Name: production of large numbers of size-controlled tumor spheroids using microwell plates
Uploaded: 2013-11-18T20:00:00
Duration: 10 min 44 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Production of Large Numbers of Size-controlled Tumor Spheroids Using Microwell Plates at JoVE.com

Bu çalışma Dr Ungrin için yeni bir araştırmacı start-up hibe altında, Calgary Üniversitesi tarafından finanse edildi.

NOT: Microwell plakaları istenen sonuçlara bağlı olarak farklı formatlarda mevcuttur. Özellikleri yanı sıra her bir biçimi kullanılmalıdır hücrelerin minimum ve maksimum sayısı için yaklaşık kurallar Tablo 1 &#39;de gösterilmiştir. Daha küçük olan mikro-keskin bir noktaya konik ve küresel cisimler arasında değişkenlik daha küçük boyutlarda daha önemli hale gelir, ancak bu şekilde bir alt boyut sınırı vardır. Az 20, hücrelerin her biri için ortalama küremsi rutin üretimi basit 8&#39;dir. Daha büyük boyutlu mikro tam konik değildir, bu nedenle her bir kuyucuğa birden fazla daha küçük küremsi neden olabilir küçük hücre numaraları parçacıklarının oluşturulması için çalışır. AggreWell 400Ex plakaları kullanılıyorsa yüzey özellikleri nedeniyle bir miktar farklardan ötürü, sürfaktan çözeltisinin (adım 1.2) ile hazırlanması isteğe bağlı değildir. Bu protokol AggreWell 400 plakalarının kullanılması dayanmaktadır - başka biçimleri için aleyhteUlt Tablo 1. Her çukurdaki yüklenecek hücre sayısı her sfero için kümelenmiş hücrelerin sayısına göre içeren mikro oyuk sayısı çarpılarak belirlenir. Örneğin, her biri 1000 hücrelerinden sferoidler elde etmek için, her bir (1,200 kez küremsiler 1.000 hücreler her biri =) 1.2 x 10 6 hücre ile yüklenmiş olması gerekir. Hücre yoğunluğu, hücreler 0.4 ml &#39;lik bir hacim içinde yüklenir verilen hesaplanmalıdır. Bu nedenle, her 1000 hücre oluşan küremsiler, örneğin 0.4 ml 1.2 x 10 6 hücre ml için 3 x 10 6 hücre yoğunluğunda çevirir. 1.. Hücreleri Alma hazırlanıyor Mikrodelikler <ol><li> Mikro plakalar sağlanan steril, ve sadece bu tür bir laminar akışlı biyo-güvenlik kabini olarak steril bir ortamda da ambalaj çıkarılmalıdır. Sterilite protokol boyunca muhafaza edilmelidir. Kısırlık oyuklar kullanılarak su içerisinde% 70 etanol kullanılarak sterilize edilir, tehlikeye olmalıİsteğe bağlı adımları izleyerek. <ol><li> Her kuyu için, kullanılmayan% 70 etanol, 0.5 ml ilave edilir. Bazı mikro-yakalanacak hava kabarcıkları, bu bir yandan bir sıvı ekleyerek ve daha çok yüzey üzerine dikey olarak bırakarak daha yüzeye yayılmış izin azaltılabilir, ancak. Kapağı değiştirin. </li><li> Etanol buharı hızlı bir şekilde herhangi kabarcıklarını nüfuz gerekir iken çok sayıda varsa, bunları kaldırmak için istenebilir. 2,000 x g, 2 dakika boyunca santrifüj. Bu rotor doğru bu hızda dengeli olmasını sağlamak için önemli olduğuna dikkat edin. </li><li> Düşük büyütme ters bir mikroskop kullanılarak, doğrulamak kabarcıklar mikro oyuk kaldırıldı. </li><li> Oda sıcaklığında on kapak ile 5 dakika boyunca inkübe edin. </li><li> Aspire etanol. Plaka hemen hemen kullanım için steril su ya da PBS ile yıkanmış ya da depolama için hava ile kurutulabilir. </li></ol></li><li> Hücreler mikro yüzeyi ile etkileşmeyen sağlamak amacıyla, bir yüzey aktif madde kullanılarak hazırlanabilir. Genel olarak, birsonra başlangıçta bu adımı gerçekleştirmek için tavsiye ve ve yüzey-kaplanmış mikro olmaksızın üretilen sferoitleri karşılaştırın. <ol><li> Her bir oyuğa Çalkalama solüsyonu, 0.5 ml ilave edilir. Bazı mikro-yakalanacak hava kabarcıkları, bu bir yandan bir sıvı ekleyerek ve daha çok yüzey üzerine dikey olarak bırakarak daha yüzeye yayılmış izin azaltılabilir, ancak. Kapağı değiştirin. </li><li> Kabarcıklarını çıkarmak için 2000 x g&#39;de 2 dakika boyunca santrifüjleyin. Bu rotor doğru bu hızda dengeli olmasını sağlamak için önemli olduğuna dikkat edin. </li><li> Düşük büyütme ters bir mikroskop kullanılarak, doğrulamak kabarcıklar mikro oyuk kaldırıldı. </li><li> Oda sıcaklığında kapağın üzerinde en azından otuz dakika süreyle inkübe edilir, ya da gece boyunca 4 ° C&#39;de Uygun bir şekilde kurumasını engellemek üzere sızdırmaz eğer gerekli olana kadar plakalar kuyularda yüzey aktif madde çözeltisi ile dört derecede muhafaza edilebilir. </li><li> , Steril su ya da kullanmak için hemen önce PBS ile plakayı yıkayın. Plakalar izin vermeyinkaplamadan sonra kurumaya. </li></ol></li></ol> 2. Hücreleri hazırlanıyor NOT: Hücre hazırlanması ile ilgili bilgiler belirli bir hücre tipi çalışılmaktadır ile biraz değişecektir. Ancak, burada tartışılan hatları, hem insan ve fare embriyonik kök hücreleri (ESC), insan uyarılmış pluripotent kök hücreler (iPSC), fibroblastlar, varsayılan ilk endoderm da dahil olmak üzere hücreleri, geniş bir yelpazesi ile birlikte etkili olması için, bu koşullar gözlemledik ve stromal hücreler. Diğer gruplar mezenkimal kök hücrelerin 9 kondrogenezisi dahil olmak üzere geniş bir uygulama yelpazesi için başarıyla bu sistemi istihdam var, pluripotent kök hücreleri 10 nöral öncülerinin standardize nesil, toksikolojik hepatositler 11 ve semenderler 12 omurilik