Name: rapid protocol for preparation of electrocompetent escherichia coli and vibrio cholerae
Uploaded: 2013-10-08T18:30:00
Duration: 7 min 10 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Rapid Protocol for Preparation of Electrocompetent Escherichia coli and Vibrio cholerae at JoVE.com

Forfatterne er taknemmelige for deres kolleger og personale i nuværende og tidligere laboratorier, der har støttet udviklingen af ​​denne teknik. SP laboratorium er støttet af den canadiske Institute for Health Research driftstilskud MOP-84.473 og Alberta innoverer-Health Solutions (finansieret af Alberta Heritage Foundation for Medical Research Endowment Fund). DP&#39;er blev støttet af National Institutes of Health tilskud MD001091-01 og GM068855-02.

1.. Udarbejdelse af bakteriekulturer, Værktøj, og reagenser (dag 1, eftermiddag) <ol><li> Sent på eftermiddagen, pode 1-5 ml autoklaveret LB bouillon i steril (for eksempel 100 x 13 mm) borosilikatglas reagensglas med en lille alikvot af bakterier (E. coli eller V. cholerae). </li><li> Indstil de podede reagensglas i en rulle tromle huse ved 37 ° C temperatur (varmt rum, eller inkubator), drej på rullen tromlen ved høj hastighed, og inkuberes O / N. </li><li> Forbered en celle spreder i form af en &quot;hockeystav&quot; fra en glasstav ved opvarmning i midten af ​​stangen i flammen fra en bunsenbrænder indtil glasset blødgør og derefter direkte bøjningen forsigtigt med en pincet eller en tang til en vinkel på 135 ° . Varm stangen igen i midten punkt mellem enden og den første bøje og bøje det i en vinkel på 45 ° indad (i den modsatte retning af den første bøjning). </li><li> Forbered LB-agar uden antibiotika og hæld i petriskåle i udarbejdelsen afelectrocompetence protokol, og LB-agarplader indeholdende passende antibiotika (ifølge resistensmarkøren på vektoren skal elektroporeret), og opbevares ved 4 ° C. </li><li> Forbered en filtersteriliseret 2 mM CaCl2 løsning til V. cholerae eller autoklavering ddH2O for E. coli, og opbevares ved 4 ° C. </li></ol> 2. Vækst af elektrokompetente Bakterier (DAG 2 Morgen) <ol><li> Lever 100 pi O / N-bakteriekultur på hver LB-agarplade, kan frosne glycerolstamopløsninger også anvendes og leveres direkte på pladen. </li><li> Dyp hockey stick-formet celle sprederen i 100% EtOH, kortvarigt afløb og forbrænde det resterende EtOH at sterilisere det før brug og spredning. Spred 100 ul O / N bakteriekultur jævnt med den sterile glas celle sprederen og sørg for ikke at forstyrre (pause) agaroverfladen. </li><li> Inkubér pladen ved 37 ° C i 4-6 timer, eller indtil en tynd plæne af bakteriel vækst værekommer skelnes. Cellerne er mest kompetent, når aktivt voksende. </li></ol> 3. Udarbejdelse af elektrokompetente bakterieceller (dag 2, eftermiddag) <ol><li> Høste bakterierne med en steril inokulere loop at sikre ikke punkteres eller bryde overfladen af ​​agaren. En 2 mm diameter bakteriel masse er tilstrækkelig til en enkelt transformation. Typisk kræver dette skrabe overfladen af ​​den tynde plænen med pode loop to eller tre gange. Adskillige prøver (typisk mellem 4-6) kan indsamles fra den samme plade. </li><li> Resuspender den bakterielle masse i 1 ml iskold 2 mM CaCl2 (for V. cholerae) eller sterilt ddH2O (for E. coli) og blandes godt, indtil ingen klumper er synlige, holde på is. </li><li> Centrifuger hvert bakteriesuspension i 5 minutter ved 5.000 x g i en afkølet mikrocentrifuge indstillet til 4 ° C, eller i en mikrocentrifuge opbevaret i et koldt rum indstillet til 4 ° C. </li><li> Supernatanten, resuspende bakteriepelleten i det samme volumen iskold 2 mM CaCl2 eller sterilt ddH2O og gentag centrifugeringen som udført før to gange mere til i alt tre vaske. </li><li> Fjern supernatanten, resuspender og derefter løsne bakteriepelleten grundigt i 40 pi iskold 2 mM CaCl2 eller sterilt ddH2O og holde på is. </li></ol> 4.. Transformation af elektrokompetente Bakterier (dag 2, eftermiddag) <ol><li> Tilføj op til 1 pg plasmid DNA (i op til 1 gl vand eller Tris-EDTA-buffer) til 40 ul bakteriesuspension og overføre denne blanding i en pre-kølet, steril 0,2 cm hul kuvette. Koncentrationen af salt i DNA-prøven skal være lav, da det vil bidrage til buedannelse af impulsen i det næste trin. </li><li> Isæt kuvetten ind i elektroporation kammer puls kontrol modul, og elektroporere på 1,8 kV, 25 uF. Tidskonstanten bør være ~ 5.0 msek, og ingen lysbuedannelse