Name: infinium assay for large-scale snp genotyping applications
Uploaded: 2013-11-19T14:10:00
Duration: 13 min 33 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Infinium Assay for Large-scale SNP Genotyping Applications at JoVE.com

De financiering voor dit werk is verstrekt door NIH P20 GM103456, NIH RC2 AR058959 en NIH R56 AI063274

<ol>
	<li>Shi, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enabling+large-scale+pharmacogenetic+studies+by+high-throughput+mutation+detection+and+genotyping+technologies.">Enabling large-scale pharmacogenetic studies by high-throughput mutation detection and genotyping technologies.</a> Clin. Chem. 47 (2), 164-172 (2001).</li><li>Livak, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SNP+genotyping+by+the+5'-nuclease+reaction.">SNP genotyping by the 5'-nuclease reaction.</a> Methods Mol. Biol. 212, 129-148 (2003).</li><li>Seeb, J. E., Pascal, C. E., Ramakrishnan, R., Seeb, L. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SNP+genotyping+by+the+5'-nuclease+reaction:+advances+in+high+throughput+genotyping+with+non-model+organisms.">SNP genotyping by the 5'-nuclease reaction: advances in high throughput genotyping with non-model organisms.</a> Methods in Mol. Biol. 578, 277-292 (2009).</li><li>Bay&#233;s, M., Gut, I. G., ed, . <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overview+of+Genotyping.">Overview of Genotyping.</a> Molecular Analysis and Genome Discovery. , 1-23 (2011).</li><li>Lee, Y., Seifert, S. N., Fornadel, C. M., Norris, D. E., Lanzaro, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-Nucleotide+Polymorphisms+for+High-Throughput+Genotyping+of+Anopheles+arabiensis+in+East+and+Southern+Africa.">Single-Nucleotide Polymorphisms for High-Throughput Genotyping of Anopheles arabiensis in East and Southern Africa.</a> J. Med. Entomol. 49 (2), 307-315 (2012).</li><li>Liu, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SNP+Genotyping+Platforms.">SNP Genotyping Platforms.</a> Next generation sequencing and whole genome selection in aquaculture. , 123-132 (2011).</li><li>Shen, R., Fan, J. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+SNP+genotyping+on+universal+bead+arrays.">High-throughput SNP genotyping on universal bead arrays.</a> Mutat. Res./Fundam and Mol. Mech. of Mutagenesis. 573 (1), 70-82 (2005).</li><li>Ragoussis, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genotyping+technologies+for+all.">Genotyping technologies for all.</a> Drug Discov. Today: Technol. 3 (2), 115-122 (2006).</li><li>Wu, C. C., Shete, S., Jo, E. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole-Genome+Detection+of+Disease-Associated+Deletions+or+Excess+Homozygosity+in+a+Case-Control+Study+of+Rheumatoid+Arthritis.">Whole-Genome Detection of Disease-Associated Deletions or Excess Homozygosity in a Case-Control Study of Rheumatoid Arthritis.</a> Hum. Mol. Genet. , (2012).</li><li>Green, E. K., Hamshere, M., Forty, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Replication+of+bipolar+disorder+susceptibility+alleles+and+identification+of+two+novel+genome-wide+significant+associations+in+a+new+bipolar+disorder+case-control+sample.">Replication of bipolar disorder susceptibility alleles and identification of two novel genome-wide significant associations in a new bipolar disorder case-control sample.</a> Mol. Psychiatry. , (2012).</li><li>Shete, S., Hosking, F. J., Robertson, L. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+association+study+identifies+five+susceptibility+loci+for+glioma.">Genome-wide association study identifies five susceptibility loci for glioma.</a> Nat. Genet. 41 (8), 899-904 (2009).</li><li>Inc Illumina. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Infinium HD Ultra User Guide 11328087 RevB-1. , 15-101 (2009).</li><li>Turner, S., Armstrong, L. o. r. e. n. L., Yuki Bradford, ., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quality+Control+Procedures+for+Genome+Wide+Association+Studies.">Quality Control Procedures for Genome Wide Association Studies.</a> Curr Protoc Hum Genet. , 1-19 (2011).</li></ol>

De auteurs van dit artikel hebben geen concurrerende financiële belangen openbaar te maken.

