1), 29-42 (2010).</li><li>Kozhich, O., Hamilton, R., Mallon, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Standardized+Generation+and+Differentiation+of+Neural+Precursor+Cells+from+Human+Pluripotent+Stem+Cells.">Standardized Generation and Differentiation of Neural Precursor Cells from Human Pluripotent Stem Cells.</a> Stem Cell Reviews and Reports. , 1-6 (2012).</li><li>Fey, S. J., Wrzesinski, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+of+Drug+Toxicity+Using+3D+Spheroids+Constructed+from+an+Immortal+Human+Hepatocyte+Cell+Line.">Determination of Drug Toxicity Using 3D Spheroids Constructed from an Immortal Human Hepatocyte Cell Line.</a> Toxicological Sciences. , (2012).</li><li>Mchedlishvili, L., Mazurov, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconstitution+of+the+central+and+peripheral+nervous+system+during+salamander+tail+regeneration.">Reconstitution of the central and peripheral nervous system during salamander tail regeneration.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. , (2012).</li><li>Butler, C. M., Foty, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+Aggregate+Cohesion+by+Tissue+Surface+Tensiometry.">Measurement of Aggregate Cohesion by Tissue Surface Tensiometry.</a> J. Vis. Exp. (50), e2739 (2011).</li><li>Xu, K., Buchsbaum, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+Mammary+Epithelial+Cells+from+Three-dimensional+Mixed-cell+Spheroid+Co-culture.">Isolation of Mammary Epithelial Cells from Three-dimensional Mixed-cell Spheroid Co-culture.</a> J. Vis. Exp. (62), e3760 (2012).</li><li>Baraniak, P. R., Cooke, M. T., Saeed, R., Kinney, M. A., Fridley, K. M., McDevitt, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stiffening+of+human+mesenchymal+stem+cell+spheroid+microenvironments+induced+by+incorporation+of+gelatin+microparticles.">Stiffening of human mesenchymal stem cell spheroid microenvironments induced by incorporation of gelatin microparticles.</a> Journal of the Mechanical Behavior of Biomedical Materials. 11, 63-71 (2012).</li><li>Purpura, K. A., Bratt-Leal, A. M., Hammersmith, K. A., McDevitt, T. C., Zandstra, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systematic+engineering+of+3D+pluripotent+stem+cell+niches+to+guide+blood+development.">Systematic engineering of 3D pluripotent stem cell niches to guide blood development.</a> Biomaterials. , (2012).</li></ol>

Dr Ungrin har ett ekonomiskt intresse i AggreWell teknik som uppfinnare.