skulle opstå. </li><li> Hurtigt genvinde cellesuspensionen ved resuspendering i 1 ml LB-bouillon og overføres til tidligere autoklaveres borosilikatglas reagensglas. </li><li> Lade cellerne inddrive ved inkubering under kulsyreholdige vækstbetingelser (i en rulle tromle) ved 37 ° C i 30 minutter uden antibiotisk selektion. </li><li> Plate bakterierne på de tidligere behandlede LB-agarplader i nærværelse af det passende selektive middel (antibiotika), og der inkuberes ved 37 ° CO / N. Hvis bakterier transformeres med en høj koncentration af oprenset vektor (0,1-1 ug supersnoet plasmid) leverer 10 ul bakteriekultur på kanten af ​​LB-agar plade og med en steril inokulere loop streak for isolerede kolonier ved hjælp af den kvadrant streak metode. Hvis ligeringsblandingen blev transformeret levere 100 pi bakteriekultur på hver agarplade og jævnt fordelt med den steriliserede glascelle sprederen. </li></ol> a Hvis tidskonstant er kort (det værelav 3,5 ms), eller pulserende fører til gnistdannelse, derefter igen udfældes DNA-prøven, vaskes med 70% EtOH to gange for at fjerne salte før tørring og opblandes i TE buffer.

<ol>
	<li>Neumann, E., Schaefer-Ridder, M., Wang, Y., Hofschneider, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+transfer+into+mouse+lyoma+cells+by+electroporation+in+high+electric+fields.">Gene transfer into mouse lyoma cells by electroporation in high electric fields.</a> EMBO J. 1 (7), 841-845 (1982).</li><li>Dower, W. J., Miller, J. F., Ragsdale, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+efficiency+transformation+of+E.+coli+by+high+voltage+electroporation.">High efficiency transformation of E. coli by high voltage electroporation.</a> Nucleic Acids Res. 16 (13), 6127-6145 (1988).</li><li>Taketo, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+transfection+of+Escherichia+coli+by+electroporation.">DNA transfection of Escherichia coli by electroporation.</a> Biochim. Biophys. Acta. 949 (3), 318-324 (1988).</li><li>Fiedler, S., Wirth, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transformation+of+bacteria+with+plasmid+DNA+by+electroporation.">Transformation of bacteria with plasmid DNA by electroporation.</a> Anal. Biochem. 170 (1), 38-44 (1988).</li><li>O'Callaghan, D., Charbit, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+efficiency+transformation+of+Salmonella+typhimurium+and+Salmonella+typhi+by+electroporation.">High efficiency transformation of Salmonella typhimurium and Salmonella typhi by electroporation.</a> Mol. Gen. Genet. 223 (1), 156-158 (1990).</li><li>Hamashima, H., Nakano, T., Tamura, S., Arai, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+transformation+of+Vibrio+parahaemolyticus,+Vibrio+alginolyticus,+and+Vibrio+cholerae+non+O-1+with+plasmid+DNA+by+electroporation.">Genetic transformation of Vibrio parahaemolyticus, Vibrio alginolyticus, and Vibrio cholerae non O-1 with plasmid DNA by electroporation.</a> Microbiol. Immunol. 34 (8), 703-708 (1990).</li><li>Grones, J., Turna, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transformation+of+microorganisms+with+the+plasmid+vector+with+the+replicon+from+pAC1+from+Acetobacter+pasteurianus.">Transformation of microorganisms with the plasmid vector with the replicon from pAC1 from Acetobacter pasteurianus.</a> Biochem. Biophys. Res. Commun. 206 (3), 942-947 (1995).</li><li>Allen, S. P., Blaschek, H. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electroporation-induced+transformation+of+intact+cells+of+Clostridium+perfringens.">Electroporation-induced transformation of intact cells of Clostridium perfringens.</a> Appl. Environ. Microbiol. 54, 2322-2324 (1988).</li><li>Belliveau, B. H., Trevors, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transformation+of+Bacillus+cereus+vegetative+cells+by+electroporation.">Transformation of Bacillus cereus vegetative cells by electroporation.</a> Appl. Environ. Microbiol. 55, 1649-1652 (1989).</li><li>Chassy, B. M., Flickinger, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transformation+of+Lactobacillus+casei+by+electroporation.">Transformation of Lactobacillus casei by electroporation.</a> FEMS Microbiol. Lett. 44, 173-177 (1987).</li><li>Dunny, G. M., Lee, L. N., LeBlanc, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+electroporation+and+cloning+vector+system+for+gram-positive+bacteria.">Improved electroporation and cloning vector system for gram-positive bacteria.