Name: a microplate assay to assess chemical effects on rbl-2h3 mast cell degranulation: effects of triclosan without use of an organic solvent
Uploaded: 2013-11-01T19:45:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Microplate Assay to Assess Chemical Effects on RBL-2H3 Mast Cell Degranulation: Effects of Triclosan without Use of an Organic Solvent at JoVE.com

LMW og RHK støttes av UMaine Graduate School of Biomedical Science and Engineering (GSBSE); RHK ble også støttet av Maine Agricultural &amp; Forest Experiment Station. Ytterligere finansiering ble gitt av National Institute of General Medical Sciences (NIH P20-GM103423), Maine Agricultural &amp; Forest Experiment Station (Grant Number ME08004-10, JAG), University of Maine ADVANCE Rising Tide Center (NSF Grant # 1008498) , og en Forskning Starter Grant i farmakologi / toksikologi fra PhRMA foundation (JAG). Vi takker legene. David Holowka og Barbara Baird for antigenet og celler. Vi er takknemlige til Hina Hashmi, Alejandro Velez, og Andrew Abovian for hjelp med utstyr og bestillinger. Dette er Maine Agricultural &amp; Forest Experiment Station publikasjon nummer 3311.

Legg merke til at alle buffer oppskrifter er inkludert i en tabell ved enden av protokollen tekst. DAG 1: En. Utarbeidelse av celler <ol><li> Planlegg ut 96-brønners plate oppsett ordningen, sentrering stikkprøvene på bordet for å unngå kanteffekter. Tildel tre replikater for hver konsentrasjon undersøkt, TCS (± degranulering av stimulerende antigen eller ionofor), samt triplicates for spontan frigjøring (nei degranulering sentralstimulerend...

I 2004 utviklet Naal et al. En en mast celle biosensor for høy gjennomstrømming testing av degranulation. Det er en robust analyse som vi har tilpasset for våre TCS studier og detaljert i denne videoen. Før Naal et al. Ett assay hadde mastcelle degranulering blitt rutinemessig vurdert via β-hexosaminidase 59-61, men disse tidlige metoder benyttes Fluorimetre hvori én prøve ble avlest på en gang. Viktigere, Naal et al. etablert direkte samsvar mellom deres mer high-throughpu...

