Name: a microplate assay to assess chemical effects on rbl-2h3 mast cell degranulation: effects of triclosan without use of an organic solvent
Uploaded: 2013-11-01T19:45:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Microplate Assay to Assess Chemical Effects on RBL-2H3 Mast Cell Degranulation: Effects of Triclosan without Use of an Organic Solvent at JoVE.com

معتمدة LMW وRHK من قبل مدرسة UMaine الدراسات العليا للعلوم والهندسة (GSBSE) الطبية الحيوية؛ كان مدعوما أيضا من قبل RHK مين الزراعية وتجربة محطة غابة. وقدمت تمويلا إضافيا من قبل المعهد الوطني للعلوم الطبية العامة (NIH P20-GM103423)، ومين الزراعية وتجربة محطة غابة (جرانت عدد ME08004-10، الفريق الاستشاري المشترك)، وجامعة ولاية ماين ADVANCE ارتفاع المد مركز (NSF المنح # 1008498) ، وبحوث كاتب المنحة الصيدلة / علم السموم من مؤسسة فارما (JAG). نشكر الدكاترة. ديفيد Holowka وباربرا بيرد للمستضد والخلايا. ونحن ممتنون لهينا الهاشمي، اليخاندرو فيليز، وأندرو Abovian للمساعدة بالمعدات وأوامر. هذا هو مين الزراعية والغابات تجربة محطة المنشور رقم 3311.

لاحظ أن جميع صفات العازلة مدرجة في جدول في نهاية النص البروتوكول. DAY 1: 1. إعداد الخلايا <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> خطة من 96 جيدا مخطط الإعداد لوحة، وتتمحور عينات اخ...

في عام 2004، نعال وآخرون. 1 وضع جهاز الاستشعار البيولوجي الخلايا البدينة للاختبار عالية الإنتاجية من تحبب. وهو فحص القوية التي تكيفنا للدراسات TCS لدينا ومفصلة في هذا الفيديو. قبل نعال وآخرون. 1 الفحص، تحبب الخلايا البدينة قد تم تقييمها بشكل روتيني عبر β-هيكسوز?...