</a> Appl. Environ. Microbiol. 57 (4), 1194-1201 (1991).</li><li>Micheletti, P. A., Sment, K. A., Konisky, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+a+coenzyme+M-auxotrophic+mutant+and+transformation+by+electroporation+in+Methanococcus+voltae.">Isolation of a coenzyme M-auxotrophic mutant and transformation by electroporation in Methanococcus voltae.</a> J. Bacteriol. 173 (11), 3414-3418 (1991).</li><li>Schleper, C., Kubo, K., Zillig, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+particle+SSV1+from+the+extremely+thermophilic+archaeon+Sulfolobus+is+a+virus:+demonstration+of+infectivity+and+of+transfection+with+viral+DNA.">The particle SSV1 from the extremely thermophilic archaeon Sulfolobus is a virus: demonstration of infectivity and of transfection with viral DNA.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 89 (16), 7645-7649 (1992).</li><li>Aune, T. E., Aachmann, F. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methodologies+to+increase+the+transformation+efficiencies+and+the+range+of+bacteria+that+can+be+transformed.">Methodologies to increase the transformation efficiencies and the range of bacteria that can be transformed.</a> Appl. Microbiol. Biotechnol. 85 (5), 1301-1313 (2010).</li><li>Hanahan, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studies+on+transformation+of+Escherichia+coli+with+plasmids.">Studies on transformation of Escherichia coli with plasmids.</a> J. Mol. Biol. 166, 557 (1983).</li><li>Unterweger, D., Kitaoka, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Constitutive+Type+VI+Secretion+System+Expression+Gives+Vibrio+cholerae+Intra-+and+Interspecific+Competitive+Advantages.">Constitutive Type VI Secretion System Expression Gives Vibrio cholerae Intra- and Interspecific Competitive Advantages.</a> PLoS One. 7 (10), e48320 (2012).</li></ol>

Ingen oplysninger er gældende.

Transformationseffektivitet er omfattet af en række faktorer, uanset den anvendes til fremstilling af kompetente celler metode. Analoge variabler gælder for denne metode, skal der udvises stor omhu, at når cellerne høstes fra agarpladen sådan, at de fastholdes ved konstant kold temperatur (ikke højere end 4 ° C). Den bakterielle plæne skal aktivt voksende på tidspunktet for indsamlingen; celler skal være i midten af ​​logaritmisk vækstfase. Kvaliteten af DNA (dvs. kontaminering af salte) påvirker transformationseffektivitet. Specielt, når der anvendes denne fremgangsmåde agar bør ikke brydes som agar fragmenter i kuvetten vil forårsage gnistdannelse af pulsen. De fleste problemer med denne teknik er forbundet med to spørgsmål, indsamle bakterier i løbet af ordentlig vindue af tid fra agarpladen når de er aktivt voksende. Indsamle dem for hurtigt vil give tilstrækkelige celletal og vil gøreskrabe LB agarplade frustrerende, fordi den &quot;pellicule&quot;, de danner er svært at løfte overfladen af ​​pladen. Indsamling bakterier for sent vil reducere deres kompetence dramatisk. Vinduet tid vil naturligvis variere afhængigt af tætheden af ​​inoculum udpladet på LB-agarplader. Det andet kritiske trin er at holde bakterierne kold (4 ° C) fra det øjeblik, de løftes agarpladen og resuspenderes i CaCl2 eller ddH2O indtil de udplades på LB-agar efter transformation. De mikrocentrifugerør indeholdende bakterier, kuvetter og buffer skal være præ-kølet og holdes på is på alle tidspunkter indtil bakterierne belagt. Dog kan yderligere problemer opstår, når den sterile ddH2O eller CaCl2 indeholder bundfald eller forurenet. Derfor anbefaler vi at forberede denne reagens frisk. Fejlfinding transformation lettes ved herunder kontrol når omdanne bacteria gjort kompetent ved enhver metode. En negativ kontrol, der består af en batch af ikke-transformerede kompetente bakterier udpladet på en LB-agarplade indeholdende selektionsmarkøren vil hurtigt hjælpe med at bestemme, hvorvidt antibiotikummet på pladen er effektiv. En positiv kontrol transformation med en kendt tilberedning af god kvalitet og kvantitet huser samme selektive markør som den eksperimentelle prøve plasmid vil være nyttige i at afgøre, om bakterierne er kompetent, men også om den eksperimentelle DNA transformeres var tilstrækkelig mængde eller kvalitet. Fordelene ved denne teknik er multiple, metoden kan udføres inden for samme dag, at en forandring er planlagt til. Vi har fundet, at frosne