Vi har etablerat ett system där ett stort antal enhetliga spheroids kan genereras från flera cellinjer från olika källor. Vi har ännu inte stöta på en vidhäftande cellinje som inte bildar spheroids under dessa förhållanden. Vi har tidigare observerat cellförlust i populationer utsatta för anoikis 5,8, men hittills i fråga har inte uppkommit med tumörlinjer. Systemet är godtyckligt skalbar med ytan, med uppförande konsekvent mellan mikrobrunnar i 24-väl och 6 brunnar, samt prototyp bioreaktorer innehållande 50.000 mikrobrunnar var närvarande under utveckling. Bör Sfäroid asymmetri vara ett bekymmer, kan inkubationstiden i steg 4.8 ökas till två eller tre dagar. Spheroids kan även inkuberas under en period efter extraktion från mikrobrunnarna för att öka symmetrin, men i detta fall måste man se till att hålla odlingstätheten är tillräckligt låg, som sfäroider i kontakt med varandra will ofta smälter samman till större strukturer. Av den anledningen har vi tidigare underhålls kulturer inom mikrobrunnarna där aggregaten bildades, med det primära begränsningen är storleken på sfäroid. Detta i sin tur är en funktion av både tillväxt och initial storlek 8, och om förlängd kultur inom mikrobrunnsplattan planeras, bör detta beaktas i förväg. Alternativ för att förhindra igenväxning, om den uppstår, inkluderar antingen starta med mindre sfäroider, eller anställa de större mikrobrunnarna i AggreWell 800 plattan. Bör sfäroider misslyckas med att öka i överensstämmelse med tiden, kan en potentiell orsak vara celldöd. Särskilt i större aggregat av mycket metaboliskt aktiva celler, kan begränsningar masstransport på leveransen av syre och näringsämnen resultera i en nekrotisk kärna 2 - alltså en icke-sammanhängande sfäroid kan helt enkelt vara en följd av överdriven celldöd. Alternativt kan mätningar av den mekaniska sammanhållsionen av sfäroider har använts för att utvärdera intercellulära bindningskrafter, i relation till den metastatiska potentialen hos en viss cell-linje 13. Det skulle vara intressant att undersöka förhållandet mellan sfäroid form och metastatisk potential, kanske med hjälp av morfometriska parametrar som rundhet och omkrets areaförhållande till. Förutom att undersöka de mekaniska och morfometriska egenskaper spheroids, montering i mikrosystemet möjliggör storskalig produktion av blandad sammansättning sfäroider, som består av kombinationer av flera typer och / eller biomaterial 6,7 cell. De interaktioner av tumörceller med andra celltyper som är viktiga för att närmare simulera beteendet hos tumörer in vivo 14 och därigenom kan det vara av intresse för att generera sfäroider från tumörceller i kombination med fibroblaster och endotelceller, till exempel. Mikropartiklar av olika biomaterial kan även införlivas, och kan påverka sferoid egenskaper både direkt genom deras interaktioner med celler 7,15, och även som behållare för kontrollerad frisättning av tillväxtfaktorer och cytokiner i det inre av den sfäroid 16. Om det finns någon oro för sterilitet, exempelvis när man arbetar med en mikrobrunnsplatta i vilken vissa brunnar har tidigare använts, som kan ha tillbringat en tid i en inkubator som en del av ett tidigare experiment, brunnarna kan steriliseras med 70% etanol i vatten. När sfäroider har bildats, kan de också separeras från kvarvarande icke-registrerade celler genom att passera suspensionen över en cell sil. Individuella celler kommer att passera genom, medan sfäroiderna kommer att bevaras. Om sfäroiden misstänks sprider potentiellt metastaserande celler under loppet av kulturen, kan det vara önskvärt att utföra den här proceduren flera gånger - först för att avlägsna icke etablerade celler, och därefter isolera purified populationer av celler som avges från sfäroiderna.

Det finns en ökande mängd bevis för att tumörceller beter sig olika i tredimensionella kulturer än de gör när de odlas på plast, och det terapeutiska medel som identifierats på konventionella vävnadskulturplattformar kan förlora effekt när övergått till ett mer fysiologiskt relevant systemet 1. Det är därför önskvärt att studera hur cancerceller under dessa förhållanden, både för att få insikt i deras bakomliggande biologi, och även för att öka andelen framgångsrika övergång nya terapeutiska medel från screeningen anläggningen till kliniken. En användbar modellsystem med en lång historia sysselsätter tredimensionella kluster av cancerceller som kallas tumör sfäroider 1,2. Helst skulle tekniker för sfäroid bildning medger produktion av ett stort antal enhetliga spheroids vars storlek och sammansättning styrs av försöksledaren. Medan hängande-släpp och väl-plattan närmar sig 3,4 har möjlighet att uppfylla en del av dessa rekrav, genomströmningen är i allmänhet begränsad, samt generering av ett stort antal spheroids blir en arbetsintensiv uppgift. Vi har nyligen utvecklat ett system för att lösa liknande problem i regenerativ medicin fält 5. Anställa tvingas aggregering inom en rad tätt packade mikrometerstorlek brunnar (se figur 1), medger detta tillvägagångssätt generering av sfäroider från godtyckliga antal celler, inbegripet blandningar av flera celltyper 6, samt införlivandet av olika biomaterial 7. Sfäroider bildas i stort antal - tusentals till hundratusentals eller flera - och kan extraheras omedelbart eller bibehållas i mikrobrunnarna i vilket de bildade med mediumutbyte i minst en 8 till två (opublicerad observation) veckor. Detta system är därför väl lämpad för generering av ett stort antal enhetliga och reproducerbara tumör spheroids för bedömningen av effectiveness av nya antitumörmedel eller grundläggande biologiska undersökningar.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Name of Reagent/Material</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AggreWell 400 plate</td>
			<td>StemCell Technologies Inc.</td>
			<td>27845/27945</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rinsing Solution</td>
			<td>StemCell Technologies Inc.</td>
			<td>07010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell strainer (37 <span id="docs-internal-guid-263ae0a0-aa3d-bddd-2a36-2ae1901f1604" style="font-size:15px;font-family:Arial;color:#000000;background-color:#ffffff;font-weight:normal;font-style:normal;font-variant:normal;text-decoration:none;vertical-align:baseline;">&#181;m)</td>
			<td>StemCell Technologies Inc.</td>
			<td>27215</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>VWR / LONZA</td>
			<td>CA12001-676</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-Versene (EDTA)</td>
			<td>VWR / LONZA</td>
			<td>CA12001-660</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>VWR / LONZA</td>
			<td>CA12002-212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>VWR / LONZA</td>
			<td>CA-95042-112</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrypLE</td>
			<td>Invitrogen / Life Technologies</td>
			<td>12605010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted microscope</td>
			<td>VWR / Motic</td>
			<td>CA19000-610</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Allegra X15R centrifuge with carriers for standard well plates</td>
			<td>VWR / Beckman</td>
			<td>CABKA99465, CABK369704, CABK392806</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminar flow biosafety cabinet</td>
			<td>ESBE / Baker</td>
			<td>BKR-SG603AHEUVSP</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