Grootschalige genotypering toepassingen zijn gebruikt om beter inzicht in de genetische mechanisme achter vele menselijke ziekten. De ontdekking van een belangrijke variant via een genoom-brede associatie analyse kan een kandidaat regio vlag voor verdere studie. Daarnaast genotype data is een goed hulpmiddel voor de kwaliteitscontrole op sequencing projecten. Om sample throughput te maximaliseren, kunnen meerdere monster platen worden versterkt en opgeslagen in hun gefragmenteerde, geresuspendeerde staten. Acht plaatjes worden geamplificeerd in een enkele dag combineert de eerste 24 uur van het protocol voor meerdere partijen en bieden genoeg materiaal voor ~ 2-8 dagen chip-processing. Als versterkte platen van tevoren worden opgeslagen, en als er nieuwe monsters worden gehybridiseerd met chips onmiddellijk na het scannen begint op de vorige run, kan de verwerking continu draaien zonder de noodzaak om te pauzeren voor extra monster voorbereiding. Daarom zal al monsters drie dagen om de volledige ondergaantest kunnen gegevens dagelijks gegenereerd. Assuming24 chips worden dagelijks verwerkt, een 5 daagse werkweek zorgt voor meer dan 1000 DNA-monsters te worden uitgevoerd op een 12-sample kraal chip. Als een trede of een reagens is mislukt echter meerdere batches mogelijk gevaar lopen voor de slechte prestaties voordat een correctie kan worden toegepast. Fouten kunnen onopgemerkt totdat de arrays worden gescand of geanalyseerd, daarom, als throughput gemaximaliseerd, honderden monsters in verschillende stadia van het protocol zou al hebben dezelfde gebrekkige behandeling bij ontdekking ontvangen. Als verloren reagentia en de gegevens niet kunnen worden hersteld, moet de gebruiker deze risico&#39;s af te wegen tegen de noodzaak van een versnelde workflow. De GenomeStudio analyse software is de eerste kans om het succes van het genotyperingsproces werkelijk meten. Als de Norm-R vs Norm-Theta intensiteit percelen goed zijn geclusterd, moet de gemiddelde call rate (percentage van de totale SNPs succes getypt) van de monsters te benaderen 99%, hoewel deze waarde varieert slightly afhankelijk van het type array. De gegevens van een monster met een oproep lager tarief dan 85-90% is niet betrouwbaar en moet worden weggegooid. Voor kwaliteitscontrole doeleinden, moeten de resultaten worden vergeleken met een eerder bekende mogelijke genotypen wanneer. Als de gegevens bestaan, opzettelijke monster duplicatie is een nuttig hulpmiddel bij de controle van plaat of matrix plaatsingen. Deze dubbele paren moeten op aparte chips, borden, batches, of projecten worden geplaatst; hun genotypen gecontroleerd op generatie. Terwijl specifieke QC beperkingen variëren naar gelang de voorkeur van de onderzoeker, zijn gemeenschappelijke SNP beperkingen op basis van steekproefsgewijze oproep succes, Hardy-Weinberg evenwicht, of onvolledigheid tussen patiënten en controles, terwijl gemeenschappelijke steekproef beperkingen zijn gebaseerd op de beltarieven, Mendeliaanse inconsistenties of kruisverwijzingen X-chromosoom heterozygositeit klinische sekse gegevens [13]. Als zich een probleem voordoet, de Controls Dashboard, gevonden in de analyse suite, kan worden aan de ingediendebedrijf om oorzaak te bepalen. Deze controles kunnen vaak een beperking van de vraag naar de meest waarschijnlijke stap of reagens mislukking. Als een SNP&#39;s van belang zijn te vinden via een Infinium genotypering experiment, moeten hun intensiteit plots dubbel gecontroleerd in GenomeStudio voor clustering fouten voordat verder onderzoek wordt uitgevoerd zijn. Een mislukte Infinium genotypering experiment is waarschijnlijk te wijten aan menselijke fout bij het verwerken of slechte kwaliteit ingang DNA. Monster kwantificering moeten accuraat en nauwkeurig zijn. Voor het beste resultaat, elke reagentia toegevoegd aan een monster of chip moet worden afgegeven bij de door het protocol ingestelde volume. Pipetten moeten behoren te worden geijkt. Reagentia moeten niet worden uitgevoerd na verloop en mag niet worden ingevroren eenmaal ontdooid, behalve de RA1 reagens. Om eventuele vlekken en uitbreiding fouten te minimaliseren, dient de formamide / EDTA mengsel vers bereid elke maand. Alle -20 ° C reagentia moeten worden opgeslagen in uitsluitend handmatige ontdooiing vriezers. Alle labware gebruikt in de staining, uitbreiding, en wassen delen van het protocol moet grondig worden gespoeld met water en een mild reinigingsmiddel onmiddellijk na onbruik. Het bevochtigen reservoirs in de hyb kamer moet worden geschrobd met een reageerbuis borstel en een mild schoonmaakmiddel. De glasplaatjes moet worden gewassen met 10% bleekmiddel, zoals geïnstrueerd door hun gebruikershandleidingen, een keer per week.

