Name: quantitative in vitro assay to measure neutrophil adhesion to activated primary human microvascular endothelial cells under static conditions
Uploaded: 2013-08-23T12:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Quantitative In vitro Assay to Measure Neutrophil Adhesion to Activated Primary Human Microvascular Endothelial Cells under Static Conditions at JoVE.com

Detta arbete stöddes av UCSF Institutionen för anestesi och perioperativ vård.

Ett. Plätering och underhåll av mikrovaskulära endotelceller <ol><li> Tina och odla dina mikrovaskulära endotelceller enligt tillverkarna medföljande instruktionerna. I detta protokoll odlades celler i EGM-2 MV media (Lonza), och det rekommenderas att alla experiment utförs inom två veckor efter upptining för att minimera eventuell variation som beror på passagenummer. Våra experiment med HMVEC-Lung utförs mellan kanalerna 4 till 9. </li><li> Dag 1: När cellerna når 80-90% konfluens, trypsinize och slamma...

<ol>
	<li>Ley, K., Laudanna, C., Cybulsky, M. I., Nourshargh, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Getting+to+the+site+of+inflammation:+the+leukocyte+adhesion+cascade+updated.">Getting to the site of inflammation: the leukocyte adhesion cascade updated.</a> Nat. Rev. Immunol. 7, 678-689 (2007).</li><li>Collins, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptional+regulation+of+endothelial+cell+adhesion+molecules:+NF-kappa+B+and+cytokine-inducible+enhancers.">Transcriptional regulation of endothelial cell adhesion molecules: NF-kappa B and cytokine-inducible enhancers.</a> FASEB Journal : Official Publication of the Federation of American Societies for Experimental Biology. 9, 899-909 (1995).</li><li>Medzhitov, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Origin+and+physiological+roles+of+inflammation.">Origin and physiological roles of inflammation.</a> Nature. 454, 428-435 (2008).</li><li>Chen, G. Y., Nunez, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sterile+inflammation:+sensing+and+reacting+to+damage.">Sterile inflammation: sensing and reacting to damage.</a> Nat. Rev. Immunol. 10, 826-837 (2010).</li><li>Middleton, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcytosis+and+surface+presentation+of+IL-8+by+venular+endothelial+cells.">Transcytosis and surface presentation of IL-8 by venular endothelial cells.</a> Cell. 91, 385-395 (1997).</li><li>Rot, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+cell+binding+of+NAP-1/IL-8:+role+in+neutrophil+emigration.">Endothelial cell binding of NAP-1/IL-8: role in neutrophil emigration.</a> Immunol. Today. 13, 291-294 (1992).</li><li>Detmers, P. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil-activating+protein+1/interleukin+8+stimulates+the+binding+activity+of+the+leukocyte+adhesion+receptor+CD11b/CD18+on+human+neutrophils.">Neutrophil-activating protein 1/interleukin 8 stimulates the binding activity of the leukocyte adhesion receptor CD11b/CD18 on human neutrophils.</a> J. Exp. Med. 171, 1155-1162 (1990).</li><li>Laudanna, C., Kim, J. Y., Constantin, G., Butcher, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+leukocyte+integrin+activation+by+chemokines.">Rapid leukocyte integrin activation by chemokines.</a> Immunol. Rev. 186, 37-46 (2002).</li><li>Simon, S. I., Hu, Y., Vestweber, D., Smith, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+tethering+on+E-selectin+activates+beta+2+integrin+binding+to+ICAM-1+through+a+mitogen-activated+protein+kinase+signal+transduction+pathway.">Neutrophil tethering on E-selectin activates beta 2 integrin binding to ICAM-1 through a mitogen-activated protein kinase signal transduction pathway.</a> J. Immunol. 164, 4348-4358 (2000).</li><li>Zarbock, A., Ley, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+and+consequences+of+neutrophil+interaction+with+the+endothelium.">Mechanisms and consequences of neutrophil interaction with the endothelium.</a> The American Journal of Pathology. 172, 1-7 (2008).</li><li>Muller, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+leukocyte+transendothelial+migration.">Mechanisms of leukocyte transendothelial migration.</a> Annu. Rev. Pathol. 6, 323-344 (2011).</li><li>Brinkmann, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+extracellular+traps+kill+bacteria.">Neutrophil extracellular traps kill bacteria.</a> Science. 303, 1532-1535 (2004).</li><li>Kumar, V., Sharma, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophils:+Cinderella+of+innate+immune+system.">Neutrophils: Cinderella of innate immune system.</a> International Immunopharmacology. 10, 1325-1334 (2010).