Mast celler er svært kornete immun effektorceller som fungerer som viktige mediatorer i astma, allergier, parasitt forsvar og kreftutvikling 13-16. De bor i nesten alle vaskularisert vev 15, hvor de trygt lagre allergiske og inflammatoriske mediatorer i cytoplasma granulater før aktiveres for å degranulate. Degranulation er exocytosis av membran-bundet granulat, noe som resulterer i utgivelsen av farmakologisk aktive mediatorer som histamin, tryptase, og leukotriener 15. Denne prosessen resulterer i initiering av type I hypersensitivitetsreaksjoner som er kritiske i montering forsvar mot parasitter samt initiere allergiske, astmatiske, og kreftfremkallende svar 15. Mastceller og basofile uttrykke FcεRI reseptorer, high-affinitet reseptorer for immunoglobulin E (IgE) 17. Eksponering for et allergen eller antigen forårsaker aggregering av flere IgE-bundet FcεRI reseptorer 17, og det er denne so-kalt &quot;tverrbinding&quot; av IgE-bundet Fc-reseptorer som initierer degranuleringsprosessen: en kaskade av hendelser tyrosinfosforylering, aktivering av fosfolipase C, effluks av kalsium fra interne lagre, og tilførsel av kalsium inn i cellen 18.. Denne kalsiuminnstrømningen er nødvendig for degranulering, og, videre, signaliserer granule fusjon med membranen før forårsaker granule exocytose 15.. Eksperimentelt kan en kalsium ionofor brukes til transport kalsium direkte over cellemembranen 19, som i det vesentlige omgår alle signaltransduksjon trinn før kalsiuminnstrømningen trinn 20, slik at for identifisering av en sti målet ved et toksisk middel som å være oppstrøms eller nedstrøms kalsium signalisering 20. Degranulering kan måles raskt og effektivt ved å overvåke frigjøringen av β-hexosaminidase inn i celle supernatant, som frigjøres lineært fra granulene sammen histamin 6, men jegs mye lettere å detektere ved hjelp av et enkelt enzym-substrat reaksjon og en mikroplateleser til analysen den fluorescerende produkt. Denne mikroplate assay, som beskrevet i protokollen delen, er basert på en robust metode som opprinnelig ble utviklet av Naal et al. 1, som kvantifiserer spalting av Fluorogenic substrat 4-methylumbelliferyl-N-acetyl-β-D-glukosaminid ved β- hexosaminidase. Vi har endret analysen å teste effekter av legemidler og giftstoffer, med triklosan uthevet her. Denne metoden pålitelig kvantifiserer degranulation, er et billig alternativ til, for eksempel, flowcytometrisk-baserte metoder for påvisning 21, og har potensial til å låne seg pent til high-throughput screening av et bredt spekter av anti-allergi medisiner, samt immuntoksisk eller allergifremkallende kjemikalier. Dette siste punktet er særlig viktig i lys av 2007 National Research Council rapporten &quot;Toxicity Testing i det 21. århundre: En visjon og en Strategy &quot;( <a href="http://www.nap.edu/openbook.php?record_id=11970">http://www.nap.edu/openbook.php?record_id=11970</a> ), som tar til orde for utvikling av high-throughput toksikologi tester som utnytter cellekultur for å redusere kostbare bruk av tradisjonelle forsøksdyr som mus. Den degranulering protokoll utviklet av Naal et al. Ett og modifisert av oss 2, benytter de RBL-2H3-cellelinjen, som er en godt akseptert modell homologt til human mukosale mastceller eller basofiler 3-5. (Metoder for dyrking RBL-2H3 celler er beskrevet i Hutchinson et al. 22). Denne analysen kan sannsynligvis tilpasses enhver vedlagte mast celletype. Triklosan (TCS) er et bredspektret antimikrobiell som har vært brukt i mer enn 30 år i sykehus, personlig pleie, og forbruksvarer 23,24. Virkningsmekanismen for TCS sin antimikrobielle egenskaper er hemming av fettsyrer biosyntese, sannsynligvis ved å hemme enoyl-acylcarrier protein reduktase 25,26. Det er funnet over hele verden i et bredt spekter av forbrukerprodukter som dusjsåpe, håndkrem, tannkrem, munnvann, og i hånden såper ved konsentrasjoner opp til 0,3% eller 10 mm 24. Utbredt bruk av TCS har resultert i påvisbare nivåer hos mennesker 27-29 og i elver og bekker 30. En studie gjort av Allmyr et al. 27. demonstrert at TCS og dets metabolitter er til stede i både plasma og melk fra ammende mødre. Viktigere er TCS lett absorberes inn i huden 31-37. Queckenberg et al. 37. funnet ~ 10% absorpsjon av en ~ 70 mm TCS krem i menneskelig hud innen 12 timer, noe som resulterer i