الخلايا البدينة وحبيبات غاية الخلايا المناعية المستجيب أن تكون بمثابة الوسطاء الرئيسيين في الربو، والحساسية، والطفيليات الدفاع والتسرطن 13-16. يقيمون في ما يقرب من كل الأنسجة أوعية دموية 15، حيث تخزن بشكل آمن وسطاء حساسية والتهابات في حبيبات هيولية حتى المنشط لdegranulate. تحبب هو إيماس من حبيبات غشاء محدد، مما يؤدي إلى إطلاق وسطاء الصيدلانية الفعالة مثل الهستامين، تريبتاز، و leukotrienes 15. هذه النتائج العملية في الشروع في النوع الأول من تفاعلات فرط الحساسية التي تعتبر بالغة الأهمية في تصاعد الدفاع ضد الطفيليات وكذلك الشروع في استجابات حساسية، الربو، ومسببة للسرطان 15. الخلايا البدينة والخلايا القاعدية مستقبلات FcεRI، المستقبلات عالية تقارب لالغلوبولين المناعي E (إيج) 17. التعرض لمسببات الحساسية أو مستضد يسبب تجميع عدة مستقبلات FcεRI فريق الخبراء الحكومي الدولي متجهة الى 17، وهذا هو قس يسمى ب &quot;يشابك&quot; من مستقبلات القطعة Fc فريق الخبراء الحكومي الدولي متجهة الذي يبدأ عملية تحبب: سلسلة من الأحداث التيروزين الفسفرة، وتفعيل فسفوليباز C، هروب رأس المال من الكالسيوم من مخازن الداخلية، وتدفق الكالسيوم إلى داخل الخلية 18. هذا التدفق الكالسيوم ضروري للتحبب، و، علاوة على ذلك، يشير الانصهار الحبيبية مع الغشاء قبل أن يتسببوا إيماس الحبيبية 15. تجريبيا، وهو حامل الأيون الكالسيوم يمكن أن تستخدم لنقل الكالسيوم مباشرة عبر غشاء الخلية 19، والذي يتجاوز أساسا عن نقل الإشارة الخطوات من قبل لتدفق الكالسيوم الخطوة 20، والسماح لتحديد مسار هدفا بواسطة مادة سامة على أنها المنبع أو المصب الكالسيوم مما يشير 20. تحبب يمكن قياسها بسرعة وفعالية من خلال رصد إطلاق سراح β-هيكسوزامينيداز إلى طاف الخلية، والتي يتم تحريرها خطيا من حبيبات جنبا إلى جنب مع الهستامين 6، ولكن أناأسهل بكثير للكشف عن رد فعل بسيط باستخدام انزيم الركيزة وقارئ صفيحة ميكروسكوبية لفحص المنتج الفلورسنت. ويستند هذا الاختبار صفيحة ميكروسكوبية، على النحو المفصل في قسم البروتوكول، بناء على وسيلة قوية ضعت أصلا من قبل نعال وآخرون. 1، التي تقيس انشقاق الركيزة الفلورة 4-ميثيل مبيليفيريل-N-أسيتيل β-D-β-glucosaminide من قبل هيكسوزامينيداز. قمنا بتعديل مقايسة لاختبار آثار المخدرات والمواد السامة، مع تسليط الضوء التريكلوسان هنا. هذا الأسلوب الكمي موثوق تحبب، هو بديل رخيص الثمن، على سبيل المثال، تدفق طرق الكشف على أساس cytometric 21، ولديه القدرة على تقديم نفسه بشكل جيد لفحص عالية الإنتاجية من مجموعة واسعة من الأدوية المضادة للحساسية، وكذلك جهاز المناعة أو المواد الكيميائية المسببة للحساسية. هذه النقطة الأخيرة لها أهميتها ولا سيما في ضوء لعام 2007 تقرير المجلس القومي للبحوث &quot;اختبار السمية في القرن الحادي و21: رؤية وSTRATايجى &quot;( <a href="http://www.nap.edu/openbook.php?record_id=11970">http://www.nap.edu/openbook.php؟record_id=11970</a> )، الذي يدعو لتطوير اختبارات السموم عالية الإنتاجية التي تستخدم خلية ثقافة للحد من استخدام مكلفة من حيوانات المختبر التقليدية مثل الفئران. بروتوكول تحبب التي وضعتها نعال وآخرون. 1 وتعديلها من قبلنا 2، يستخدم خط الخلية RBL-2H3، الذي هو نموذج مقبولة تماما مثلي إلى الإنسان الخلايا البدينة المخاطية أو قعدات 3-5. (ترد تفاصيل طرق لزراعة الخلايا RBL-2H3 في هاتشينسون وآخرون 22). يمكن أن المرجح أن تتكيف هذا الاختبار إلى أي المرفقة نوع الخلايا البدينة. التريكلوسان (TCS) هو المضادة للميكروبات واسعة الطيف التي تم استخدامها لأكثر من 30 عاما في المستشفيات، ومنتجات العناية الشخصية، والسلع الاستهلاكية 23،24. طريقة عمل لخاصية مضادة للميكروبات TCS هو تثبيط الحيوي الدهنية حمض، من المحتمل عن طريق تثبيط enoyl-أسيلالناقل البروتين اختزال 25،26. انها وجدت في جميع أنحاء العالم في مجموعة واسعة من المنتجات الاستهلاكية مثل هلام الاستحمام، وغسول اليد ومعجون الأسنان وغسول الفم، وفي صابون اليد بتركيزات تصل إلى 0.3٪ أو 10 ملم 24. وقد أدى الاستخدام الواسع النطاق للTCS في المستويات التي يمكن اكتشافها في البشر و27-29 في الأنهار والجداول 30. وهناك دراسة أجريت من قبل Allmyr وآخرون. أثبتت أن 27 TCS وعناصره موجودة في كل من البلازما واللبن من أمهات المرضعات. الأهم من ذلك، يتم امتصاصه بسهولة TCS في الجلد 31-37. Queckenberg وآخرون. وجد 37 ~ 10٪ من امتصاص ~ 70 ملم TCS كريم في الجلد البشري في غضون 12 ساعة، مما أدى إلى تركيز كبير في الجلد، حيث تتواجد الخلايا البدينة. وقد تبين TCS سريريا لإدارة الإنسان مرض حساسية الجلد 7-11، ولكن كانت الآلية التي TCS يخفف من أمراض حساسية الجلد غير معروف 38. باستخدام صفيحة ميكروسكوبية الفلورسنت وdetaile مقايسةد في هذا الفيديو، ونحن في الآونة الأخيرة أظهرت أن TCS، بتركيزات منخفضة تصل إلى 2 ميكرون، يخفف من حدة بشكل ملحوظ وظيفة الخلايا البدينة وتحبب، وتوفير تفسير محتمل لهذه البيانات السريرية 2. وبالإضافة إلى تقديم تفسيرا لهذه المعطيات السريرية، النتائج التي توصلنا إليها في بالمر وآخرون. 