</li><li>McDonald, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravascular+danger+signals+guide+neutrophils+to+sites+of+sterile+inflammation.">Intravascular danger signals guide neutrophils to sites of sterile inflammation.</a> Science. 330, 362-366 (2010).</li><li>Nathan, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophils+and+immunity:+challenges+and+opportunities.">Neutrophils and immunity: challenges and opportunities.</a> Nat. Rev. Immunol. 6, 173-182 (2006).</li><li>Soehnlein, O., Lindbom, L., Weber, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+underlying+neutrophil-mediated+monocyte+recruitment.">Mechanisms underlying neutrophil-mediated monocyte recruitment.</a> Blood. 114, 4613-4623 (2009).</li><li>Wilhelmsen, K., Mesa, K. R., Prakash, A., Xu, F., Hellman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+endothelial+TLR2+by+bacterial+lipoprotein+upregulates+proteins+specific+for+the+neutrophil+response.">Activation of endothelial TLR2 by bacterial lipoprotein upregulates proteins specific for the neutrophil response.</a> Innate Immun. 18, 602-616 (2012).</li><li>Haugland, R. P., Johnson, I. D., Basey, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Handbook: A Guide to Fluorescent Probes and Labelling Technologies. , (2005).</li><li>Shin, H. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+lipoprotein+TLR2+agonists+broadly+modulate+endothelial+function+and+coagulation+pathways+in+vitro+and+in+vivo.">Bacterial lipoprotein TLR2 agonists broadly modulate endothelial function and coagulation pathways in vitro and in vivo.</a> J. Immunol. 186, 1119-1130 (2011).</li><li>Wilhelmsen, K., Mesa, K. R., Lucero, J., Xu, F., Hellman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ERK5+protein+promotes,+whereas+MEK1+protein+differentially+regulates,+the+Toll-like+receptor+2+protein-dependent+activation+of+human+endothelial+cells+and+monocytes.">ERK5 protein promotes, whereas MEK1 protein differentially regulates, the Toll-like receptor 2 protein-dependent activation of human endothelial cells and monocytes.</a> J. Biol. Chem. 287, 26478-26494 (2012).</li><li>Pober, J. S., Sessa, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolving+functions+of+endothelial+cells+in+inflammation.">Evolving functions of endothelial cells in inflammation.</a> Nat. Rev. Immunol. 7, 803-815 (2007).</li><li>Oh, H., Siano, B., Diamond, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+isolation+protocol.">Neutrophil isolation protocol.</a> J. Vis. Exp. (17), e745 (2008).</li><li>Nuzzi, P. A., Lokuta, M. A., Huttenlocher, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+neutrophil+chemotaxis.">Analysis of neutrophil chemotaxis.</a> Methods Mol. Biol. 370, 23-36 (2007).</li><li>Garcia-Garcia, E., Uribe-Querol, E., Rosales, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+and+efficient+method+to+detect+nuclear+factor+activation+in+human+neutrophils+by+flow+cytometry.">A simple and efficient method to detect nuclear factor activation in human neutrophils by flow cytometry.</a> J. Vis. Exp. (74), e50410 (2013).</li><li>Kuma, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BIRB796+inhibits+all+p38+MAPK+isoforms+in+vitro+and+in+vivo.">BIRB796 inhibits all p38 MAPK isoforms in vitro and in vivo.</a> J. Biol. Chem. 280, 19472-19479 (2005).</li><li>Westra, J., Kuldo, J. M., van Rijswijk, M. H., Molema, G., Limburg, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemokine+production+and+E-selectin+expression+in+activated+endothelial+cells+are+inhibited+by+p38+MAPK+(mitogen+activated+protein+kinase)+inhibitor+RWJ+67657.">Chemokine production and E-selectin expression in activated endothelial cells are inhibited by p38 MAPK (mitogen activated protein kinase) inhibitor RWJ 67657.</a> International Immunopharmacology. 5, 1259-1269 (2005).</li><li>Leeuwenberg, J. F., Jeunhomme, G. M., Buurman, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adhesion+of+polymorphonuclear+cells+to+human+endothelial+cells.+Adhesion-molecule-dependent,+and+Fc+receptor-mediated+adhesion-molecule-independent+mechanisms.">Adhesion of polymorphonuclear cells to human endothelial cells. Adhesion-molecule-dependent, and Fc receptor-mediated adhesion-molecule-independent mechanisms.</a> Clinical and Experimental Immunology. 81, 496-500 (1990).</li><li>Akeson, A. L., Woods, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+fluorometric+assay+for+the+quantitation+of+cell+adherence+to+endothelial+cells.">A fluorometric assay for the quantitation of cell adherence to endothelial cells.</a> Journal of Immunological Methods. 163, 181-185 (1993).</li><li>Vaporciyan, A. A., Jones, M. L., Ward, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+analysis+of+leukocyte-endothelial+adhesion.">Rapid analysis of leukocyte-endothelial adhesion.