production of large numbers of size-controlled tumor spheroids using microwell plates

Tumör spheroids erkänns alltmer som en viktig modell in vitro för beteendet hos tumörceller i tre dimensioner. Mer fysiologiskt relevant än konventionella kulturer vidhäftande ark, de mer exakt rekapitulera komplexiteten och samspelet som finns i verkliga tumörer. För att utnyttja denna modell för att bättre bedöma tumörbiologi, eller effekten av nya läkemedel, är det nödvändigt att kunna generera spheroids reproducerbart, på ett kontrollerat sätt och i betydande antal. Den AggreWell systemet består av en hög densitet matris av pyramidformade mikrobrunnar, i vilken en suspension av enstaka celler centrifugeras. Antalet celler klustring vid botten av varje brunn, och antalet och förhållandet av distinkta celltyper som deltar beror endast på egenskaperna hos suspensionen som införs genom den som utför experimentet. Således kan vi generera tumör sfäroider av godtycklig storlek och sammansättning medut att behöva ändra den underliggande plattformsteknologi. De hundratals mikrobrunnar per kvadratcentimeter av odlingsytan i sin tur att säkerställa att extremt höga produktionsnivåer kan uppnås via en okomplicerad, nonlabor intensiv process. Vi räknar därför med att detta protokoll kommer att vara i stort sett användbar för forskare i tumören spheroid fältet.