betydelig konsentrasjon i huden, hvor mastceller bor. TCS har vist seg klinisk for å behandle human allergisk hudsykdom 7-11, men mekanismen ved hvilken TCS lindrer allergiske hudsykdommer har vært ukjent 38.. Ved hjelp av den fluorescerende microplate analysen detailed i denne videoen, vi nylig demonstrert at TCS, ved konsentrasjoner så lavt som 2 mikrometer, betydelig demper mast celle funksjon og degranulation, som gir en mulig forklaring på disse kliniske data to. I tillegg til å gi en forklaring på disse kliniske data, våre funn i Palmer et al. 2 tyder på at TCS mål signalmolekyler nedstrøms av kalsium tilstrømningen. På grunn av viktigheten av kalsium signalering i mange immunologiske og andre biologiske prosesser, kan TCS potensielt ha negative effekter på et stort utvalg av biologiske prosesser som er nødvendige. Faktisk viste Udoji et al. 39 som TCS undertrykker menneskets naturlige killer celle lytisk aktivitet, en annen viktig medfødte immunforsvar. Utover sitt potensial som et terapeutisk hjelpemiddel i allergisk hudsykdom (eller omvendt, som en immunotoxicant), kan TCS også være en endokrin disruptor 40-49. Dermed en klar prosedyre på hvordan å forberede dette kjemikaliet i løsningen is av interesse for toksikologer. Fordi TCS er en liten hydrofob molekyl, dannes det organiske kjøretøyer ofte benyttes for å gjøre den mer løselig i vann. I de fleste toksisitetsstudier hvor TCS er blitt testet, har preparat det gjelder oppløsning i vann ved hjelp av et organisk oppløsningsmiddel slik som etanol, aceton eller olje 2,50,51. Imidlertid ofte disse løsemidler er biologisk aktive seg selv, og dermed komplisere tolkningen av test-kjemiske data 51. Faktisk, i henhold til Rufli et al. 52 og andre 53, anbefales det at testløsningene for akvatisk toksisitet eksperimenter blir fremstilt ved bruk av fysiske metoder enn kjemiske metoder, på grunn av potensialet av kjemiske oppløsningsmidler for å skape toksisitet gjenstander. Vi har tidligere vist at TCS oppløst i 0,24% etanol / vann (vol / vol) og sonikert i 30 min demper RBL mastcelle degranulering 2.. Etanol ved høyere konsentrasjoner enn 0,24% har vist seg å dempe mastcelle nedbrytningnulation 54,55-eksempler på de potensielt konfunderende effekter av organiske løsemidler på toksisitetsstudier. Ikke bare er det viktig å vurdere effekten av løsningsmidler på organismen eller celler som brukes for å studere, men også at det er viktig å overvåke virkningen av et løsningsmiddel på prøven kjemisk selv. For eksempel Skaare et al. 51. fant at oppløsnings TCS i polyetylenglykol (som vanligvis finnes i tannpastaer og munnvann) svekket antibakterielle og antiplakkdannende effekt hos friske kvinnelige kvinner mens oppløsningen i oljer forårsaket en fullstendig tap av funksjon. Derfor er evnen av forskjellige oppløsningsmidler modulere toksisk middel og legemiddel, inkludert TCS, bør effektene anses i analysebuffer utforming. Bruk av oljer eller smakstilsetninger kan forstyrre effekten av TCS i ulike produkter 50,51. I et forsøk på å eliminere behovet for å bruke organiske løsningsmidler, forbedres vi ved vår metode for oppløsning av TCS 2 ved å eliminere bruken av en organisk sollufte seg. I den foreliggende protokollen, oppløse vi TCS granulat direkte inn vandig buffer med varme (≤ 50 ° C), og deretter bekrefte konsentrasjonen av dette TCS lager av UV-Vis spektrofotometri. Disse forbedringene er mulig fordi TCS er oppløselig i vann opp til 40 um ( <a href="http://www.epa.gov/oppsrrd1/REDs/2340red.pdf">http://www.epa.gov/oppsrrd1/REDs/2340red.pdf</a> ) og har vist seg å motstå nedbrytning ved oppvarming til 50 ° C ( <a href="http://oehha.ca.gov/prop65/public_meetings/052909coms/triclosan/ciba3.pdf">http:/ / oehha.ca.gov/prop65/public_meetings/052909coms/triclosan/ciba3.pdf</a> ) 56,57. Vi har også den ekstra fordelen av UV-Vis spektrofotometri, som TCS også er kjent for å sterkt absorbere på 280 nm 58 med en jeksel ekstinksjonskoeffisient av 4200 L / mol / cm 12. Denne protokollen er en enkel, men effektiv måte for å oppløse TCS granuler inn i en buffer uten hjelp av et organisk oppløsningsmiddel, blant annet lav kostnad og hurtig verifiseringkonsentrasjon, og beskriver en kraftig fluorescerende mikroplate analysen for å overvåke kjemiske effekter på mast celle degranulation.