</a> Journal of Immunological Methods. 159, 93-100 (1993).</li><li>De Clerck, L. S., Bridts, C. H., Mertens, A. M., Moens, M. M., Stevens, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+fluorescent+dyes+in+the+determination+of+adherence+of+human+leucocytes+to+endothelial+cells+and+the+effect+of+fluorochromes+on+cellular+function.">Use of fluorescent dyes in the determination of adherence of human leucocytes to endothelial cells and the effect of fluorochromes on cellular function.</a> Journal of Immunological Methods. 172, 115-124 (1994).</li><li>Bevilacqua, M. P., Pober, J. S., Wheeler, M. E., Cotran, R. S., Gimbrone, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interleukin+1+acts+on+cultured+human+vascular+endothelium+to+increase+the+adhesion+of+polymorphonuclear+leukocytes,+monocytes,+and+related+leukocyte+cell+lines.">Interleukin 1 acts on cultured human vascular endothelium to increase the adhesion of polymorphonuclear leukocytes, monocytes, and related leukocyte cell lines.</a> The Journal of Clinical Investigation. 76, (1985).</li><li>Schleimer, R. P., Rutledge, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cultured+human+vascular+endothelial+cells+acquire+adhesiveness+for+neutrophils+after+stimulation+with+interleukin+1,+endotoxin,+and+tumor-promoting+phorbol+diesters.">Cultured human vascular endothelial cells acquire adhesiveness for neutrophils after stimulation with interleukin 1, endotoxin, and tumor-promoting phorbol diesters.</a> J. Immunol. 136, 649-654 (1986).</li><li>Gamble, J. R., Harlan, J. M., Klebanoff, S. J., Vadas, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stimulation+of+the+adherence+of+neutrophils+to+umbilical+vein+endothelium+by+human+recombinant+tumor+necrosis+factor.">Stimulation of the adherence of neutrophils to umbilical vein endothelium by human recombinant tumor necrosis factor.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 82, 8667-8671 (1985).</li><li>Braut-Boucher, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+non-isotopic,+highly+sensitive,+fluorimetric,+cell-cell+adhesion+microplate+assay+using+calcein+AM-labeled+lymphocytes.">A non-isotopic, highly sensitive, fluorimetric, cell-cell adhesion microplate assay using calcein AM-labeled lymphocytes.</a> Journal of Immunological Methods. 178, 41-51 (1995).</li><li>Ait-Oufella, H., Maury, E., Lehoux, S., Guidet, B., Offenstadt, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+endothelium:+physiological+functions+and+role+in+microcirculatory+failure+during+severe+sepsis.">The endothelium: physiological functions and role in microcirculatory failure during severe sepsis.</a> Intensive Care Medicine. 36, 1286-1298 (2010).</li><li>Andonegui, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelium-derived+Toll-like+receptor-4+is+the+key+molecule+in+LPS-induced+neutrophil+sequestration+into+lungs.">Endothelium-derived Toll-like receptor-4 is the key molecule in LPS-induced neutrophil sequestration into lungs.</a> The Journal of Clinical Investigation. 111, 1011-1020 (2003).</li><li>Sharma, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lung+endothelial+cell+platelet-activating+factor+production+and+inflammatory+cell+adherence+are+increased+in+response+to+cigarette+smoke+component+exposure.">Lung endothelial cell platelet-activating factor production and inflammatory cell adherence are increased in response to cigarette smoke component exposure.</a> American Journal of Physiology. Lung Cellular and Molecular Physiology. 302, L47-L55 (2012).</li><li>Deban, L., Correale, C., Vetrano, S., Malesci, A., Danese, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+pathogenic+roles+of+microvasculature+in+inflammatory+bowel+disease:+a+Jack+of+all+trades.">Multiple pathogenic roles of microvasculature in inflammatory bowel disease: a Jack of all trades.</a> The American Journal of Pathology. 172, 1457-1466 (2008).</li><li>Gross, W. L., Trabandt, A., Csernok, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathogenesis+of+Wegener&amp;#39;s+granulomatosis.">Pathogenesis of Wegener&amp;#39;s granulomatosis.</a> Annales de Medecine Interne. 149, 280-286 (1998).</li><li>Chen, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+of+inflammatory+cell+involvement+in+brain+arteriovenous+malformations.">Evidence of inflammatory cell involvement in brain arteriovenous malformations.</a> Neurosurgery. 62, 1340-1349 (2008).</li><li>Martens, C. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peptides+which+bind+to+E-selectin+and+block+neutrophil+adhesion.">Peptides which bind to E-selectin and block neutrophil adhesion.</a> J. Biol. Chem. 270, 21129-21136 (1995).</li></ol>