2 تشير إلى أن TCS تستهدف الجزيئات مما يشير المصب من تدفق الكالسيوم. ونظرا لأهمية الكالسيوم في العديد من إشارات المناعية والعمليات البيولوجية الأخرى، يمكن أن يكون TCS يحتمل أن تكون الآثار السلبية على تشكيلة واسعة من العمليات البيولوجية اللازمة. في الواقع، أظهرت Udoji وآخرون. TCS 39 أن يقمع الخلايا القاتلة النشاط التحللي الإنسان الطبيعي، وظيفة المناعة الفطرية هامة أخرى. خارج إمكاناته كأداة مساعدة العلاجية لمرض حساسية الجلد (أو، على العكس، باعتبارها immunotoxicant)، قد يكون TCS أيضا اضطرابات الغدد الصماء 40-49. وهكذا، فإن إجراءات واضحة بشأن كيفية إعداد هذه المادة الكيميائية في حل طS من الفائدة لعلماء السموم. لأن TCS هو جزيء صغير مسعور، وغالبا ما تستخدم المركبات العضوية لجعله أكثر قابلية للذوبان في الماء. في معظم الدراسات السمية حيث تم اختبار TCS، وإعداد تشارك انحلال في الماء مع المعونة من المذيبات العضوية مثل الإيثانول، الأسيتون، أو زيت 2،50،51. ومع ذلك، في كثير من الأحيان هذه المذيبات نشطة بيولوجيا أنفسهم، وبالتالي تعقيد تفسير المادة الكيميائية اختبار البيانات 51. في الواقع، وفقا لRufli وآخرون. 52 و 53 آخرين، فمن المستحسن أن حلول اختبار للتجارب السمية المائية يتم إعدادها باستخدام الطرق الفيزيائية على الطرق الكيميائية، ونظرا لإمكانات المذيبات الكيماوية لخلق التحف سمية. لقد أظهرنا سابقا أن TCS يذوب في الإيثانول بنسبة 0.24٪ / الماء (المجلد / المجلد) وsonicated لمدة 30 دقيقة يخفف من حدة RBL الصاري تحبب الخلية 2. وقد تبين الإيثانول بتركيزات أعلى من 0.24٪ إلى تثبيط الخلايا البدينة إدناءnulation 54،55-أمثلة على الآثار المحتملة التباس من المذيبات العضوية على دراسات سمية. ليس فقط هو أنه من المهم أن تنظر في تأثير المذيبات على الكائن الحي أو الخلايا المستخدمة للدراسة، ولكن أيضا من المهم لرصد تأثير المذيبات الكيميائية على اختبار نفسه. على سبيل المثال، سكاري وآخرون. وجدت أن 51 في تذويب TCS البولي ايثيلين جلايكول (التي توجد عادة في معاجين الأسنان وغسول الفم) ضعفت تأثيرات مضادة للبكتيريا ومضادة للالترسبات في النساء أنثى صحي في حين حل في الزيوت تسبب في خسارة كاملة من وظيفة. ولذلك، فإن قدرة المذيبات المختلفة لتعدل السموم والمخدرات، بما في ذلك TCS، وينبغي النظر في الآثار في تصميم مقايسة. استخدام الزيوت أو المواد المضافة نكهة قد تتداخل مع آثار TCS في مختلف المنتجات 50،51. في محاولة للقضاء على الحاجة إلى استخدام المذيبات العضوية، ونحن تحسينها لدينا وسيلة لتذويب TCS 2 من خلال القضاء على استخدام وسيلة سول العضويةتنفيس. في هذا البروتوكول، ونحن تذوب حبيبات TCS مباشرة إلى المخزن المؤقت مائي مع الحرارة (≤ 50 ° C)، ومن ثم تحقق من تركيز هذا المخزون TCS بواسطة القياس الطيفي للأشعة فوق البنفسجية فيس. هذه التحسينات ممكنة لأن TCS قابل للذوبان في الماء تصل إلى 40 ميكرومتر ( <a href="http://www.epa.gov/oppsrrd1/REDs/2340red.pdf">http://www.epa.gov/oppsrrd1/REDs/2340red.pdf</a> ) ولقد ثبت على مقاومة التحلل عند تسخينها إلى 50 درجة مئوية ( <a href="http://oehha.ca.gov/prop65/public_meetings/052909coms/triclosan/ciba3.pdf">http:// على / oehha.ca.gov/prop65/public_meetings/052909coms/triclosan/ciba3.pdf</a> ) 56،57. لدينا أيضا فائدة إضافية تتمثل في القياس الطيفي للأشعة فوق البنفسجية فيس، كما TCS وكما هو معروف لاستيعاب بقوة 280 نيوتن متر في 58 مع معامل الانقراض المولي من 4،200 L / مول / سم 12. هذا البروتوكول يوفر وسيلة بسيطة، لكنها فعالة لإذابة حبيبات TCS في منطقة عازلة من دون المعونة من المذيبات العضوية، بما في ذلك تكاليف منخفضة والتحقق السريعمن التركيز، ويصف قوية الفلورسنت فحص صفيحة ميكروسكوبية لرصد الآثار الكيميائية على تحبب الخلايا البدينة.