Kan lätt genereras och extraherades i suspensionskultur sfäroiderna från flera tumörlinjer av olika anatomiska ursprung. Figur 3 illustrerar den konsekvent storlek kontroll kan erhållas med denna metod, med mycket likformiga sfäroida populationer under varje tillstånd. Tydliga inter-line skillnader i beteende är också synlig, med HT29 tjocktarmscancerceller och TE6 esofagus cancerceller som bildar tätt packade sfäroider med skarpt definierade gränser, medan LNCaP prostatacancerceller gav upphov till mindre sammanhängande sfäroider med oregelbundna gränser (se diskussion om möjliga orsaker ). De starkare inre krafter i mer sammanhängande aggregat resulterade också i kollaps till en mer symmetrisk formulär även samtidigt i mikrobrunnarna där de bildats, medan LNCaP aggregat, särskilt på den större storleken, synbart behålla torget-pyramidal geometri mikrobrunnarna. Förhållandet mellan in-cell nummer och fys<html> ical storleken på den resulte sfäroid kommer att bero på ett antal variabler. Teoretiska volymer som baseras på produkten av volymen per cell och antalet celler som används kan minskas med cellförlust, vilket i sin tur kan innebära förlust av celler under den encelliga fjädring stadiet, samt förlust av alltför små aggregat på grund av tillräckligt många grannar och från alltför stora aggregat på grund av transport begränsningar och nekros i kärnan. Storlek kommer också att påverkas av eventuella spridning som kan uppstå under aggregering processen. Eftersom dessa parametrar varierar från cellinje till cellinje, om sfäroider av specifika fysikaliska dimensioner önskas det korrekta antalet celler för att införa måste bestämmas experimentellt. Som en första approximation är sfäroid diameter förväntas öka med kubikroten av antalet celler som ingår - t ex en 8-faldig ökning av antalet celler som skall resultera i en fördubbling av sfäroid diameter. <html> _content &quot;fo: keep-together.within-page =&quot; alltid &quot;&gt; <img alt="Figur 1" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50665/50665fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50665/50665fig1.jpg" /> Figur 1. Schematisk bild av sfäroid produktion. Mikrobrunn-systemet består av en array av tätt packade fyrkantiga pyramidmikrobrunnar (625 per cm 2 till 400 <span id="docs-internal-guid-263ae0a0-aa35-f9c7-69a1-8c5aa197db53" style="font-size:15px;font-family:Arial;color:#000000;background-color:#ffffff;font-weight:normal;font-style:normal;font-variant:normal;text-decoration:none;vertical-align:baseline;">μ m storlek), in i vilken celler kan centrifugeras. Cellerna bringas samman genom de lutande sidoväggar, och storleken av den resulterande sfäroid kontrolleras genom att variera densiteten av cellsuspensionen användes. 50665fig2highres.jpg &quot;src =&quot; / files/ftp_upload/50665/50665fig2.jpg &quot;/&gt; Figur 2. Montering av klustrade celler i sfäroider. Sfäroiderna bildades från sjuhundra HT29 celler vardera. Omedelbart efter centrifugeringen (A), celler löst klustrade i botten av varje brunn. Observera att klustren är enhetligt förskjutna mot lägre rätt i det här fallet. Detta är acceptabelt förutsatt klusterstorlekar förblir konsekvent över matrisen. Om betydande kluster storleksskillnader ses från ena sidan av matrisen till den andra, se not i steg 3,5. Efter inkubation under 24 h (B), har intercellulära adhesiva krafter orsakade klustren att aggregera och bilda sammanhängande sfäroider, vilka sedan kan extraheras (C). <img alt="Figur 3" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50665/50665fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50665/50665fig3.jpg" /><b<html> r /&gt; Figur 3. Sfäroider genereras i mikroplattor. Sfäroiderna bildades från sjuhundra (A, C, E) eller ettusenfemhundra (B, D, F) HT29 koloncancerceller (A, B), LNCaP prostatacancerceller (C, D) eller TE6 esophageal cancerceller (E, F). Notera konsistensen av sfäroider inom en beredning, och även variationen mellan cellinjer - särskilt de lösa LNCaP aggregat jämfört med de mer tätt packade HT29 och TE6 celler. Skala stapel representerar 200 nm. <table border="1"><tbody><tr><td></td><td colspan="3"> Microwell-format </td></tr><tr><td></td><td> AggreWell 400 </td><td> AggreWell 40EX </td><td> AggreWell 800 </td></tr><tr><td> Mikrobredd (al;color:#000000;background-color:#ffffff;font-weight:normal;font-style:normal;font-variant:normal;text-decoration:none;vertical-align:baseline;&quot;&gt;µm ) </td><td> 400 </td><td> 400 </td><td> 800 </td></tr><tr><td> Mikrobrunnar per cm 2 </td><td> 625 </td><td> 625 </td><td> 156,25 </td></tr><tr><td> Mikrobrunnar per brunn </td><td> 1200 </td><td> 4700 </td><td> 300 </td></tr><tr><td> Minimi celler per mikro * </td><td> N / A </td><td> N / A </td><td> 2000 </td></tr><tr><td> Maximala celler per mikro * </td><td> 2000 </td><td> 2000 </td><td> 10000 </td></tr><tr><td> Minimi celler per brunn * </td><td> N / A </td><td> N / A </td><td> 6 x 10 5 </td></tr><tr><td> Maximala celler per brunn * </td><td> 2,4 x 10 6 </td><td> 9,4 x 10 6 </td><td> 3 x 10 6 </td></tr><tr><td> 1.1.1 - 70% etanol volym (ml) </td><td> 0,5 </td><td> 2,0 </td><td> 0.5 </td></tr><tr><td> 1.2.1 - Sköljning lösning volym (ml) </td><td> 0,5 </td><td> 2,0 </td><td> 0,5 </td></tr><tr><td> 3.2 - Medium förspänning volym (ml) </td><td> 0,4 </td><td> 1,6 </td><td> 0,4 </td></tr><tr><td> 3,5 - Cell laddningsvolym (ml) </td><td> 0,4 </td><td> 1,6 </td><td> 0,4 </td></tr><tr><td colspan="4"> * Antalet celler per mikrobrunn är endast en approximation eftersom detta värde kommer att variera med storleken på de specifika cellerna som används och bör bestämmas empiriskt </td></tr></tbody></table> Tabell 1. AggreWell alternativ och protokoll modifieringar.