Het typen van single nucleotide polymorfismen (SNP&#39;s) is een belangrijke methode voor het identificeren risico varianten geassocieerd met de ziekte. Historisch gezien is de reikwijdte van de genotypering experimenten beperkt door de beschikbare technologie. Gel elektroforese gebaseerde genotyperingsmethoden zijn beperkt in monster-en SNP-throughput [1]. Het ontwikkelen van deze testen kunnen vaak arbeidsintensief zijn, een beroep op de make-up en de structuur van de regio rond de variant voor de optimalisatie [1]. TaqMan genotypering assays ontwikkeld door Life Technologies, kan een groot aantal monsters snel en met minimale technicus betrokkenheid werking [2], maar SNP multiplexen beperkingen blijft het totale aantal genotypen beperken tot ruim onder de een miljoen per dag [3,4 ]. Sequenom Iplex platform kan ook draaien vele monsters in een keer, maar, aangezien minder dan honderd SNPs samen kunnen worden multiplexed, throughput is relatief lage algemene [5]. Beckman Coulter&#39;s SNP stroom technologietheoretisch produceren meer dan 3.000.000 genotypen per dag, maar dit technologische grenzen project bereik slechts maximaal achtenveertig SNPs per reactie [4,6]. Terwijl de GoldenGate assay bijna tweehonderd DNA-monsters per dag kan verwerken op honderden of duizenden SNPs per monster, de prijs per genotype is niet concurrerend met geavanceerde, ultra-high-throughput technieken bij het ​​typen meer dan drieduizend SNPs tegelijk [4,7 ]. Om enkele miljoenen genotypes per dag verwerken, de schaal die nodig is voor grote genoom-brede associatie studies, array-hybridisatietesten zijn geworden van de meest kosteneffectieve optie op de markt. Affymetrix&#39;s lijn van hybridisatie arrays en Illumina&#39;s lijn van Infinium-gebaseerde arrays staan ​​mogelijk honderden samples op honderdduizenden of miljoenen SNPs worden ingetypt in parallel [4,8]. Deze SNP&#39;s kunnen worden verspreid over het hele genoom, gelokaliseerd in de regio&#39;s van belang, zoals exOMES, of aangepast aan de voorkeur van de gebruiker. Deze arrays hebben het voordeel niet alleen in staat om nauwkeurig genotype een miljoen SNPs per monster tegelijk, maar ook copy number variation meten mogelijk onthulling chromosomale abnormaliteiten. Infinium uitgelijnd OMNI BeadChip arrays hebben momenteel de mogelijkheid om elke dag genotype tot bijna vijf miljoen markers per monster, met inbegrip van een half miljoen aangepaste loci, op tot bijna honderd monsters. Aangezien de meeste ziekten hebben een genetische component, kunnen deze grootschalige experimenten cruciaal bij het vinden genen geassocieerd met ziekte. High-throughput genotypering zorgt voor een efficiënte genotype generatie steekproef zet groot genoeg is om overtuigend te sporen genetische associatie bij lagere minor allel frequenties. Hele genoom genotypering projecten kan worden gebruikt om gebieden te lokaliseren met statistisch significante case-control allel frequentie of aantal kopieën verschillen [9,10,11]. Volgens de National Human Genome Research Institute, genoom-brede associatie studies hebben geleid tot 1.490 afzonderlijke publicaties tussen 25 november 2008 en 25 januari 2013, als gevolg van de ontdekking van 8283 SNPs met een p-waarde van minder dan 1 x 10 -5 (zie http:// www.genome.gov/gwastudies/). Deze studies, die aandoeningen, variërend van hoogte naar teelbalkanker, profiteerde van de brede benadering wordt geboden door een genoom-brede analyse onderzocht. In gevallen zoals deze, kunnen hele regio&#39;s van belang aandacht ontsnapten was de reikwijdte van het typen te beperkend geweest. Aldus voor grootschalige associatietesten, een genoom-brede genotypering techniek is de techniek van keuze. Verschillende versies van de Infinium test bestaat, elk bestemd voor gebruik met bepaalde typen arrays. De InfiniumUltra assay, besproken in de diepte beneden, is geschikt voor vele 12 - of 24-monsterarray chips. Deze vaak genotype meer dan honderdduizend SNPs per DNA-monster en de focus op targeted regio&#39;s, zoals op exome of aangepaste panelen. Andere assay versies kunnen worden tot andere soorten chips, zoals de hele genoom genotypering arrays. Echter, zoals alle Infinium assays delen een gemeenschappelijke basis en vooral verschillen alleen door het reagens namen, het reagens volumes, of de exacte kleuring reagens procedure, technieken geperfectioneerd aan een test versie kan vaak worden universeel toegepast. Andere arrays, zoals methylatie arrays, kan een nagenoeg identieke protocol, ook. Zorg moet worden genomen om alleen de versie van de test voor het soort chip gebruikt. Sommige soorten, zoals degenen meten van genexpressie niveau, zou het gebruik