Name: a microplate assay to assess chemical effects on rbl-2h3 mast cell degranulation: effects of triclosan without use of an organic solvent
Uploaded: 2013-11-01T19:45:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Microplate Assay to Assess Chemical Effects on RBL-2H3 Mast Cell Degranulation: Effects of Triclosan without Use of an Organic Solvent at JoVE.com

LMW und RHK werden von der Graduate School of Biomedical UMaine Science and Engineering (GSBSE) unterstützt; RHK wurde auch von der Maine Agricultural Experiment Station &amp; Wälder unterstützt. Zusätzliche Mittel wurde von der National Institute of General Medical Sciences (NIH P20-GM103423), die Maine Agricultural Experiment Station &amp; Wald (Grant Number ME08004-10, JAG), der University of Maine ADVANCE Rising Tide-Center (NSF Grant # 1008498) zur Verfügung gestellt und ein Forschungs-Starter Grant Pharmakologie / Toxikologie vom PhRMA Stiftung (JAG). Wir danken Drs.. David Holowka und Barbara Baird für das Antigen und Zellen. Wir sind dankbar, dass Hina Hashmi, Alejandro Velez und Andrew Abovian für die Hilfe bei Ausrüstung und Aufträge. Dies ist Maine Agricultural Experiment Station &amp; Wälder Veröffentlichung Nummer 3311.

Beachten Sie, dass alle Puffer Rezepte in einer Tabelle am Ende des Protokolls Text enthalten. TAG 1: 1. Vorbereitung der Zellen <ol><li> Planen Platte mit 96 Vertiefungen Setupverfahren Zentrierung Testproben auf dem Layout, um Randeffekte zu vermeiden. Ordnen Sie drei Wiederholungen für jede Konzentration TCS getesteten (± Degranulation Stimulans des Antigens oder Ionophor) sowie Triplikate für spontane Freisetzung (kein Degranulation Stimulans...

Im Jahr 2004 entwickelte Naal et al. 1 ein Mastzellen Biosensor für das Hochdurchsatz-Tests Degranulation. Es ist ein robustes Assay, dass wir für unsere TCS Studien angepasst und detailliert in diesem Video. Vor der Naal et al. 1-Test, hatte Mastzelldegranulation routinemäßig über β-Hexosaminidase 59-61 beurteilen, aber diese frühen Verfahren verwendet Fluorometern in denen eine Probe zu einer Zeit gelesen wurde. Wichtig ist, Naal et al. gegründet direkte Übereinstimmung ...