De mest kritiska stegen för en lyckad neutrofiler / mikrokärlendotelcell adhesionsanalys är: 1) Användning av låg passage nummer (&lt;9), friska endotelceller, 2) upprätthålla de isolerade neutrofiler vid en låg densitet (dvs. &lt;5 x 10 6 celler / ml) och använder dem inom två timmar av isolering, och 3) Fastidious tvättning av Calcein AM-märkta neutrofiler och användning av Calcein AM-märkta neutrofiler i god tid för att minimera EG kontaminering och förlust av kalcein från neutrof...

Eftersom det vaskulära endotelet är i direkt kontakt med det cirkulerande blodet, är den unikt beläget för att initiera en snabb inflammatoriskt svar under infektion eller skada. Endotelceller (EC) uttryckliga mönster receptorer erkännande som känner igen en mängd bevarade bakteriella komponenter och molekyler fara, och receptorer för värdens inflammatoriska mediatorer, såsom TNF. Aktivering av dessa receptorer leder EC att utsöndra cytokiner (t.ex. IL-6, IL-8, CXCL1 och CCL2), och att uppreglera adhesionsmolekyler (t ex E / P-selektin, VCAM-1 och ICAM-1) vid sin cellyta en , 2. Dessa molekyler underlättar alla lokaliseringen av leukocyter till ställen för infektion och skada för att rensa värden av smittämnen och initiera vävnadsreparation 3,4. Neutrofilsvaret till infektion innebär en väl samordnad samspelet mellan det vaskulära endotelet och svara neutrofiler. Vid EG-aktivering, IL-8 utsöndras och bildar en intravaskulär gradient på endotel som tillåter neutrofiler till hem till platsen av infektion eller skada 5,6. E / P-selektiner medlar neutrofila fånga och rulla genom relativt svaga samband med glycomolecules på neutrofila cellytan. Dessa interaktioner, tillsammans med IL-8-bindning till dess besläktade receptorer, underlätta robusta, integrin-medierad fastsättning och eventuell häktning av neutrofiler på endotelceller ytan 7-10. Efter gripandet kan neutrofiler migrera ut ur kärlen till de specifika smitthärdarna att direkt eliminera patogener, generera neutrofila extracellulära fällor för att förhindra spridning av patogener, främja sårläkning och släpper ytterligare faktorer som rekryterar andra leukocyter såsom monocyter, makrofager och dendritiska celler 11-17. Beskrivs i denna rapport är en in vitro-metod för att kvantifiera neutrofil vidhäftning till microvascular ECS efter aktivering av värdens inflammatoriska medlare TNFa. Denna analys är avsedd att bedöma aktivering av ECS och inte neutrofiler. Primära humana neutrofiler är först isoleras med separation densitetsgradient, och märks sedan med kalcein acetoximetyl (AM). Esteraser inom levande celler hydrolyserar calcein AM till den mycket fluorescerande kalcein molekyl med en excitation av 492 till 495 nm och emission av 513-516 nm 18. De fluorescensmärkta neutrofiler inkuberas sedan med EG monoskikt, och icke vidhäftande neutrofiler avlägsnas därefter. Fluorescensen hos de återstående, bundna neutrofiler mäts sedan med användning av en fluorescensspektrofotometer, och beräknas som en procent av den totala neutrofil fluorescens inmatning per brunn. Denna metod har den ytterligare fördelen att de bundna calcein-märkta neutrofiler används i spektrofotometri direkt kan visualiseras med fluorescens mikroskopi för att ge en mer kvalitativ utläses av EG acmotivation. Eftersom denna analys utförs under statiska förhållanden, kommer bara de allra första händelser som inträffar i neutrofiladhesion kaskad bedömas. Detta bekräftas i denna rapport med hjälp av E-selektin blockerande antikroppar för att visa att neutrofila vidhäftning till TNF-behandlad human lunga mikrovaskulära EC (HMVEC-Lung) monolager minskar drastiskt när interaktionen med E-selektin störs. Förutom TNFa, har vi använt framgångsrikt denna analys för att fastställa omfattningen av mänsklig navelven EG (HUVEC) aktivering genom den Toll-like receptor halv agonister peptidoglykan-associerat lipoprotein (PAL), murein lipoprotein (MLP) och Pam3Cys och HMVEC-Lung aktivering av Pam3Cys 19,20. Dessutom använde vi framgångsrikt denna analys med kinaseinhibitors och efter RNAi-medierad knockdown av ytan och cytoplasmaproteiner i HMVEC-Lung, vilket tyder på att denna metod är förenlig med en rad biokemiska och screening analyser 20. Sammanfattningsvis ger denna analys en lättanvänd, reproducerbar, mer funktionellt sätt att komma åt omfattningen av EG aktivering av inflammatoriska mediatorer in vitro.