van een nonInfinium protocol nodig. De monsters moeten worden verwerkt in batches. Bijvoorbeeld, de InfiniumUltra test prehybridisatie reageerbuizen bevatten voldoende volume 96 monsters uitgevoerd en de buizen niet worden ingevroren. Derhalve moeten monsters worden uitgevoerd in partijen van 96 monsters tegelijk. De monsters worden versterkt op de sparrent dag. Na ongeveer 1 uur van benchwork moeten de monsters in een convectieoven gedurende 20-24 uur verwarmd. De volgende dag, ongeveer 4 uur worden besteed fragmenteren, neerslaan, en resuspenderen van de monsters, waarna de monsters kunnen ofwel worden ingevroren voor toekomstig gebruik of gehybridiseerd met de chip. Laden chips duurt bijna 2 uur, waarna de monsters worden &#39;s nachts gehybridiseerd gedurende 16-24 uur. Op de derde dag, de kleuring en uitbreiding stap duurt ongeveer 4 uur. Een verdere uur wordt besteed wassen, coaten en drogen van de chips. Tenslotte worden de arrays gescand, waarbij rekening kan 15-60 min / chip, afhankelijk van het gebruikte type. Standaard laboratorium veiligheid en netheid voorzorgsmaatregelen toe te passen. Hoewel de amplificatie niet op PCR gebaseerde, afzonderlijke werkstations voor pre-en postamplification procedures nodig zijn om kans op besmetting te minimaliseren. Het identificatienummer van elk-kit geleverd reagens in gebruik moet aangemeld zijn een tracking vel. Reagegen moet worden vlak voor gebruik een paar keer voorafgaand aan de uitgifte ontdooid en omgekeerd. Het DNA worden ingetypt moeten hoogwaardige genomische DNA (260/280 absorptie verhouding van 1,6-2,0, 260/230 absorptie ratio onder 3.0), geïsoleerd door middel van standaard methoden en gekwantificeerd met een fluorometer zijn. Afbraak van DNA vaak een bijdragende factor in lage kwaliteit testresultaten. Doorgaans wordt 200 ng DNA nodig, maar dit bedrag kan variëren voor bepaalde soorten chip. Een Tecan-liquid handling robot kan vele stappen van het protocol te automatiseren en het minimaliseren van menselijke fouten als een factor.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="477">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="66">
			<td height="66" style="height:66px;width:145px;">Consumable or Equipment</td>
			<td style="width:121px;">Manufacturer&#160;</td>
			<td style="width:99px;">Part Number&#160;</td>
			<td style="width:113px;">Minimum Required for 96 Samples</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:145px;">0.8 ml Deep Well Plate</td>
			<td style="width:121px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:99px;">AB-0765</td>
			<td style="width:113px;">1</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:145px;">Plate Mats</td>
			<td style="width:121px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:99px;">AB-0674</td>
			<td style="width:113px;">2</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:145px;">Reagent Basin</td>
			<td style="width:121px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:99px;">13-681-502</td>
			<td style="width:113px;">9</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:145px;">Heat-seal Sheets</td>
			<td style="width:121px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:99px;">AB-0559</td>
			<td style="width:113px;">1</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:145px;">Flow-through Spacer</td>
			<td style="width:121px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:99px;">NC9563984</td>
			<td style="width:113px;">6</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:145px;">Pipette tips - 200 &#956;l</td>
			<td style="width:121px;">Rainin</td>
			<td style="width:99px;">GP-L200F</td>
			<td style="width:113px;">192</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:145px;">Pipette tips - 10 &#956;l</td>
			<td style="width:121px;">Rainin</td>
			<td style="width:99px;">GP-L10F</td>
			<td style="width:113px;">16</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:145px;">Pipette tips - 1,000 &#956;l</td>
			<td style="width:121px;">Rainin</td>
			<td style="width:99px;">GP-L1000F</td>
			<td style="width:113px;">16</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:145px;">DNA Suspension Buffer</td>
			<td style="width:121px;">Teknova</td>
			<td style="width:99px;">T0220</td>
			<td style="width:113px;">0.5 ml</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:145px;">0.1 N NaOH</td>
			<td style="width:121px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:99px;">AC12419-0010</td>
			<td style="width:113px;">0.5 ml</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:145px;">Isopropanol (HPLC grade)</td>
			<td style="width:121px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:99px;">A451</td>