Mastzellen sind sehr Immuneffektorzellen, die als Schlüssel dienen Mediatoren bei Asthma, Allergien, Parasiten Verteidigung und Krebsentstehung 13-16 granuliert. Sie in fast jedem vaskularisierten Gewebe 15 wohnen, wo sie sicher speichern allergischen und entzündlichen Mediatoren in zytoplasmatischen Granula bis aktiviert degranulieren. Degranulation der Exozytose von Membran-gebundenen Granulaten, was zur Freisetzung pharmakologisch aktiver Mediatoren, wie Histamin, Tryptase, Leukotriene und 15 ergibt. Dieses Verfahren führt bei der Initiierung von Typ I Überempfindlichkeitsreaktionen, die entscheidend bei der Montage Verteidigung gegen Parasiten sowie Initiierung Allergiker, Asthmatiker und krebserregend sind 15 Antworten. Mastzellen und Basophilen auszudrücken Fc &amp;egr; RI-Rezeptoren, die mit hoher Affinität Rezeptoren für Immunglobulin E (IgE) 17. Die Exposition gegenüber einem Allergen oder Antigen verursacht Aggregation mehrerer IgE-Rezeptoren gebundenen Fc &amp;egr; RI 17, und es ist diese so genannte &quot;Vernetzung&quot; von IgE-gebundenen Fc-Rezeptoren, die die Degranulation einleitet: eine Kaskade von Tyrosinphosphorylierung Ereignisse, die Aktivierung von Phospholipase C, Austausch von Calcium aus internen Speichern und Einstrom von Calcium in die Zelle 18. Das Calcium-Einstrom ist für Degranulation, und ferner Signale Granulat Fusion mit der Membran vor verursacht Granulat Exozytose 15. Experimentell kann ein Calcium-Ionophor zur Haltestelle Calcium direkt über die Zellmembran 19, die im wesentlichen umgeht alle Signaltransduktion Schritte vor der Calcium-Einstrom Schritt 20 verwendet werden, die die Identifizierung eines Weges vorbei durch einen Giftstoff als vor oder hinter Calcium-Signalgebung 20. Degranulation können schnell und effektiv durch die Überwachung der Freisetzung von β-Hexosaminidase in Zellüberstand, die linear aus dem Granulat neben Histamin freigesetzt 6 gemessen werden, aber ichs viel leichter zu detektieren unter Verwendung eines einfachen Enzym-Substrat-Reaktion und eines Mikroplatten-Lesegeräts zum Testen des fluoreszierenden Produkts. Diese Mikroplattenassay, wie im Protokoll Abschnitt beschrieben, ist auf einem robusten Verfahren ursprünglich von Naal et al. 1, die die Spaltung des fluorogenen Substrates 4-Methylumbelliferyl-N-acetyl-β-D-glucosaminid quantifiziert durch β-Basis Hexosaminidase. Wir haben den Test zu Test Wirkungen von Arzneimitteln und Giftstoffen Änderungsdatum, mit Triclosan hier hervorgehoben. Diese Methode zuverlässig quantifiziert Degranulation, ist eine kostengünstige Alternative zu z. B. Durchflusszytometrie basierende Nachweisverfahren 21 und hat das Potenzial, sich gut eignen, um High-Throughput-Screening von einer Vielzahl von Anti-Allergie-Medikamente sowie immunotoxische oder allergene Chemikalien. Dieser letzte Punkt ist besonders wichtig im Hinblick auf die 2007 National Research Council Bericht &quot;Toxicity Testing in das 21. Jahrhundert: Eine Vision und eine Stratgie &quot;( <a href="http://www.nap.edu/openbook.php?record_id=11970">http://www.nap.edu/openbook.php?record_id=11970</a> ), die für die Entwicklung von High-Throughput-toxikologischen Tests, die Zellkultur zu nutzen, um den kostspieligen Einsatz von traditionellen Labortieren wie Mäusen reduzieren befürwortet. Die Degranulation Protokoll Naal et al. 1 entwickelt und modifiziert von uns 2, nutzt die RBL-2H3-Zelllinie, die ein gut akzeptiertes Modell homolog zu menschlichen Schleimhaut Mastzellen oder Basophilen 3-5 ist. (Methoden zur Kultivierung von RBL-2H3-Zellen werden in Hutchinson et al beschrieben. 22). Dieser Test könnte wahrscheinlich auf einem angeschlossenen Mastzellen Typ angepasst werden. Triclosan (TCS) ist ein Breitspektrum-Antibiotika, die für mehr als 30 Jahren in Krankenhäusern, Körperpflegeprodukte und Konsumgüter 23,24 verwendet. Die Wirkungsweise für die antimikrobielle Eigenschaft TCS ist die Hemmung der Fettsäure-Biosynthese, wahrscheinlich durch Hemmung der Enoyl-AcylCarrier-Protein-Reduktase 25,26. Es wird weltweit in einer breiten Palette von Konsumgütern wie Duschgel, Handcreme, Zahnpasta, Mundwasser, und in der Hand Seifen in Konzentrationen bis zu 0,3% oder 10 mM 24. Der flächendeckende Einsatz von TCS hat in nachweisbaren Mengen beim Menschen 27-29 und in Flüssen und Bächen 30 geführt. Eine Studie von Allmyr et al. Gezeigt, dass 27 TCS und seinen Metaboliten, die sowohl im Plasma und Milch von stillenden Müttern sind. Wichtig ist, dass TCS leicht in die Haut absorbiert 31-37. Queckenberg et al. Gefunden 37 ~ 10% Absorption eines ~ 70 mM TCS-Creme in die menschliche Haut