yenilenme değerlendirme analizleri. HT29 hücreleri ile çalışmak için özel protokol burada gösterilir. <ol><li> DMEM HT29 hücrelerinin bir T75 şişesi, başla+% 10 FBS </li><li> Aspire büyüme ortamı şişeden, tripsin ve 3 ml ekleyin. </li><li> 37 ° C sıcaklıkta 5 dakika boyunca inkübe hücreleri </li><li> Büyüme ortamının 3 ml eklenerek tripsin sindirim durdurun. Hücre sayımı için bir numuneyi çıkarın ve bir 15 ml santrifüj tüpüne kalan aktarın. </li><li> 200 x g, 5 dakika boyunca santrifüj. </li><li> Santrifüj devam ederken, hücreleri saymak. </li><li> Aspire tripsin / orta karışımı, yukarıda hesaplanan istenen hücre yoğunluğuna göre belirlenir taze büyüme ortamı hacmi ile değiştirin. </li><li> (İSTEĞE BAĞLI) herhangi bir yığınının ortadan kaldırmak için bir süzgeç vasıtasıyla hücre süspansiyonu geçirin. NOT: Hücre toplama koşulları çizgiler arasındaki biraz değişecektir. , Örneğin, ilgi konusu hücreleri pasaj yapmak için uygun bir ayrışma protokol kullanılabilir, bu bir başlangıç ​​noktası olarak kullanılmalıdır. Tripsin hassas hücre çizgileri kullanımı ile aşırı hücre ölümüne neden olabilir. Bu durumlarda biz alternatif bir dissociati olarak TrypLE kullanarak iyi sonuçlar gözlemledikreaktifi 8. Hücreler ayrışma sırasında topaklaşan olmak ve canlılığı kaybederseniz, enzim çözeltisine DNAaz eklenmesi bu sorunu çözmek olabilir. Ayrışma sürelerini azaltarak ve hücre kümeleri kırmak için bir trituration adımı kullanarak da canlılığı artırabilir. </li></ol> 3. Sfero Oluşumu Not: sferoitler hususiyetlerini ancak ilk denemeler hücreler ortam bileşiminin değiştirilmesi sonuçları bir 3-boyutlu bir kültür sistemine geçiş sonuçlarını ayırt etmek için, kültüre edildiği bir ortam kullanılarak gerçekleştirilebilir olmalıdır, orta formülasyonlar çeşitli oluşturulabilir. <ol><li> Her bir oyuğa büyüme ortamı, 0.4 ml ilave edilir. </li><li> Kabarcıklarını çıkarmak için 2000 x g&#39;de 2 dakika boyunca santrifüjleyin. Bu rotor önce uygun bir santrifüj için bu hızda dengeli olmasını sağlamak için önemli olduğuna dikkat edin. </li><li> Düşük büyütme ters bir mikroskop kullanılarak, doğrulamak kabarcıklar mikro oyuk kaldırıldı. </li><li> 0.4 ml ekleyin(yukarıda hesaplanan) istenilen yoğunlukta hücre süspansiyonu. Yavaşça mikro oyuk içine hava kabarcıkları tanıtan olmadan, aşağı yukarı pipetleme karıştırın. Bu hücreler, düz bir şekilde tutarlı sferoidler elde etmek amacıyla, kuyunun boyunca dağılmasını sağlamak için önemlidir. </li><li> 200 x g, 5 dakika boyunca santrifüj. Plaka santrifüj sırasında kendini düzeyde değilse, konveksiyon akımları mikro oyuk genelinde hücrelerin düzensiz dağılımı bu sonucu ortaya çıkabilir. Ağırlık plaka taşıyıcının her iki tarafında eşit olarak dağıtılmış olduğu nedenle, levha, diğer levha karşı hem de dahili dengeli olmalıdır. </li></ol> NOT: düzensiz hücre dağılımı kanıt görülür ise, levha taşıyıcı üzerinde pivot noktaları için yağlama az miktarda uygulamak gerekli olabilir - yönergeler için santrifüj üreticisine başvurun. Not: hücreler, mikro oyuk içine santrifüj edildikten sonra, bunlar oldukça dirençli olanplakanın küçük hareketlerinden yıkama dışarı tant. Orta sloshing neden ani hareketler kaçınılmalıdır, ancak mikroskop santrifüj plaka veya kuvöz transferi önemli hücre değiştirmesine neden olmamalıdır. <ol start="6"><li> Bir ters mikroskop kullanılarak, hücreler, mikro oyuk içinde toplanmıştır ve dengeli bir şekilde dağılmış kuyu olduğunu doğrulamak. </li><li> 37 ° C de bir gece inkübe </li><li> Bir ters mikroskop kullanılarak, küremsi oluşum sürecini gözlemlemek. Bazı hücre hatları diğerleri daha uzun sürebilir, 24 saat içinde kompakt sferoitleri oluşturacaktır. HT29 hücreleri toplamak için kümeden ilerleme, Şekil 2 &#39;de gösterilmiştir. </li><li> Mikro oyuk gelen küremsilerin kurtarmak ve yavaşça bir pipetle onları jeti tarafından süspansiyon kültürü aktarmak. Seçenek olarak ise, ortam değiştirme 8 ile yerinde muhafaza sferoidler - süresi başlangıç ​​boyutu ve büyüme oranına bağlıdır, burada defOnlar meydana edildiği Mikrodelikler büyümek kadar zaman ine. <ol><li> Pasteur pipet kullanarak iyi kenarında sferoidler, aspirat orta kaybetmeden orta değiştirmek için. Yavaş yavaş menisküs sıvıyı çekmek için başlayana kadar aşağıya ucu getirmek, ve düşer gibi menisküs aşağı izleyin. Daha sonra aynı yerde iyi duvara taze ortam ilave edin. Birkaç küreler, ortam aspire edilmiş ve her zaman aynı pozisyonda değiştirilir, ancak, bu sayı tüpün içindeki çok sayıda karşılaştırıldığında küçük kalır, kaybolabilir. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Hirschhaeuser, F., Menne, H., Dittfeld, C., West, J., Mueller-Klieser, W., Kunz-Schughart, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multicellular+tumor+spheroids:+An+underestimated+tool+is+catching+up+again.">Multicellular tumor spheroids: An underestimated tool is catching up again.</a> Journal of Biotechnology. 148 (1), 3-15 (2010).</li><li>Sherar, M. D., Noss, M. B., Foster, F. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrasound+backscatter+microscopy+images+the+internal+structure+of+living+tumour+spheroids.">Ultrasound backscatter microscopy images the internal structure of living tumour spheroids.</a> Nature. 330 (6147), 493-495 (1987).</li><li>Foty, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Simple+Hanging+Drop+Cell+Culture+Protocol+for+Generation+of+3D+Spheroids.">A Simple Hanging Drop Cell Culture Protocol for Generation of 3D Spheroids.</a> J. Vis. Exp. (51), 2720 (2011).</li><li>Naber, H. P. H., Wiercinska, E., Ten Dijke, P., Van Laar, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spheroid+Assay+to+Measure+TGF-&#946;-induced+Invasion.">Spheroid Assay to Measure TGF-&#946;-induced Invasion.</a> J. Vis. Exp. (57), e3337 (2011).</li><li>Ungrin, M. D., Joshi, C., Nica, A., Bauwens, C., Reproducible Zandstra, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ultra+high-throughput+formation+of+multicellular+organization+from+single+cell+suspension-derived+human+embryonic+stem+cell+aggregates.">ultra high-throughput formation of multicellular organization from single cell suspension-derived human embryonic stem cell aggregates.</a> PLoS ONE. 3 (2), e1565 (2008).</li><li>Bauwens, C. L., Song, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Geometric+control+of+cardiomyogenic+induction+in+human+pluripotent+stem+cells.">Geometric control of cardiomyogenic induction in human pluripotent stem cells.</a> Tissue Engineering. Part A. 17 (15-16), 1901-1909 (2011).</li><li>Bratt-Leal, A. M., Carpenedo, R. L., Ungrin, M. D., Zandstra, P. W., McDevitt, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Incorporation+of+biomaterials+in+multicellular+aggregates+modulates+pluripotent+stem+cell+differentiation.">Incorporation of biomaterials in multicellular aggregates modulates pluripotent stem cell differentiation.</a> Biomaterials. 32 (1), 48-56 (2011).</li><li>Ungrin, M. D., Clarke, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rational+bioprocess+design+for+human+pluripotent+stem+cell+expansion+and+endoderm+differentiation+based+on+cellular+dynamics.">Rational bioprocess design for human pluripotent stem cell expansion and endoderm differentiation based on cellular dynamics.</a> Biotechnology and Bioengineering. 109 (4), 853-866 (2012).</li><li>Markway, B. D., Tan, G. K., Brooke, G., Hudson, J. E., Cooper-White, J. J., Doran, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+chondrogenic+differentiation+of+human+bone+marrow-derived+mesenchymal+stem+cells+in+low+oxygen+environment+micropellet+cultures.">Enhanced chondrogenic differentiation of human bone marrow-derived mesenchymal stem cells in low oxygen environment micropellet cultures.</a> Cell Transplantation. 19 (1), 29-42 (2010).</li><li>Kozhich, O., Hamilton, R., Mallon, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Standardized+Generation+and+Differentiation+of+Neural+Precursor+Cells+from+Human+Pluripotent+Stem+Cells.">Standardized Generation and Differentiation of Neural Precursor Cells from Human Pluripotent Stem Cells.</a> Stem Cell Reviews and Reports. , 1-6 (2012).</li><li>Fey, S. J., Wrzesinski, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+of+Drug+Toxicity+Using+3D+Spheroids+Constructed+from+an+Immortal+Human+Hepatocyte+Cell+Line.">Determination of Drug Toxicity Using 3D Spheroids Constructed from an Immortal Human Hepatocyte Cell Line.</a> Toxicological Sciences. , (2012).</li><li>Mchedlishvili, L., Mazurov, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconstitution+of+the+central+and+peripheral+nervous+system+during+salamander+tail+regeneration.">Reconstitution of the central and peripheral nervous system during salamander tail regeneration.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. , (2012).</li><li>Butler, C. M., Foty, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+Aggregate+Cohesion+by+Tissue+Surface+Tensiometry.">Measurement of Aggregate Cohesion by Tissue Surface Tensiometry.</a> J. Vis. Exp. (50), e2739 (2011).</li><li>Xu, K., Buchsbaum, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+Mammary+Epithelial+Cells+from+Three-dimensional+Mixed-cell+Spheroid+Co-culture.">Isolation of Mammary Epithelial Cells from Three-dimensional Mixed-cell Spheroid Co-culture.</a> J. Vis. Exp. (62), e3760 (2012).</li><li>Baraniak, P. R., Cooke, M. T., Saeed, R., Kinney, M. A., Fridley, K. M., McDevitt, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stiffening+of+human+mesenchymal+stem+cell+spheroid+microenvironments+induced+by+incorporation+of+gelatin+microparticles.">Stiffening of human mesenchymal stem cell spheroid microenvironments induced by incorporation of gelatin microparticles.</a> Journal of the Mechanical Behavior of Biomedical Materials. 11, 63-71 (2012).</li><li>Purpura, K. A., Bratt-Leal, A. M., Hammersmith, K. A., McDevitt, T. C., Zandstra, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systematic+engineering+of+3D+pluripotent+stem+cell+niches+to+guide+blood+development.">Systematic engineering of 3D pluripotent stem cell niches to guide blood development.</a> Biomaterials. , (2012).</li></ol>