a microplate assay to assess chemical effects on rbl-2h3 mast cell degranulation: effects of triclosan without use of an organic solvent

الخلايا البدينة تلعب دورا هاما في أمراض الحساسية والمناعة ضد الطفيليات الدفاع. تنشيط مرة واحدة (مثلا عن طريق مثيرة للحساسية)، فإنها degranulate، وهي العملية التي ينتج إيماس من الوسطاء حساسية. التشكيل من تحبب الخلايا البدينة من المخدرات والمواد السامة قد يكون لها آثار إيجابية أو سلبية على صحة الإنسان. وقد تم تشريح وظيفة الخلايا البدينة بالتفصيل مع استخدام مستقعد الخلايا البدينة سرطان الدم الفئران (RBL-2H3)، وهو النموذج المقبول على نطاق واسع من الإنسان الخلايا البدينة المخاطية 3-5. يمكن بسهولة وبشكل موثوق أن تقاس الصاري مكون الخلية الحبيبية والوسيط حساسية β-هيكسوزامينيداز، التي يتم تحريرها خطيا جنبا إلى جنب مع الهيستامين من الخلايا البدينة 6، من خلال رد الفعل مع ركيزة الفلورة، مما أسفر عن كثافة مضان قابلة للقياس في فحص صفيحة ميكروسكوبية التي هي قابلة لل دراسات عالية الإنتاجية 1. نشرت أصلا من قبل نعال وآخرون. 1، ونحن قد تكيفت هذه مقايسة تحبب لفحص سالأدوية و المواد السامة والتظاهر واستخدامه هنا. التريكلوسان هي وكيل واسع الطيف مضاد للجراثيم التي هي موجودة في كثير من المنتجات الاستهلاكية وعثر عليها لتكون المساعدات العلاجية في الإنسان مرض حساسية الجلد 7-11، على الرغم من أن آلية هذا التأثير غير معروف. هنا علينا أن نظهر مقايسة للتأثير على التريكلوسان تحبب الخلايا البدينة. أظهرنا مؤخرا أن التريكلوسان يؤثر بقوة ظيفة الخلايا البدينة 2. في محاولة لتجنب استخدام مذيب عضوي، يذوب التريكلوسان مباشرة إلى المخزن المؤقت مائي مع الحرارة والتحريك، وتأكيد تركيز الناتجة باستخدام القياس الطيفي للأشعة فوق البنفسجية فيس (باستخدام ε 280 = 4،200 L / M / سم) 12. هذا البروتوكول لديه القدرة على أن تستخدم مع مجموعة متنوعة من المواد الكيميائية لتحديد آثارها على تحبب الخلايا البدينة، وعلى نطاق أوسع، إمكاناتهم حساسية.