innerhalb von 12 Stunden, was zu erheblichen Konzentration in der Haut, wo Mastzellen befinden. TCS wurde klinisch für die menschliche allergische Hautkrankheit 7-11 verwalten gezeigt, aber der Mechanismus, durch den TCS lindert allergische Hauterkrankungen ist unbekannt 38. Mit dem fluoreszierenden Mikroplattenassay detailed in diesem Video haben wir vor kurzem gezeigt, dass TCS in Konzentrationen so niedrig wie 2 um, deutlich dämpft Mastzellfunktion und Degranulation und bietet eine mögliche Erklärung für diesen klinischen Daten 2. Neben der Bereitstellung eine Erklärung für diesen klinischen Daten, unsere Erkenntnisse in Palmer et al. 2 legen nahe, dass TCS Signalmoleküle stromabwärts von Calcium-Einstrom zielt. Aufgrund der Bedeutung von Calcium-Signalisierung in vielen immunologischen und andere biologische Prozesse könnten TCS potentiell nachteilige Auswirkungen auf eine Vielzahl von biologischen Prozessen erforderlich. In der Tat zeigte Udoji et al., Dass 39 TCS menschliche natürliche Killerzellen lytische Aktivität unterdrückt, ein weiterer wichtiger angeborenen Immunfunktion. Jenseits sein Potenzial als therapeutische Hilfe bei allergischen Hauterkrankungen (oder umgekehrt, als immunotoxicant) kann TCS auch eine endokrine Disruptoren 40-49 sein. So ein klares Verfahren, wie diese Chemikalie in Lösung herzustellen is von Interesse Toxikologen. Da TCS ist ein kleines hydrophobes Molekül werden organische Fahrzeugen häufig verwendet, um es in Wasser löslich. In den meisten Toxizitätsstudien, wo TCS getestet wurde, wurde Herstellung Auflösung in Wasser mit Hilfe eines organischen Lösungsmittels, wie Ethanol, Aceton oder Öl 2,50,51 beteiligt. Doch oftmals diese Lösungsmittel sind biologisch aktiv selbst erschweren dadurch Interpretation des Tests chemische Daten 51. In der Tat, nach Rufli et al. 52 und andere 53, empfiehlt es sich, Testlösungen für aquatische Toxizität Experimente werden unter Verwendung physikalischer Methoden auf chemische Verfahren, durch das Potenzial von chemischen Lösungsmitteln Toxizität Artefakte zu erstellen. Wir haben zuvor gezeigt, dass TCS in 0,24% Ethanol / Wasser (v / v) gelöst und 30 min mit Ultraschall behandelt dämpft RBL Mastzelldegranulation 2. Ethanol bei höheren Konzentrationen als 0,24% wurde gezeigt, dass Mastzellen Degra dämpfennulation 54,55-Beispiele für die möglicherweise verwirren Auswirkungen von organischen Lösungsmitteln auf Toxizität. Es ist nicht nur wichtig, um die Wirkung von Lösungsmitteln auf den Organismus oder Zellen zur Untersuchung verwendeten betrachten, sondern es ist auch wichtig, um die Wirkung von Lösungsmitteln aus der Prüfsubstanz selbst überwachen. Zum Beispiel Skaare et al. Fanden heraus, dass 51 Auflösen TCS in Polyethylenglykol (häufig in Zahnpasten und Mundwasser gefunden) geschwächt anti-bakterielle und anti-Plaque-Effekte bei gesunden weiblichen Frauen, während in Auflösung Öle verursacht einen vollständigen Verlust der Funktion. Daher ist die Fähigkeit von verschiedenen Lösungsmitteln zu modulieren Giftstoff und Arzneimittel, einschließlich TCS sollte Effekte in Assays berücksichtigt werden. Verwendung von Ölen oder Geschmack Additive können mit den Auswirkungen der TCS in verschiedenen Produkten 50,51 stören. In dem Bemühen, die Notwendigkeit der Verwendung organischer Lösungsmittel zu beseitigen, verbesserten wir auf unsere Methode zum Lösen TCS 2 durch den Wegfall der Verwendung eines organischen Solentlüften. In der vorliegenden Protokoll, wir lösen TCS Granulat direkt in wässrigem Puffer mit Wärme (≤ 50 ° C), und überprüfen Sie dann die Konzentration dieser TCS Lager durch UV-Vis-Spektroskopie. Diese Verbesserungen sind möglich, weil TCS löslich ist in Wasser bis zu 40 um ( <a href="http://www.epa.gov/oppsrrd1/REDs/2340red.pdf">http://www.epa.gov/oppsrrd1/REDs/2340red.pdf</a> ) und es wurde gezeigt, um den Abbau zu widerstehen, wenn auf 50 ° C (erhitzt <a href="http://oehha.ca.gov/prop65/public_meetings/052909coms/triclosan/ciba3.pdf">http:// / oehha.ca.gov/prop65/public_meetings/052909coms/triclosan/ciba3.pdf</a> ) 56,57. Wir haben auch den zusätzlichen Vorteil der UV-Vis-Spektroskopie, wie TCS ist auch bekannt, bei 280 nm stark absorbieren 58 mit einem molaren Extinktionskoeffizienten von 4200 L / mol / cm 12. Dieses Protokoll bietet eine einfache, aber effektive Möglichkeit, TCS Granulat in einen Puffer zu lösen, ohne die Hilfe eines organischen Lösungsmittels, einschließlich Low-Cost und schnelle ÜberprüfungKonzentration, beschreibt und eine leistungsfähige fluoreszierenden Mikroplattenassay zur Überwachung chemischer Effekte auf Mastzelldegranulation.