a microplate assay to assess chemical effects on rbl-2h3 mast cell degranulation: effects of triclosan without use of an organic solvent

Mastceller spiller viktige roller i allergisk sykdom og immunforsvar mot parasitter. Når aktivert (for eksempel ved et allergen), de degranulate, en prosess som resulterer i exocytosis av allergiske meklere. Modulering av mast celle degranulation av narkotika og giftstoffer kan ha positive eller negative effekter på menneskers helse. Mastcelle funksjonen har blitt dissekert i detalj ved bruk av rotte-basofile leukemi mastceller (RBL-2H3), et allment akseptert modell av humane mukosale mastceller 3-5. Mastcelle granule komponent og den allergiske mediator β-hexosaminidase, som frigjøres lineært i tandem med histamin fra mastceller 6, kan enkelt og pålitelig måles gjennom omsetning med et Fluorogenic substrat, hvilket ga målbar fluorescensintensiteten i en mikroplate assay som er mottagelig for høy gjennomstrømming studier en. Opprinnelig publisert av Naal et al. Ett har vi bearbeidet degranulering denne analysen for screening of narkotika og giftstoffer og demonstrere bruken her. Triklosan er et bredspektret antibakterielt middel som er til stede i mange forbrukerprodukter og har blitt funnet å være et terapeutisk hjelpemiddel i human allergisk hudsykdom 7-11, selv om mekanismen for denne virkning er ikke kjent. Her vi vise et assay for effekten av triklosan på mastcelle degranulering. Vi har nylig viste at triklosan sterkt påvirker mast celle funksjon to. I et forsøk på å unngå bruk av et organisk løsningsmiddel, er triclosan oppløst direkte i vandig buffer under oppvarmning og omrøring, og resulterende konsentrasjon er bekreftet ved hjelp av UV-vis spektrofotometri (ved hjelp ε 280 = 4200 l / M / cm) 12. Denne protokollen har potensiale til å bli brukt med en rekke kjemikalier for å bestemme deres virkninger på mastcelle degranulering, samt mer generelt, deres allergisk potensiale.

Ved oppvarming til 50 ° C i 90 min, produserer UV-vis Absorpsjonsspekteret for TCS en sterk, glatt kurve mellom ~ 260 og 300 nm, med en topp ved 280 nm, som vist på figur 1. UV-Vis-spektrofotometri er derfor et viktig verktøy som kan benyttes til å beregne konsentrasjonen, siden den publiserte molar absorpsjonskoeffisient ved 280 nm er 4200 l / mol / cm 12. Vi har funnet at TCS ikke faller ut av oppløsningen i løpet av den tidsramme av hele eksperimentet degranulering, som følge av 50 ° C varme (data ikke...

Watch this Scientific Journal Video about A Microplate Assay to Assess Chemical Effects on RBL-2H3 Mast Cell Degranulation: Effects of Triclosan without Use of an Organic Solvent at JoVE.com

A Microplate Assay to Assess Chemical Effects on RBL-2H3 Mast Cell Degranulation: Effects of Triclosan without Use of an Organic Solvent

Mastcelle degranulering, frigjøring av allergiske mediatorer, er viktig ved allergi, astma, og parasitt forsvar. Her kan vi demonstrere teknikker en for å vurdere effekter av legemidler og giftstoffer på degranulation, metodikk nylig brukt til å stille den kraftige hemmende effekten av antibakterielt middel triklosan to.