Dr Ungrin bir mucit olarak AggreWell teknolojisinde bir mali çıkarı var.

Bu düzgün küremsi çok sayıda farklı kaynaklardan birden fazla hücre çizgilerinden elde edilebilir, böylece bir sistem kurduk. Biz, bu koşullar altında küremsilerin birlikte bir yapışkan hücre hattı karşılaşmaya henüz. Biz daha önce ancak bugüne kadar bu sorunu tümör hatları ile ortaya çıkmadı, anoikis 5,8 eğilimli popülasyonunda hücre kaybını gözlemledik. Sistem, 24-kuyu ve 6-çukurlu formatta, hem de şu anda geliştirilmekte olan mikro-50000 içeren her prototip biyoreaktörlerde mikro oyuk tutarlı davranışı ile, bir yüzey alanına sahip isteğe bağlı olarak ölçeklenebilir. Asimetri bir endişe olabilir Sferoid olmalıdır, adım 4.8 &#39;de inkübasyon süresi iki ya da üç gün artabilir. Sferoitler hususiyetlerini aynı zamanda, ancak bu durumda başka bir bakım wi temas küremsi gibi, yeterince düşük bir kültür yoğunlukları tutmak için alınması gereken, simetri artırmak için mikro oyuk ekstre sonra bir süre için inkübe edilebilirll genellikle daha büyük yapılar halinde sigorta. Bu nedenle, daha önce bu topaklar birincil sınırlamanın, sfero büyüklüğü olmak üzere, meydana edildiği mikro oyuk içinde kültürleri korumuştur. Bu da büyüme hızı ve başlangıç ​​boyutu 8 hem de bir işlevi olduğunu ve mikro levha içinde uzatılmış kültür planlanan, bu önceden dikkate alınmalıdır. Büyümeyi engellemek için seçenekler, bu meydana gelirse, daha küçük bir küremsi başlayarak veya AggreWell 800 levhanın daha büyük mikro-kullanılarak ya da bulunmaktadır. Spheroids zamanla tutarlılık artmaya başarısız olursa, bir potansiyel nedeni hücre ölümü olabilir. Özellikle yüksek metabolik olarak aktif hücrelerin daha büyük kümeler halinde, oksijen ve temel besin teslim toplu taşıma sınırlamalar bir nekrotik iç kısım 2 neden olabilir - böyle bir yapışkan olmayan küremsi sadece aşırı hücre ölümü bir sonucu olabilir. Alternatif olarak, mekanik YÖK ölçümlerisferoitlerin sion, belirli bir hücre hattı 13&#39;ün metastaz potansiyeli ile ilişkisi, hücreler arası bağlayıcı güçleri değerlendirmek için kullanılmıştır. Bu belki de bu tür alan oranına yuvarlaklık ve çevre gibi morfometrik parametreleri kullanarak, sfero şekil ve metastatik potansiyeli arasındaki ilişkiyi araştırmak ilginç olurdu. Küremsiler mekanik ve morfometrik özelliklerini incelemek, ek olarak, mikro sisteminde montaj birden fazla hücre tipleri ve / veya biyomalzeme 6,7 kombinasyonlarından oluşan, karma bileşim küremsi büyük ölçekli üretimine izin verir. Diğer hücre tipleri ile tümör hücrelerinin etkileşimleri bu nedenle, örneğin, fibroblastlar ve endotel hücreleri ile kombinasyon halinde tümör hücrelerinden sferoidler elde etmek için ilgi çekici olabilir, daha yakından 14 in vivo tümörlerin davranış modeli için önemlidir. Çeşitli biyomalzeme Mikropartiküller da dahil edilebilir ve SPH etkileyebilirdoğrudan hücre 7,15 ve ayrıca küremsi 16 içine büyüme faktörleri ve sitokinlerin kontrollü serbest bırakılması için rezervuar olarak ile etkileşimler yoluyla hem eroid özellikleri. Kısırlık konusunda herhangi bir ilgi vardır Bir önceki deneyin bir parçası olarak, bir kuluçka makinesi içinde bir zaman harcanan bazı oyuklar daha önce kullanılmış olan bir mikro levha ile çalışırken, örneğin oyuklar,% 70 etanol ile sterilize edilebilir su. Küreler, bir kez oluştuktan sonra, aynı zamanda bir hücre süzgecinden fazla süspansiyon geçirilmesiyle kalıntı adi hücrelerden ayrılabilir. Sferoidler muhafaza olacak ise tek tek hücreler, geçecek. Küremsi kültür boyunca, potansiyel olarak metastatik hücrelerin dökülme şüphesi varsa, bu işlem birkaç defa gerçekleştirmek istenebilecektir - ilk adi hücreleri çıkarmak için, ve daha sonra saflaştırıldı ve izole etmek içinHücrelerin d popülasyonları sferoitler tarafından verilen.