عند تسخينها إلى 50 درجة مئوية لمدة 90 دقيقة، وطيف الامتصاص للأشعة فوق البنفسجية فيس TCS لتنتج، منحنى قوي السلس بين ~ 260 و 300 نانومتر، مع ذروة عند 280 نانومتر، كما هو مبين في الشكل 1. القياس الطيفي للأشعة فوق البنفسجية فيس هو، بالتالي، أداة هامة التي يمكن استخدامها لحساب تركيز، ...

Watch this Scientific Journal Video about A Microplate Assay to Assess Chemical Effects on RBL-2H3 Mast Cell Degranulation: Effects of Triclosan without Use of an Organic Solvent at JoVE.com

A Microplate Assay to Assess Chemical Effects on RBL-2H3 Mast Cell Degranulation: Effects of Triclosan without Use of an Organic Solvent (Video) | JoVE

تحبب الخلايا البدينة، والإفراج عن وسطاء حساسية، والمهم في الحساسية، والربو، والدفاع الطفيلي. نحن هنا لشرح تقنيات 1 لتقييم آثار المخدرات والمواد السامة على تحبب، المنهجية المستخدمة مؤخرا لإظهار تأثير مثبط قوي من وكيل مضاد للجراثيم التريكلوسان 2.

والفحص صفيحة ميكروسكوبية لتقييم تأثيرات المواد الكيماوية على RBL-2H3 الصاري تحبب الخلايا: آثار التريكلوسان بدون استخدام مذيب عضوي

Mast cells play important roles in allergic disease and immune defense against parasites. Once activated (e.g. by an allergen), they degranulate, a ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

A Microplate Assay to Assess Chemical Effects on RBL-2H3 Mast Cell Degranulation: Effects of Triclosan without Use of an Organic Solvent

Use of an Optical Trap for Study of Host-Pathogen Interactions for Dynamic Live Cell Imaging

Use of an Optical Trap for Study of Host-Pathogen Interactions for Dynamic Live Cell Imaging (Video) | JoVE

استخدام اعتراض البصرية لدراسة التفاعلات المرضي المضيف الحيوي للخلية الحية التصوير

Dynamic live cell imaging allows direct visualization of real-time interactions between cells of the immune system1, 2; however, the lack of spatial and ...

Measurement of Antibody Effects on Cellular Function of Isolated Cardiomyocytes

Measurement of Antibody Effects on Cellular Function of Isolated Cardiomyocytes (Video) | JoVE

قياس تأثيرات على الأجسام المضادة من وظيفة الخلوية Cardiomyocytes متفرقة

Dilated cardiomyopathy  (DCM) is one of the main causes for heart failure in younger adults1.  Although genetic disposition and exposition to toxic ...