<table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td>Name of the reagent</td>
 <td>Company</td>
 <td>Catalogue number</td>
 <td>Comments (optional)</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>HMVEC-Lung</td>
 <td>Lonza</td>
 <td>CC-2527</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>EGM-2 MV</td>
 <td>Lonza</td>
 <td>CC-3202</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>HBSS</td>
 <td>Life Technologies</td>
 <td>14175-095</td>
 <td>Can be substituted with any vendor</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>48-well Tissue Culture Plates</td>
 <td>BD Falcon</td>
 <td>353078</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>PBS (without phenol red)</td>
 <td>UCSF Cell Culture Facility</td>
 <td>CCFAL001 </td>
 <td>Can be substituted with any vendor</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>D-PBS (without Ca2+ and Mg2+ and phenol red)</td>
 <td>UCSF Cell Culture Facility</td>
 <td>CCFAL003</td>
 <td>Can be substituted with any vendor</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>RPMI-1640 (without phenol red)</td>
 <td>Life Technologies</td>
 <td>11835-030</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Polymorphprep</td>
 <td>Axis-Shield</td>
 <td>1114683</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>calcein AM</td>
 <td>Life Technologies</td>
 <td>C3099</td>
 <td>(0.995 mM) stock soln</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Trypan Blue Solution</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>T8154</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>40 &mu;M filters</td>
 <td>VWR</td>
 <td>21008-949</td>
 <td>Can be substituted with any vendor</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>FLUOstar OPTIMA Spectrophotometer</td>
 <td>BMG LABTECH</td>
 <td>-</td>
 <td></td>
 </tr>
 </tbody>
</table>