Tümör hücreleri daha fizyolojik ilgili sistem 1 için geçiş yaparken, geleneksel doku kültürü platformlarda belirlenen terapötik ajanlar etkinliğini kaybedebilir onlar zaman plastik kültüre yapmak daha üç boyutlu kültürlerde farklı davranırlar, delil artan bir vücudu var. Hem kendi temel biyoloji içgörü kazanmak için, bu şartlar altında kanser hücrelerinin davranışlarını incelemek için, ve aynı zamanda kliniğe tarama tesis yeni terapötik ajanlar geçme başarı oranını artırmak için istenmektedir. Uzun bir geçmişi olan biri, faydalı model sistemi tümörü küremsilerden 1,2 olarak bilinen kanser hücrelerinin üç boyutlu kümeler kullanır. İdeal olarak, küremsi oluşturulması için teknikler boyut ve bileşim deneyi tarafından kontrol edilir düzgün küremsi sayıda üretimini izin verebilir. Asılı bırak ve iyi plaka yaklaşır 3,4 bu yeniden bazı yerine getirmek mümküngerekliliklerine göre, verim genellikle sınırlıdır ve parçacıklarının çok sayıda nesil bir emek-yoğun bir görev haline gelir. Biz son zamanlarda rejeneratif tıp alanında 5 benzer zorlukları çözmek için bir sistem geliştirdik. (Bkz. Şekil 1) yoğun bir şekilde mikron çaplı bir dizi kuyucuk içinde zorunlu toplanmasını istihdam, bu yaklaşım, çok sayıda hücre türleri 6 karışımları yanı sıra çeşitli biyomalzeme 7&#39;nin dahil edilmesi de dahil olmak üzere hücre rasgele sayı, ikinci küremsiler üretilmesini sağlar. Bin ya da daha fazla yüz binlerce - - Küresel şekiller, çok sayıda teşkil edilir ve hemen özü ya da iki (yayınlanmamış gözlem) haftaya kadar en az bir 8 için ortam değişikliği ile oluşturulan edildiği mikro oyuk olarak muhafaza edilebilir. Bu sistem, bu nedenle de effe değerlendirilmesi için çok sayıda üniform ve tekrar tümör küremsiler üretimi için uygunduryeni anti-tümör maddeleri ya da temel biyolojik araştırmaların ctiveness.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Name of Reagent/Material</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AggreWell 400 plate</td>
			<td>StemCell Technologies Inc.</td>
			<td>27845/27945</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rinsing Solution</td>
			<td>StemCell Technologies Inc.</td>
			<td>07010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell strainer (37 <span id="docs-internal-guid-263ae0a0-aa3d-bddd-2a36-2ae1901f1604" style="font-size:15px;font-family:Arial;color:#000000;background-color:#ffffff;font-weight:normal;font-style:normal;font-variant:normal;text-decoration:none;vertical-align:baseline;">&#181;m)</td>
			<td>StemCell Technologies Inc.</td>
			<td>27215</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>VWR / LONZA</td>
			<td>CA12001-676</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-Versene (EDTA)</td>
			<td>VWR / LONZA</td>
			<td>CA12001-660</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>VWR / LONZA</td>
			<td>CA12002-212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>VWR / LONZA</td>
			<td>CA-95042-112</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrypLE</td>
			<td>Invitrogen / Life Technologies</td>
			<td>12605010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted microscope</td>
			<td>VWR / Motic</td>
			<td>CA19000-610</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Allegra X15R centrifuge with carriers for standard well plates</td>
			<td>VWR / Beckman</td>
			<td>CABKA99465, CABK369704, CABK392806</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminar flow biosafety cabinet</td>
			<td>ESBE / Baker</td>
			<td>BKR-SG603AHEUVSP</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