a microplate assay to assess chemical effects on rbl-2h3 mast cell degranulation: effects of triclosan without use of an organic solvent

Mastzellen spielen eine wichtige Rolle bei allergischen Erkrankungen und Immunabwehr gegen Parasiten. Einmal aktiviert (z. B. durch ein Allergen), sie degranulieren, ein Prozess, dass die Ergebnisse in der Exozytose von allergischen Mediatoren. Modulation von Mastzelldegranulation durch Medikamente und Giftstoffe können positive oder negative Auswirkungen auf die menschliche Gesundheit. Mastzellfunktion wurde im Detail unter Verwendung von Ratten-Basophilenleukämie Mastzellen (RBL-2H3), eine allgemein anerkannte Modell der menschlichen Schleimhaut Mastzellen 3-5 seziert. Mastzellen Granulat-Komponente und der allergischen Mediator β-Hexosaminidase, der linear zusammen mit Histamin aus Mastzellen 6 freigegeben, leicht und zuverlässig durch die Reaktion mit einem fluorogenen Substrat gemessen werden, was messbar Fluoreszenzintensität in einem Mikroplatten-Assay, der zugänglich ist, Hochdurchsatz-Studien 1. Zitat von Naal et al. 1 veröffentlicht, haben wir diese Degranulation Assay für das Screening o angepasstf Drogen und Giften und demonstrieren ihren Einsatz hier. Triclosan ist ein Breitspektrum-Antibiotikum, die in vielen Verbraucherprodukten ist und sich als ein therapeutisches Hilfsmittel in menschlichen allergischen Hauterkrankungen 7-11, obwohl der Mechanismus für diesen Effekt ist nicht bekannt. Hier zeigen wir einen Assay für die Wirkung von Triclosan auf Mastzellen Degranulation. Wir haben kürzlich gezeigt, dass Triclosan wirkt sich stark auf Mastzellfunktion 2. In dem Bemühen, den Einsatz eines organischen Lösungsmittels zu vermeiden, wird Triclosan direkt in wässrigem Puffer mit Wärme und unter Rühren gelöst, und die daraus resultierende Konzentration die Bestätigung mit UV-Vis-Spektroskopie (mit ε 280 = 4,200 L / M / cm) 12. Dieses Protokoll hat das Potential, mit einer Vielzahl von Chemikalien verwendet werden, um ihre Wirkung auf Mastzellen Degranulation bestimmt, und im weiteren Sinne, deren allergenes Potential.

Beim Erwärmen auf 50 ° C für 90 min, erzeugt das UV-Vis-Absorptionsspektrum für TCS eine starke, glatte Kurve zwischen ~ 260 und 300 nm, mit einem Peak bei 280 nm, wie in Abbildung 1 gezeigt. UV-Vis-Spektroskopie ist daher ein wichtiges Instrument, das verwendet wird, um die Konzentration berechnet werden kann, da die veröffentlichte molaren Absorptionskoeffizienten bei 280 nm 4,200 l / mol / cm 12. Wir haben festgestellt, dass TCS nicht aus der Lösung während des Zeitrahmens der gesamten Degranulation Exp...

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A Microplate Assay to Assess Chemical Effects on RBL-2H3 Mast Cell Degranulation: Effects of Triclosan without Use of an Organic Solvent

Mastzelldegranulation, die Freisetzung von allergischen Mediatoren ist in Allergie, Asthma und Parasiten Verteidigung wichtig. Hier haben wir Techniken 1 für die Beurteilung Auswirkungen von Drogen und Giften auf Degranulation demonstrieren, Methodik kürzlich genutzt, um die leistungsfähige hemmende Wirkung von antibakteriellen Wirkstoff Triclosan 2 aufweisen.