Investigating the Effects of Probiotics on Pneumococcal Colonization Using an In Vitro Adherence Assay

Investigating the Effects of Probiotics on Pneumococcal Colonization Using an In Vitro Adherence Assay (Video) | JoVE

التحقيق في آثار البروبيوتيك على المكورات الرئوية الاستعمار باستخدام<em&gt; في المختبر</em&gt; الالتزام الفحص

Adherence of Streptococcus pneumoniae (the pneumococcus) to the epithelial lining of the nasopharynx can result in colonization and is considered a ...

Analyzing the Effects of Stromal Cells on the Recruitment of Leukocytes from Flow

Analyzing the Effects of Stromal Cells on the Recruitment of Leukocytes from Flow (Video) | JoVE

تحليل آثار خلايا انسجة على تجنيد الكريات البيض من التدفق

Stromal cells regulate the recruitment of circulating leukocytes during inflammation through cross-talk with neighboring endothelial cells. Here we ...

Investigating Mast Cell Secretory Granules; from Biosynthesis to Exocytosis

Investigating Mast Cell Secretory Granules; from Biosynthesis to Exocytosis (Video) | JoVE

التحقيق ماست الخلية الإفرازية حبيبات. من البناء الحيوي لالإيماس

Mast Cells (MC) are secretory cells of the immune system that accomplish their physiological and pathological functions by releasing pre-formed and newly ...

Implementation of a Permeable Membrane Insert-based Infection System to Study the Effects of Secreted Bacterial Toxins on Mammalian Host Cells

Implementation of a Permeable Membrane Insert-based Infection System to Study the Effects of Secreted Bacterial Toxins on Mammalian Host Cells (Video) | JoVE

تنفيذ نظام العدوى أساس إدراج-نافذ غشاء لدراسة آثار يفرز البكتيرية السموم على خلايا المضيف الثدييات

Many bacterial pathogens secrete potent toxins to aid in the destruction of host tissue, to initiate signaling changes in host cells or to manipulate ...

Flow Cytometric Analysis of Particle-bound Bet v 1 Allergen in PM10

Flow Cytometric Analysis of Particle-bound Bet v 1 Allergen in PM10 (Video) | JoVE

تدفق تحليل Cytometric من متجهة الجسيمات بيت ت 1 مسببات الحساسية في PM10

Flow cytometry is a method widely used to quantify suspended solids such as cells or bacteria in a size range from 0.5 to several tens of micrometers in ...

Visualizing the Effects of Sputum on Biofilm Development Using a Chambered Coverglass Model

Visualizing the Effects of Sputum on Biofilm Development Using a Chambered Coverglass Model (Video) | JoVE

تصور آثار البلغم للتنمية بيوفيلم باستخدام نموذج غرف ساترة

Biofilms consist of groups of bacteria encased in a self-secreted matrix. They play an important role in industrial contamination as well as in the ...

Fluorescence-based Neuraminidase Inhibition Assay to Assess the Susceptibility of Influenza Viruses to The Neuraminidase Inhibitor Class of Antivirals

Fluorescence-based Neuraminidase Inhibition Assay to Assess the Susceptibility of Influenza Viruses to The Neuraminidase Inhibitor Class of Antivirals (Video) | JoVE

مضان القائم على النورامينيداز تثبيط الفحص لتقييم مدى حساسية فيروسات الأنفلونزا إلى والنورامينيداز المانع فئة من الأدوية المضادة للفيروسات

The neuraminidase (NA) inhibitors are the only class of antivirals approved for the treatment and prophylaxis of influenza that are effective against ...

Effects of Exposure of Formaldehyde to a Rat Model of Atopic Dermatitis Induced by Neonatal Capsaicin Treatment

Effects of Exposure of Formaldehyde to a Rat Model of Atopic Dermatitis Induced by Neonatal Capsaicin Treatment (Video) | JoVE

آثار تعرض فورمالدهايد لنموذج الفئران الاستشرائية الناجمة عن معاملة الأطفال حديثي الولادة كبخاخات

Atopic dermatitis is chronically relapsing pruritic eczema and prevails around the world especially in developed countries. Complex interactions between ...