production of large numbers of size-controlled tumor spheroids using microwell plates

Tümör sferoidler giderek üç boyutlu olarak tümör hücrelerinin davranışı için önemli bir in vitro modeli olarak kabul edilmektedir. Daha fizyolojik ilgili geleneksel yapışık sayfalık kültürlere göre, onlar daha doğru karmaşıklığını ve gerçek tümörlerde mevcut etkileşimleri özetlemek. Daha iyi tümör biyolojisi, ya da yeni terapötik maddelerin etkinliğini değerlendirmek için, bu model koşum amacıyla, kontrollü bir şekilde ve önemli sayıda, yeniden üretilebilir sferoidler elde edebilmek için gereklidir. AggreWell sistem tek bir hücre süspansiyonu santrifüj edilir içine piramit şeklinde bir mikro oyuk, yüksek yoğunluklu bir dizi oluşur. Hücrelerin sayısı, her kuyucuğa altındaki kümeleme, ve söz konusu farklı hücre tiplerinin sayısı ve oranı deneyi tarafından ortaya süspansiyonun özellikleri üzerinde sadece bağlıdır. Böylece, biz keyfi boyut ve kompozisyon tümör küremsiler üretebilirtemel platform teknolojisini değiştirmek gerek dışarı. Bu da kültür yüzey alanının santimetre karesi başına mikro oyuk yüzlerce son derece yüksek üretim seviyeleri, basit, nonlabor-yoğun bir işlem yoluyla elde edilebilir emin olun. Bu nedenle bu protokol tümör sfero alanındaki araştırmacılara geniş yararlı olacağını bekliyoruz.