Watch this Scientific Journal Video about Production of Large Numbers of Size-controlled Tumor Spheroids Using Microwell Plates at JoVE.com

Production of Large Numbers of Size-controlled Tumor Spheroids Using Microwell Plates

Vi inför ett protokoll för generering av ett stort antal (tusentals till hundratusentals) av samma storlek-och kompositionsstyrda tumör sfäroider, med hjälp av kommersiellt tillgängliga mikroplattor.

Produktion av ett stort antal Size styrda Tumör spheroids Använda Mikrobrunns Plates

Tumor spheroids are increasingly recognized as an important in vitro model for the behavior of tumor cells in three dimensions. More physiologically ...

Research

JoVE Journal

Bioengineering

A Simple Hanging Drop Cell Culture Protocol for Generation of 3D Spheroids

En enkel droppe cellodling protokoll för generering av 3D spheroids

Studies of cell-cell cohesion and cell-substratum adhesion have historically been performed on monolayer cultures adherent to rigid substrates. Cells ...

Nonhuman Primate Lung Decellularization and Recellularization Using a Specialized Large-organ Bioreactor

There are an insufficient number of lungs available to meet current and future organ transplantation needs. Bioartificial tissue regeneration is an ...

Nutrient Regulation by Continuous Feeding for Large-scale Expansion of Mammalian Cells in Spheroids

Närings förordning genom kontinuerlig matning för storskalig utbyggnad av däggdjursceller i sfäroider

In this demonstration, spheroids formed from the &#946;-TC6 insulinoma cell line were cultured as a model of manufacturing a mammalian islet cell product ...

Robotic Production of Cancer Cell Spheroids with an Aqueous Two-phase System for Drug Testing

Robotic Production of Cancer Cell Sfäroider med en vatten tvåfassystem för drogtestning

Cancer cell spheroids present a relevant in vitro model of avascular tumors for anti-cancer drug testing applications. A detailed protocol for producing ...

Cloning and Large-Scale Production of High-Capacity Adenoviral Vectors Based on the Human Adenovirus Type 5

Kloning och storskalig produktion av hög kapacitet Adenovirusvektorer Baserat på den mänskliga adenovirus typ 5

High-capacity adenoviral vectors (HCAdV) devoid of all viral coding sequences represent one of the most advanced gene delivery vectors due to their high ...

Creation of Cardiac Tissue Exhibiting Mechanical Integration of Spheroids Using 3D Bioprinting

Skapande av hjärtvävnad som visar mekanisk integration av sfäroider med 3D bioprinting

This protocol describes 3D bioprinting of cardiac tissue without the use of biomaterials, using only cells. Cardiomyocytes, endothelial cells and ...

Assembly and Tracking of Microbial Community Development within a Microwell Array Platform

Montering och spårning av mikrobiell gemenskapsutveckling inom en Microwell Array-plattform

The development of microbial communities depends on a combination of complex deterministic and stochastic factors that can dramatically alter the spatial ...

Production of Chemicals by Klebsiella pneumoniae Using Bamboo Hydrolysate as Feedstock

Production of Chemicals by Klebsiella pneumoniae Using Bamboo Hydrolysate as Feedstock

Produktion av kemikalier av<em&gt; Klebsiella pneumoniae</em&gt; Användning av bambuhydrolysat som råvara

Bamboo is an important biomass, and bamboo hydrolysate is used by Klebsiella pneumoniae as a feedstock for chemical production. Here, bamboo powder was ...

Generic Protocol for Optimization of Heterologous Protein Production Using Automated Microbioreactor Technology

Generiskt protokoll för optimering av heterologa proteinproduktion med hjälp av automatiserad Microbioreactor teknik

A core business in industrial biotechnology using microbial production cell factories is the iterative process of strain engineering and optimization of ...

Affordable Oxygen Microscopy-Assisted Biofabrication of Multicellular Spheroids

Prisvärd syremikroskopi-assisterad biofabricering av multicellulära sfäroider

Multicellular spheroids are important tools for studying tissue and cancer physiology in 3D and are frequently used in tissue engineering as tissue ...