			<td style="width:113px;">15 ml</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:145px;">Ethanol (200-proof)</td>
			<td style="width:121px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:99px;">459836</td>
			<td style="width:113px;">330 ml</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:145px;">Formamide (100%)</td>
			<td style="width:121px;">Thomas Scientific</td>
			<td style="width:99px;">C001K38</td>
			<td style="width:113px;">15 ml</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:145px;">EDTA (0.5 M)</td>
			<td style="width:121px;">Amresco</td>
			<td style="width:99px;">E177</td>
			<td style="width:113px;">0.2 ml</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:145px;">10 &#956;l 8-channel Pipette</td>
			<td style="width:121px;">Rainin</td>
			<td style="width:99px;">L8-10XLS</td>
			<td style="width:113px;">1</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:145px;">200 &#956;l 8-channel Pipette</td>
			<td style="width:121px;">Rainin</td>
			<td style="width:99px;">L8-200XLS</td>
			<td style="width:113px;">2</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:145px;">1,000 &#956;l Single-channel Pipette</td>
			<td style="width:121px;">Rainin</td>
			<td style="width:99px;">L-1000XLS</td>
			<td style="width:113px;">1</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:145px;">Microplate Shaker</td>
			<td style="width:121px;">VWR</td>
			<td style="width:99px;">13500-890</td>
			<td style="width:113px;">1</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:145px;">Refrigerated Microplate Centrifuge</td>
			<td style="width:121px;">VWR</td>
			<td style="width:99px;">BK369434</td>
			<td style="width:113px;">1</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:145px;">Hybridization Oven</td>
			<td style="width:121px;">Illumina</td>
			<td style="width:99px;">SE-901-1001</td>
			<td style="width:113px;">1</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:145px;">Hybex Microsample Incubator</td>
			<td style="width:121px;">SciGene</td>
			<td style="width:99px;">1057-30-0</td>
			<td align="right" style="width:113px;">1</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:145px;">Hybex MIDI Heat Block Insert</td>
			<td style="width:121px;">Illumina</td>
			<td style="width:99px;">BD-60-601</td>
			<td style="width:113px;">1</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:145px;">Heat Sealer</td>
			<td style="width:121px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:99px;">AB-0384</td>
			<td style="width:113px;">1</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:145px;">Hyb Chamber w/ Insert and Mat</td>
			<td style="width:121px;">Illumina</td>
			<td style="width:99px;">BD-60-402</td>
			<td style="width:113px;">2</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:145px;">Surgical Scissors</td>
			<td style="width:121px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:99px;">13-804-20</td>
			<td style="width:113px;">1</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:145px;">Flow Through Assembly Parts</td>
			<td style="width:121px;">Illumina</td>
			<td style="width:99px;">WG-10-202</td>
			<td style="width:113px;">8</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:145px;">Wash Rack and Dish</td>
			<td style="width:121px;">Illumina</td>
			<td style="width:99px;">BD-60-450</td>
			<td style="width:113px;">1</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:145px;">Genepaint Chamber Rack</td>
			<td style="width:121px;">Tecan</td>
			<td style="width:99px;">760-800</td>
			<td style="width:113px;">1</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:145px;">Temperature Probe</td>
			<td style="width:121px;">Illumina</td>
			<td style="width:99px;">A1-99-109</td>
			<td style="width:113px;">1</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:145px;">Staining Rack and Dish</td>
			<td style="width:121px;">Illumina</td>
			<td style="width:99px;">WG-10-207</td>
			<td style="width:113px;">1</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:145px;">Self-Closing Tweezers</td>
			<td style="width:121px;">Ted Pella, Inc</td>
			<td style="width:99px;">5374-NM</td>
			<td style="width:113px;">1</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:145px;">Vacuum Manifold</td>
			<td style="width:121px;">Ted Pella, Inc&#160;</td>
			<td style="width:99px;">2240</td>
			<td style="width:113px;">1</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:145px;">iScan or HiScan</td>
			<td style="width:121px;">Illumina</td>
			<td style="width:99px;">-</td>
			<td style="width:113px;">1</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