quantitative in vitro assay to measure neutrophil adhesion to activated primary human microvascular endothelial cells under static conditions

Den vaskulära endotelet spelar en integrerad del i det inflammatoriska svaret. Under den akuta fasen av inflammation, är endotelceller (EC) aktiveras av värdens medlare eller direkt av konserverade mikrobiella komponenter eller värdhärledda molekyler fara. Aktiverat ECS uttryckliga cytokiner, kemokiner och adhesionsmolekyler som mobiliserar, aktivera och behålla leukocyter vid platsen för infektion eller skada. Neutrofiler är de första leukocyter att komma fram, och hålla sig till endotelet genom olika adhesionsmolekyler närvarande på ytorna av båda cellerna. De viktigaste funktionerna i neutrofiler är att direkt eliminera mikrobiella hot, främja rekrytering av andra leukocyter genom frisättning av ytterligare faktorer, och initiera sårläkning. Därför är deras rekrytering och fastsättning till endotelet ett kritiskt steg vid initieringen av det inflammatoriska svaret. I denna rapport beskriver vi en in vitro neutrofiladhesion analysen medkalcein AM-märkta primära humana neutrofiler för att kvantifiera omfattningen av mikrokärlendotelcell aktivering under statiska förhållanden. Denna metod har den ytterligare fördelen att samma prover kvantifierades genom fluorescens spektrofotometri också kan visualiseras direkt med användning av fluorescensmikroskopi för en mer kvalitativ bedömning av neutrofil bindning.

För att erhålla tillförlitliga, reproducerbara resultat med en neutrofil bindningsanalys, är det viktigt att hälso-och confluency av mikrovaskulära endotelceller är optimala dagen för analysen, som illustreras med HMVEC-Lung i figur 1. Dessutom är det absolut nödvändigt att lågt passagetal mikrovaskulära EC används (dvs. mindre än 9 stycken), och därför rekommenderar vi att utföra alla experiment inom två veckor efter upptining. Hälsan hos neutrofiler är också av yttersta ...

Watch this Scientific Journal Video about Quantitative In vitro Assay to Measure Neutrophil Adhesion to Activated Primary Human Microvascular Endothelial Cells under Static Conditions at JoVE.com

Quantitative In vitro Assay to Measure Neutrophil Adhesion to Activated Primary Human Microvascular Endothelial Cells under Static Conditions

Neutrofil anslutning till aktiverat endotel vid ställen för infektion är en integrerad del av värdens inflammatoriska svar. Beskrivs i denna rapport är en neutrofil bindningsanalys som möjliggör<em&gt; In vitro</em&gt; Kvantifiering av primär human neutrofil bindning till endotelceller aktiverade av inflammatoriska mediatorer under statiska förhållanden.

Kvantitativ<em&gt; In vitro</em&gt; Analys för att mäta neutrofilvidhäftning till Aktiverade primära humana mikrovaskulära endotelceller under statiska förhållanden

The vascular  endothelium plays an integral part in the inflammatory response. During the  acute phase of inflammation, endothelial cells (ECs) are ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Quantitative In vitro Assay to Measure Neutrophil Adhesion to Activated Primary Human Microvascular Endothelial Cells under Static Conditions

In Vitro Assay of Bacterial Adhesion onto Mammalian Epithelial Cells

In Vitro Assay of Bacterial Adhesion onto Mammalian Epithelial Cells

In vitro-analys av bakteriell vidhäftning på däggdjur epitelceller

To cause infections, bacteria must colonize their host. Bacterial pathogens express various molecules or structures able to promote attachment to host ...