Farklılaşan anatomik kökeni bir çok tümör hatları küremsi kolaylıkla üretilir ve süspansiyon kültürü içine ekstrakte edilebilir. 3, her koşul altında son derece düzgün bir küremsi nüfusa bu yöntem ile elde edilebilen tutarlı boyut kontrolü, Şekil göstermektedir. LNCaP prostat kanseri hücrelerinin düzensiz sınırları daha az tutarlı Sferoitlere doğurdu ise davranışlarında net arası hat farklar (mümkünse nedenlerle Tartışma bakın, keskin tanımlı sınırları ile yoğun dolu sferoitleri oluşturan HT29 kolon kanseri hücreleri ve TE6 özofagus kanseri hücreleri ile de görülebilir .) Daha tutarlı bir agrega, en güçlü iç kuvvetleri de bile yine de meydana edildiği mikro oyuk olarak daha simetrik bir biçimde, özellikle de daha büyük boyutta LNCaP agregalar, gözle görülür bir kare piramit geometrisi korumak için ise çökmesine neden Mikrodelikler. Giriş hücresi sayıları ve fizik arasındaki ilişki<html> Elde edilen sferoit olması ile nik boyutlu bir dizi değişkene bağlıdır. Hücre başına hacim ve kullanılan hücre sayısının ürün bazında teorik miktarlar da nedeniyle tek hücre süspansiyonu aşamasında hücre kaybına, hem de aşırı derecede küçük agrega kaybı, hücre kaybı azaltılabilir yetersiz komşularının numaraları ve çekirdek sınırlamalar ve nekroz taşımasından dolayı aşırı büyük agrega. Ebat da toplama işlemi sırasında oluşabilecek herhangi bir proliferasyonu ile etkilenecektir. Bu parametreler hücre hattından hücre hattına değişir gibi, özel fiziksel boyutlara küreler, arzu edilir ise tanıtmak hücre doğru sayıda deneysel olarak tespit edilmelidir. Hücre sayısında bir 8-kat artış küremsi çapı olan bir iki katına ile sonuçlanmalıdır - örneğin, birinci yaklaşım olarak, küremsi çapı dahil hücre sayısının küp kökü ile artması beklenmektedir. <html> &quot;fo: keep-together.within-page =&quot; _content hep &quot;&gt; <img alt="Şekil 1" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50665/50665fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50665/50665fig1.jpg" /> Şekil 1. Küremsi üretiminin şematik. Mikro sistemi hücreleri santrifüj edilebilir içine sıkı bir şekilde dolu kare piramit mikro oyuk bir dizi (400 <span id="docs-internal-guid-263ae0a0-aa35-f9c7-69a1-8c5aa197db53" style="font-size:15px;font-family:Arial;color:#000000;background-color:#ffffff;font-weight:normal;font-style:normal;font-variant:normal;text-decoration:none;vertical-align:baseline;">μ m boyutu için cm2 başına 625) oluşur. Hücreler, eğimli yan duvarlar ile bir araya getirilir ve elde edilen sferoit olması ile boyutu, kullanılan hücre süspansiyonu yoğunluğunu değiştirerek kontrol edilir. 50665fig2highres.jpg &quot;src =&quot; / files/ftp_upload/50665/50665fig2.jpg &quot;/&gt; Şekil 2. Sferoitler halinde kümelenmiş hücre montajı. Sferoidler yedi yüz HT29 hücrelerinin her birinden meydana gelmiştir. Hemen sonra santrifüj (A), her bir kuyucuğa gevşek hücreler dibinde toplanır. Kümeler muntazam bu durumda alt sağa doğru ofset unutmayın. Bu küme boyutları dizi boyunca tutarlı kalmasını sağladı kabul edilebilir. Önemli küme boyutu farklılıklar diğer dizinin bir tarafında görülür, adım 3.5 Not bakınız. 24 saat (B) için kuluçkalamadan sonra, hücreler arası yapışma güçleri kümeleri daha sonra ekstre edilebilir tutarlı sferoidler, (C) bir araya getirir ve oluşturmak için yol açmıştır. <img alt="Şekil 3," fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50665/50665fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50665/50665fig3.jpg" /><b<html> r /&gt; Şekil 3,. Mikro plakalarda oluşturulan küremsi. Küremsi oluşmuş yedi yüz (A, C, E) ya da bin beş yüz (B, D, F) HT29 kolon kanseri hücreleri (A, B), LNCaP prostat kanseri hücrelerinin (C, D) veya TE6 yemek borusu kanseri hücreleri (E, F). Daha yoğun şekilde paketlenmiş HT29 ve TE6 hücreler ile karşılaştırıldığında, özellikle de gevşek bir agrega LNCaP - a preparatı içinde küremsiler tutarlılığını ve aynı zamanda hücre hatları arasında değişimini dikkat edin. Ölçek çubuğu 200 mikron temsil eder. <table border="1"><tbody><tr><td></td><td colspan="3"> Mikrowell biçimi </td></tr><tr><td></td><td> AggreWell 400 </td><td> AggreWell 40EX </td><td> AggreWell 800 </td></tr><tr><td> Mikrowell genişliği (al;color:#000000;background-color:#ffffff;font-weight:normal;font-style:normal;font-variant:normal;text-decoration:none;vertical-align:baseline;&quot;&gt;µm ) </td><td> 400 </td><td> 400 </td><td> 800 </td></tr><tr><td> Cm2 başına Mikrodelikler </td><td> 625 </td><td> 625 </td><td> 156.25 </td></tr><tr><td> Oyuk başına mikro- </td><td> 1.200 </td><td> 4.700 </td><td> 300 </td></tr><tr><td> Kuyucuktan başına en az hücreleri * </td><td> N / A </td><td> N / A </td><td> 2000 </td></tr><tr><td> Kuyucuktan başına maksimum hücre * </td><td> 2.000 </td><td> 2.000 </td><td> 10.000 </td></tr><tr><td> Oyuk başına en az hücre * </td><td> N / A </td><td> N / A </td><td> 6 x 10 5 </td></tr><tr><td> Oyuk başına maksimum hücre * </td><td> 2.4 x 10 6 </td><td> 9.4 x 10 6 </td><td> 3 x 10 6 </td></tr><tr><td> 1.1.1 -% 70 etanol hacmi (mi) </td><td> 0.5 </td><td> 2.0 </td><td> 0.5 </td></tr><tr><td> 1.2.1 - Durulama çözelti hacmi (ml) </td><td> 0.5 </td><td> 2.0 </td><td> 0.5 </td></tr><tr><td> 3.2 - Orta preload hacmi (ml) </td><td> 0.4 </td><td> 1.6 </td><td> 0.4 </td></tr><tr><td> 3,5 - Cep yükleme hacmi (ml) </td><td> 0.4 </td><td> 1.6 </td><td> 0.4 </td></tr><tr><td colspan="4"> Bu değer, kullanılan spesifik hücrelerin boyutu ile değişecektir ve ampirik olarak belirlenmelidir * olarak kuyucuğa ortalama hücre sayıları sadece bir tahmindir </td></tr></tbody></table> Tablo 1. AggreWell seçenekleri ve protokol modifikasyonlar.