infinium assay for large-scale snp genotyping applications

Genotypering varianten in het menselijk genoom blijkt een efficiënte methode om genetische associaties identificeren fenotypes zijn. De verdeling van de varianten in families of populaties kan identificatie van het genetische factoren van ziekten vergemakkelijken. Panel Illumina van genotypering BeadChips kunnen onderzoekers duizenden of miljoenen single nucleotide polymorfismen (SNP&#39;s) genotype of andere genomische varianten, zoals het aantal kopieën, over een groot aantal DNA-monsters te analyseren. Deze SNPs kunnen worden verspreid over het genoom of gerichte in specifieke regio om mogelijke ontdekking maximaliseren. De Infinium test is geoptimaliseerd voor hoge kwaliteit, nauwkeurige resultaten snel opleveren. Bij juiste instelling kan een enkele technicus verwerken van enkele honderden tot meer dan duizend DNA monsters per week, afhankelijk van het type array. Deze test helpt gebruikers bij elke stap, vanaf genomisch DNA en eindigend met het scannen van de matrix. Met behulp van fatsoen Reagegen worden monsters versterkt, gefragmenteerd, neergeslagen, opnieuw gesuspendeerd, gehybridiseerd met de chip, verlengd met een enkele base, gekleurd, en gescand op ofwel een iScan of Hi Scan hoge-resolutie optische imaging systeem. Een overnight stap is nodig om het DNA te amplificeren. Het DNA wordt gedenatureerd en isotherm geamplificeerd door geheel-genoom amplificatie, daarom is er geen PCR vereist. Monsters worden gehybridiseerd met de arrays in een tweede stap nachts. Op de derde dag, de monsters zijn klaar om te worden gescand en geanalyseerd. Geamplificeerde DNA kan worden opgeslagen in grote hoeveelheden, waardoor korrelarrays elke dag van de week te verwerken, daarbij maximaal debiet.