En Microplate Assay å vurdere Kjemiske Effekter på RBL-2H3 Mast Cell degranulation: Effekter av Triklosan uten bruk av et organisk løsemiddel

Mast cells play important roles in allergic disease and immune defense against parasites. Once activated (e.g. by an allergen), they degranulate, a ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Measurement of Antibody Effects on Cellular Function of Isolated Cardiomyocytes

Måling av antistoffer Effekter på cellulær funksjon av isolerte cardiomyocytes

Dilated cardiomyopathy  (DCM) is one of the main causes for heart failure in younger adults1.  Although genetic disposition and exposition to toxic ...

Investigating the Effects of Probiotics on Pneumococcal Colonization Using an In Vitro Adherence Assay

Investigating the Effects of Probiotics on Pneumococcal Colonization Using an In Vitro Adherence Assay

Gransker effekten av Probiotika på Pneumokokk Colonization Bruke en<em&gt; In Vitro</em&gt; Overholdelse analysen

Adherence of Streptococcus pneumoniae (the pneumococcus) to the epithelial lining of the nasopharynx can result in colonization and is considered a ...

Analyzing the Effects of Stromal Cells on the Recruitment of Leukocytes from Flow

Analysere effekten av stromalceller på rekruttering av leukocytter fra Flow

Stromal cells regulate the recruitment of circulating leukocytes during inflammation through cross-talk with neighboring endothelial cells. Here we ...

Investigating Mast Cell Secretory Granules; from Biosynthesis to Exocytosis

Gransker Mast Cell sekresjonsgranuler; fra Biosyntese til eksocytose

Mast Cells (MC) are secretory cells of the immune system that accomplish their physiological and pathological functions by releasing pre-formed and newly ...

A Miniaturized Glycan Microarray Assay for Assessing Avidity and Specificity of Influenza A Virus Hemagglutinins

En miniatyrisert Glycan microarray analyse for å vurdere grådighet og spesifisitet av influensa A virus Hemagglutinins

Influenza A virus (IAV) hemagglutinins recognize sialic acids on the cell surface as functional receptors to gain entry into cells. Wild waterfowl are the ...

Implementation of a Permeable Membrane Insert-based Infection System to Study the Effects of Secreted Bacterial Toxins on Mammalian Host Cells

Implementering av en gjennomtrengelig membran Insert-baserte infeksjon System for å studere effekter av utskilt toksiner på Pattedyrvertsceller

Many bacterial pathogens secrete potent toxins to aid in the destruction of host tissue, to initiate signaling changes in host cells or to manipulate ...

Flow Cytometric Analysis of Particle-bound Bet v 1 Allergen in PM10

Flowcytometrisk analyse av partikkelbundet Bet v 1 Allergen i PM10

Flow cytometry is a method widely used to quantify suspended solids such as cells or bacteria in a size range from 0.5 to several tens of micrometers in ...

Visualizing the Effects of Sputum on Biofilm Development Using a Chambered Coverglass Model

Visualisere effekten av Sputum på Biofilm Development Ved hjelp av en Chambered dekkglass Model

Biofilms consist of groups of bacteria encased in a self-secreted matrix. They play an important role in industrial contamination as well as in the ...

Fluorescence-based Neuraminidase Inhibition Assay to Assess the Susceptibility of Influenza Viruses to The Neuraminidase Inhibitor Class of Antivirals

Fluorescens-baserte Neuraminidase inhiberingsanalyse for å vurdere i hvilken grad influensavirus til neuraminidase Inhibitor Class of Antivirale

The neuraminidase (NA) inhibitors are the only class of antivirals approved for the treatment and prophylaxis of influenza that are effective against ...

Isolation of Peritoneum-derived Mast Cells and Their Functional Characterization with Ca2+-imaging and Degranulation Assays

Isolation of Peritoneum-derived Mast Cells and Their Functional Characterization with Ca2+-imaging and Degranulation Assays

Isolering av Peritoneum-avledet mastceller og deres funksjonell karakteristikk med Ca2 +-imaging og omfatter degranulering analyser

Mast cells (MCs), as a part of the immune system, play a key role in defending the host against several pathogens and in the initiation of the allergic ...