Watch this Scientific Journal Video about Production of Large Numbers of Size-controlled Tumor Spheroids Using Microwell Plates at JoVE.com

Production of Large Numbers of Size-controlled Tumor Spheroids Using Microwell Plates

Bu ticari olarak temin edilebilen mikro plakalar kullanılarak, üniform bir boyut ve bileşimin kontrollü tümör küremsi (bin yüz binlerce) büyük sayılar üretmek için bir protokol getirmektedir.

Microwell Tabaklar kullanma büyüklüğü kontrollü Tümör küremsi Büyük Sayılar üretimi

Tumor spheroids are increasingly recognized as an important in vitro model for the behavior of tumor cells in three dimensions. More physiologically ...

Research

JoVE Journal

Bioengineering

A Simple Hanging Drop Cell Culture Protocol for Generation of 3D Spheroids

3D parçacıklarının Üretimi için Basit Asma Bırak Hücre Kültürü Protokolü

Studies of cell-cell cohesion and cell-substratum adhesion have historically been performed on monolayer cultures adherent to rigid substrates. Cells ...

Nonhuman Primate Lung Decellularization and Recellularization Using a Specialized Large-organ Bioreactor

There are an insufficient number of lungs available to meet current and future organ transplantation needs. Bioartificial tissue regeneration is an ...

Nutrient Regulation by Continuous Feeding for Large-scale Expansion of Mammalian Cells in Spheroids

Küresellerde Memeli Hücrelerinin Büyük ölçekli Genişleme için sürekli Beslenme ile Besin Yönetmeliği

In this demonstration, spheroids formed from the &#946;-TC6 insulinoma cell line were cultured as a model of manufacturing a mammalian islet cell product ...

Robotic Production of Cancer Cell Spheroids with an Aqueous Two-phase System for Drug Testing

İlaç test için bir sulu iki-fazlı bir sistem ile Cancer Celi sferoitlerin Robotik üretimi

Cancer cell spheroids present a relevant in vitro model of avascular tumors for anti-cancer drug testing applications. A detailed protocol for producing ...

Cloning and Large-Scale Production of High-Capacity Adenoviral Vectors Based on the Human Adenovirus Type 5

İnsan Adenovirüs Tip 5 dayanarak Yüksek Kapasiteli Adenoviral Vektörler klonlanması ve Büyük Ölçekli Üretim

High-capacity adenoviral vectors (HCAdV) devoid of all viral coding sequences represent one of the most advanced gene delivery vectors due to their high ...

Creation of Cardiac Tissue Exhibiting Mechanical Integration of Spheroids Using 3D Bioprinting

3D Bioprinting&#39;i Kullanan Sferoidlerin Mekanik Entegrasyonu Sergileyen Kalp Doku Oluşturma

This protocol describes 3D bioprinting of cardiac tissue without the use of biomaterials, using only cells. Cardiomyocytes, endothelial cells and ...

Assembly and Tracking of Microbial Community Development within a Microwell Array Platform

Bir Mikro Kuyruklu Dizi Platformunda Mikrobik Topluluk Geliştirmenin Montajı ve Takibi

The development of microbial communities depends on a combination of complex deterministic and stochastic factors that can dramatically alter the spatial ...

Production of Chemicals by Klebsiella pneumoniae Using Bamboo Hydrolysate as Feedstock

Production of Chemicals by Klebsiella pneumoniae Using Bamboo Hydrolysate as Feedstock

Kimyasalların Üretimi<emKlebsiella pneumoniae</em&gt; Bambu Hidrolizatını Hammadde Olarak Kullanma

Bamboo is an important biomass, and bamboo hydrolysate is used by Klebsiella pneumoniae as a feedstock for chemical production. Here, bamboo powder was ...

Generic Protocol for Optimization of Heterologous Protein Production Using Automated Microbioreactor Technology

Otomatik Microbioreactor teknolojisini kullanarak Contegra Protein üretim duruma getirilmesi için genel iletişim kuralı

A core business in industrial biotechnology using microbial production cell factories is the iterative process of strain engineering and optimization of ...

Affordable Oxygen Microscopy-Assisted Biofabrication of Multicellular Spheroids

Çok Hücreli Sferoidlerin Uygun Fiyatlı Oksijen Mikroskobu Destekli Biyofabrikasyonu

Multicellular spheroids are important tools for studying tissue and cancer physiology in 3D and are frequently used in tissue engineering as tissue ...