Een goed-bewerkte kraal chip moeten helder en duidelijk rood en groen laser-licht intensiteiten weergegeven tijdens het scannen. In figuur 6, de iScan scansoftware toont deze een standaard genomische DNA-monster met succes gehybridiseerd met een aangepaste-panel SNP genotypering array. De gemerkte nucleotiden die tijdens de uitbreiding en kleuring stappen bevestigd fluoresceren onder de lampen van de twee lasers. Aangezien deze nucleotiden selectief de kraal van oligonucleotideketen gehybridiseerd met het gefragmenteerde DNA streng verlengen en de oligonucleotide ketens ontworpen te beëindigen op de plaats van de variant, kan de kleur en intensiteit van het verkregen signaal worden gebruikt om de op de allelen te bepalen SNP-plaats. Een user-generated staalkaart, die monster-ID&#39;s en klinische gegevens overeenkomen om chipID en positie, en een reeks specifieke SNP manifest, rechtstreeks van het bedrijf, zijn beide nodig om de sca importerennner output bestanden in de GenomeStudio analyse software. Voorbeeld monster bladen zijn te vinden op de website van de vennootschap. Zodra het GenomeStudio project gebouwd kan genotypen worden verkregen uit de resulterende intensiteit clusters automatisch gegenereerd door de software. Hoewel meerdere weergave opties bestaan, de standaardweergave, Norm-R (een genormaliseerde intensiteit waarde) vs Norm-Theta (een allele intensiteit ratio), is vaak de makkelijkste complot om drie verschillende clusters onderscheiden. De meeste SNPs moet een, twee of drie clusters vertonen, afhankelijk van de minor allel frequentie. De drie clusters vertegenwoordigen monsters demonstreren AA, AB of BB allelen (zie figuur 7). Deze clusters kunnen worden toegewezen genotypen hetzij door rechtstreeks importeren van een standaard template clustering positie van het bedrijf, door &quot;Cluster Alle SNPs&quot; uit de werkbalk Analyse van de software te selecteren, of door te klikken en te slepen met de gekleurde cirkels op de intensiteit percelen handmatig edi<html> t noemt. De kleur van het monster op de intensiteit perceel (rood, paars, of blauw) geeft aan de oproep (AA, AB, of BB, respectievelijk), zwarte geeft geen gesprek. Door te bladeren door de in het deelvenster volledige gegevens van de software vermeld SNPs, kan de clustering voor elke SNP worden bekeken of teruggeroepen. Zodra de clusters bevredigende gesprekken worden toegewezen, het volledige deelvenster Gegevens van de software geeft de genotypes voor elk individueel monster bij elke afzonderlijke SNP. De Kolom Kiezer optie boven de tafel kan dataformaten schakelen. Gegevens kunnen via de werkbalk Analyse of direct van de volledige gegevens tabel worden geëxporteerd voor een diepgaande analyse. <img alt="Figuur 1" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50683/50683fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50683/50683fig1.jpg" width="600px" /> Figuur 1. Overzicht - Infinium Testprotocol.683/50683fig1highres.jpg &quot;target =&quot; _blank &quot;&gt; Klik hier voor grotere afbeelding. <img alt="Figuur 2" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50683/50683fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50683/50683fig2.jpg" width="600px" /> Figuur 2. Compleet Hyb Kamer basis en mat, plus deksel. [12] <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/50683/50683fig2highres.jpg" target="_blank">Klik hier voor grotere afbeelding</a> . <img alt="Figuur 3" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50683/50683fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50683/50683fig3.jpg" width="600px" /> Figuur 3 Het laden van een BeadChip -.. Breng het monster op de inlaatpoorten [12] <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/50683/50683fig3highres.jpg" target="_blank">Klik hier voor vergroting</a><html> afbeelding. <img alt="Figuur 4" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50683/50683fig4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50683/50683fig4.jpg" width="600px" /> Figuur 4 verwijderen BeadChip Coverseal -.. Pak de afdichting op de hoek en voorzichtig afpellen diagonaal [12] <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/50683/50683fig4highres.jpg" target="_blank">Klik hier voor grotere afbeelding</a> . <img alt="Figuur 5" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50683/50683fig5highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50683/50683fig5.jpg" width="600px" /> Figuur 5. Compleet BeadChip Flow-through Assembly - De BeadChip is gescheiden van een glasplaatje met een spacer en gebonden met klemmetjes.&gt; Klik hier voor grotere afbeelding. <img alt="Figuur 6" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50683/50683fig6highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50683/50683fig6.jpg" width="600px" /> Figuur 6. Succesvolle BeadChip Scan - A) De BeadChip wordt gescand met zowel een rode en groene laser, de scanning software geeft beide tegelijk. Secties passeren intensiteit QC zal groen markeren op de BeadChip scherm naar links. Secties falende intensiteit QC zal rood markeren op de BeadChip display. B) Zodra het scannen is voltooid, zal de software overlay de rode en groene displays. Een ingezoomde afbeelding wordt getoond. De kleur en intensiteit van elke individuele kraal geeft het allel aanwezig. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/50683/50683fig6highres.jpg" target="_blank">Klik hier voor grotere afbeelding</a> . <p class="jove_content" fo:keep-together.within-page = &quot;altijd&quot;&gt; <img alt="Figuur 7" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50683/50683fig7highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50683/50683fig7.jpg" width="500px" /> Figuur 7. SNP NORM-R vs NORM-THETA Cluster Profielen - A) Een geldig SNP met drie verschillende clusters die AA, AB en BB genotypen, gekleurd rood, paars en blauw B) A SNP nodig bewerken.. De middelste cluster, die moet worden homozygote AB, is links niet-genoemd. De BB cluster wordt ten onrechte genoemd AB. C) Een slecht presterende SNP. Geen genotypen kan worden verkregen bij deze intensiteit plot, omdat er geen duidelijke clusters bestaan. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/50683/50683fig7highres.jpg" target="_blank">Klik hier voor grotere afbeelding</a> .