Isolation of Human Umbilical Vein Endothelial Cells and Their Use in the Study of Neutrophil Transmigration Under Flow Conditions

Isolering av humana navelvenendotelceller och deras användning i studier av neutrofilinhibitorfaktor Transmigration Under flödesförhållanden

Neutrophils are the most abundant type of white blood cell. They form an essential part of the innate immune system1. During acute inflammation, ...

An In vitro Co-infection Model to Study Plasmodium falciparum-HIV-1 Interactions in Human Primary Monocyte-derived Immune Cells

An In vitro Co-infection Model to Study Plasmodium falciparum-HIV-1 Interactions in Human Primary Monocyte-derived Immune Cells

En<em&gt; In vitro</em&gt; Co-infektion modell för att studera<em&gt; Plasmodium falciparum</em&gt;-HIV-1 Interactions in Human primära monocyt-härledda Immunceller

Plasmodium falciparum, the causative agent  of the deadliest form of malaria, and human immunodeficiency virus type-1 (HIV-1) are among the most important ...

In vitro Coculture Assay to Assess Pathogen Induced Neutrophil Trans-epithelial Migration

In vitro Coculture Assay to Assess Pathogen Induced Neutrophil Trans-epithelial Migration

In vitro Kokulturanalys för att bedöma patogeninducerad neutrofil transeptelmigration

Mucosal surfaces serve as protective barriers against pathogenic organisms.&#160;Innate immune responses are activated upon sensing pathogen leading to ...

A Flow Adhesion Assay to Study Leucocyte Recruitment to Human Hepatic Sinusoidal Endothelium Under Conditions of Shear Stress

En Flow Vidhäftning analys för att studera Leucocyte Rekrytering till Human lever Sinus Endothelium under förhållanden av skjuvspänning

Leucocyte infiltration into human liver tissue is a common process in all adult inflammatory liver diseases. Chronic infiltration can drive the ...

Human Neutrophil Flow Chamber Adhesion Assay

Humant neutrofilt flöde kammare Adhesion Assay

Neutrophil firm adhesion to endothelial cells plays a critical role in inflammation in both health and disease. The process of neutrophil firm adhesion ...

Static Adhesion Assay for the Study of Integrin Activation in T Lymphocytes

Statisk vidhäftning analys för studier av Grin Aktivering i T-lymfocyter

T lymphocyte adhesion is required for multiple T cell functions, including migration to sites of inflammation and formation of immunological synapses with ...

Real-time Imaging of Endothelial Cell-cell Junctions During Neutrophil Transmigration Under Physiological Flow

Realtid avbildning av endotelceller-cells Junctions Under neutrofila Trans under fysiologiska Flow

During inflammation, leukocytes leave the circulation and cross the endothelium to fight invading pathogens in underlying tissues. This process is known ...

In Vitro and In Vivo Model to Study Bacterial Adhesion to the Vessel Wall Under Flow Conditions

In Vitro and In Vivo Model to Study Bacterial Adhesion to the Vessel Wall Under Flow Conditions

In vitro och in vivo modell för att studera bakteriell vidhäftning till kärlväggen Under Flow Villkor

In order to cause endovascular infections and infective endocarditis, bacteria need to be able to adhere to the vessel wall while being exposed to the ...

Assay of Adhesion Under Shear Stress for the Study of T Lymphocyte-Adhesion Molecule Interactions

Analys av vidhäftning under Shear stress för studier av T-lymfocyter-adhesionsmolekyl interaktioner

Overall, T cell adhesion is a critical component of function, contributing to the distinct processes of cellular recruitment to sites of inflammation and ...