Ein Mikroplatten Assay Chemical Auswirkungen auf die RBL-2H3 Mastzelldegranulation bewerten: Effekte von Triclosan ohne Verwendung eines organischen Lösungsmittels

Mast cells play important roles in allergic disease and immune defense against parasites. Once activated (e.g. by an allergen), they degranulate, a ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Measurement of Antibody Effects on Cellular Function of Isolated Cardiomyocytes

Die Messung der Antikörper Auswirkungen auf zelluläre Funktion von isolierten Kardiomyozyten

Dilated cardiomyopathy  (DCM) is one of the main causes for heart failure in younger adults1.  Although genetic disposition and exposition to toxic ...

Forschung

Immunologie und Infektion

Investigating the Effects of Probiotics on Pneumococcal Colonization Using an In Vitro Adherence Assay

Investigating the Effects of Probiotics on Pneumococcal Colonization Using an In Vitro Adherence Assay

Untersuchung der Effekte von Probiotika auf Pneumokokken-Kolonisation Mit ein<em&gt; In-vitro-</em&gt; Einhaltung Assay

Adherence of Streptococcus pneumoniae (the pneumococcus) to the epithelial lining of the nasopharynx can result in colonization and is considered a ...

Analyzing the Effects of Stromal Cells on the Recruitment of Leukocytes from Flow

Analyse der Auswirkungen von Stromazellen an der Rekrutierung von Leukozyten von Flow

Stromal cells regulate the recruitment of circulating leukocytes during inflammation through cross-talk with neighboring endothelial cells. Here we ...

Investigating Mast Cell Secretory Granules; from Biosynthesis to Exocytosis

Untersuchung Mast Cell Sekretgranula; von Biosynthese zu Exocytosis

Mast Cells (MC) are secretory cells of the immune system that accomplish their physiological and pathological functions by releasing pre-formed and newly ...

A Miniaturized Glycan Microarray Assay for Assessing Avidity and Specificity of Influenza A Virus Hemagglutinins

Ein miniaturisiertes Glycan Microarray-Test zur Beurteilung der Avidität und Spezifität von Influenza-A-Virus Hämagglutininarten

Influenza A virus (IAV) hemagglutinins recognize sialic acids on the cell surface as functional receptors to gain entry into cells. Wild waterfowl are the ...

Implementation of a Permeable Membrane Insert-based Infection System to Study the Effects of Secreted Bacterial Toxins on Mammalian Host Cells

Implementierung eines Systems durchlässige Membran Insert-basierten Infektion der Auswirkungen von sekretierten bakteriellen Toxins zur Untersuchung auf Säugetierwirtszellen

Many bacterial pathogens secrete potent toxins to aid in the destruction of host tissue, to initiate signaling changes in host cells or to manipulate ...

Flow Cytometric Analysis of Particle-bound Bet v 1 Allergen in PM10

Durchflusszytometrische Analyse von partikelgebundenen Bet v 1 Allergens in PM10

Flow cytometry is a method widely used to quantify suspended solids such as cells or bacteria in a size range from 0.5 to several tens of micrometers in ...

Visualizing the Effects of Sputum on Biofilm Development Using a Chambered Coverglass Model

Visualisierung der Auswirkungen von Sputum auf Biofilm-Entwicklung eines Modells mit Kammerdeckgläser

Biofilms consist of groups of bacteria encased in a self-secreted matrix. They play an important role in industrial contamination as well as in the ...

Fluorescence-based Neuraminidase Inhibition Assay to Assess the Susceptibility of Influenza Viruses to The Neuraminidase Inhibitor Class of Antivirals

Fluoreszenz-basierte Neuraminidase-Inhibitionsassay die Empfänglichkeit der Influenza-Viren an die Neuraminidase-Inhibitor-Klasse von Anti-Virus zu beurteilen

The neuraminidase (NA) inhibitors are the only class of antivirals approved for the treatment and prophylaxis of influenza that are effective against ...

Isolation of Peritoneum-derived Mast Cells and Their Functional Characterization with Ca2+-imaging and Degranulation Assays

Isolation of Peritoneum-derived Mast Cells and Their Functional Characterization with Ca2+-imaging and Degranulation Assays

Isolierung von Mastzellen Bauchfell abgeleitet und deren funktionelle Charakterisierung mit Ca2 +-imaging und Degranulation Assays

Mast cells (MCs), as a part of the immune system, play a key role in defending the host against several pathogens and in the initiation of the allergic ...