Watch this Scientific Journal Video about Infinium Assay for Large-scale SNP Genotyping Applications at JoVE.com

Infinium Assay for Large-scale SNP Genotyping Applications

Een protocol wordt beschreven dat Illumina Infinium assays gebruikt om grootschalige genotypering uitgevoerd. Deze testen betrouwbaar kan genotype miljoenen SNPs over honderden individuele DNA-monsters in drie dagen. Eenmaal gegenereerd, kunnen deze genotypes worden gebruikt om te controleren associaties met verschillende ziekten of fenotypes.

Infinium Assay voor grootschalige SNP genotypering Toepassingen

Genotyping variants in the human genome has proven to be an efficient method to identify genetic associations with phenotypes. The distribution of ...

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Molecular Biology

Biology

Unit 2

Genomes and Evolution

SCIENTISTS IN ACTION

Large-Scale Screens of Metagenomic Libraries

Grootschalige Schermen van Metagenomic Bibliotheken

Metagenomic libraries archive large fragments of contiguous genomic sequences from microorganisms without requiring prior cultivation.  Generating a ...

Pyrosequencing: A Simple Method for Accurate Genotyping

Pyrosequencing: een eenvoudige methode voor Nauwkeurige Genotyping

Pharmacogenetic research benefits first-hand from the abundance of information provided by the completion of the Human Genome Project. With such a ...

Batch Immunostaining for Large-Scale Protein Detection in the Whole Monkey Brain

Batch Immunokleuring Grootschalige eiwitdetectie in de Whole Brain Monkey

Immunohistochemistry (IHC) is one of the most widely used laboratory techniques for the detection of target proteins in situ. Questions concerning the ...

Isolation and Large Scale Expansion of Adult Human Endothelial Colony Forming Progenitor Cells

Isolatie en grootschalige expansie van volwassen humane endotheelcellen kolonievormende Progenitor Cellen

This paper introduces a novel recovery strategy for endothelial colony forming progenitor cells (ECFCs) from heparinized but otherwise unmanipulated adult ...

Large Scale Zebrafish-Based In vivo Small Molecule Screen

Large Scale Zebrafish-Based In vivo Small Molecule Screen

Large Scale zebravis-Based In vivo Kleine Molecule Screen

Given their small embryo size, rapid development, transparency, fecundity, and numerous molecular, morphological and physiological similarities to ...

Absolute Quantum Yield Measurement of Powder Samples

Absolute Quantum meten van de opbrengst van Powder Monsters

Measurement of fluorescence quantum yield has become an important tool in the search for new solutions in the development, evaluation, quality control and ...

A Strategy for Sensitive, Large Scale Quantitative Metabolomics

Een strategie voor de gevoelige, Large Scale Quantitative Metabolomics

Metabolite profiling has been a valuable asset in the study of metabolism in health and disease. However, current platforms have different limiting ...

qPCRTag Analysis - A High Throughput, Real Time PCR Assay for Sc2.0 Genotyping

qPCRTag Analyse - Een High Throughput, Real Time PCR test voor Sc2.0 genotypering

The Synthetic Yeast Genome Project (Sc2.0) aims to build 16 designer yeast chromosomes and combine them into a single yeast cell. To date one synthetic ...

ODELAY: A Large-scale Method for Multi-parameter Quantification of Yeast Growth

ODELAY: Een grootschalige methode voor multiparameter kwantificering van gistgroei

Growth phenotypes of microorganisms are a strong indicator of their underlying genetic fitness and can be segregated into 3 growth regimes: lag-phase, ...

A Semiautomated ChIP-Seq Procedure for Large-scale Epigenetic Studies

Een semiautomatiseerde ChIP-Seq-procedure voor grootschalige epigenetische studies

Chromatin immunoprecipitation followed by sequencing (ChIP-Seq) is a powerful and widely used approach to profile chromatin DNA associated with specific ...