bakteriel glycerol materiel kan være belagt direkte på LB-agar uden tab i electrocompetence, vi har gjort dette i &quot;nødsituationer&quot; situationer (efter glemmer at starte natten over kultur dagen før). Selvom vi ikke kunne teste emeget stamme kendt, E. coli eller V. cholerae stamme, der kan transformeres ved elektroporation har været modtagelig for denne protokol i vores hænder. Teknikken er hurtig, effektiv og udbytter transformationseffektiviteter sammenlignelige med dem, der opnås fra forberedelse elektrokompetente bakterier anvender traditionelle metoder. Metoden fjerner kravet om høj hastighed centrifuge og tilhørende rotorer, en orbital inkubatorryster og sterile centrifugekurve (containere), og store mængder af autoklaveret buffer. Selvom Tabel over specifikke reagenser og udstyr er ganske omfattende, vil de fleste laboratorier, der udfører elektroporation har de fleste, hvis ikke alle, af disse materialer allerede er tilgængelige. Måske vigtigst af alt, kan teknikken let anvendes til at generere elektrokompetente laboratorie-specifikke stammer med mutant baggrunde hurtigt. Vi er uvidende om eventuelle begrænsninger af denne teknik som den har erstattet den traditionelle metode til fremstilling af elektrocompetent bakterier i vores laboratorier. Resultaterne af vores eksperimenter vist her blev udført med friske elektrokompetente celler produceret med den traditionelle metode, der havde været opbevaret ved -80 ° C i længere tid end 1 uge. Men frosne elektrokompetente celle lagre mister kompetence og eller levedygtighed over længere opbevaring. Vores forkortet protokol tillader fremstilling af friske elektrokompetente celler samme dag transformationen er planlagt uden bekymringer om alder af bestanden, som kan resultere i nedsat transformant udbytte. Vi har ikke forsøgt at gemme elektrokompetente celler produceret ved hjælp af den hurtige metode til brug på en anden dag, da det ikke har været nødvendigt. Selv om det ikke er vist her, effektiviteten af ​​de elektrokompetente celler fremstillet ved hjælp af vores hurtige metode er tilstrækkelig til ligeringsblandinger. De transformationer rapporteret for non-O1 V. cholerae i en nylig artikel af Unterweger et al.17 blev udført ved hjælp elektrokompetente bakterier udarbejdet af det her beskrevne (undtagen dem, der udføres ved konjugation) metode. Denne teknik giver forskerne at omdanne stammer med mutant baggrunde hurtigt og effektivt uden at skulle forberede store partier af celler. Denne hurtige udarbejdelse af elektrokompetente bakterier metode kunne tilpasses andre prokaryoter, der har vist sig at være modtagelig for elektroporation som princippet om forberedelse og elektroporation indstillinger vil være det samme som for traditionelle protokoller.

Siden sin &quot;starten i begyndelsen af 1980&#39;erne 1 er elektroporation blevet en integreret molekylær biologi teknik, sandsynligvis den mest almindelige metode, der anvendes til at omdanne / transfektion levende celler med cirkulære eller lineære nukleinsyrer. Oprindeligt udviklet til transfektion af eukaryote celler 1 blev elektroporation derefter tilpasset til transformation af E. coli 2, 3. I bakteriologi er elektroporation blive et laboratorium standard og er blevet modificeret til at transformere en lang række bakterier, herunder gramnegative Pseudomonas 4, Salmonella 5, vibrioner 6 Serratiae og shigellae 7; grampositive Clostridia 8 Bacilli 9 Lactobacilli 10 og enterokokker 11. Selv nogle Archaebacteria har vist sig egnede til transformation ved elektroporering, herunder Methanococci </em&gt; 12 og Sulfolobus arter 13. For en omfattende gennemgang henvises til Aune og Aachmann 14.. Effektivitet af transformation ved elektroporation er efter sigende 10-20 gange højere end kemisk kompetence eller varmechok 2. Men meget gerne forberede bakterier til kemisk kompetence som optimeres af Douglas Hanahan i 1980&#39;erne 15 celler skal også være parat til at blive elektrokompetente. Elektroporation er en hurtig og effektiv metode til bakteriel transformation, der kræver elektrokompetente bakterier, oprenset DNA, en puls styremodul, der leverer elektriske impulser, og et kammer, der kan rumme små engangs kuvetter, der fungerer som en elektrode. Kort fortalt er kolde, kompetente bakterier blandes med plasmid-DNA, underkastes en høj spændingsimpuls i en kuvette, resuspenderet i vækstmedier, inkuberet ved 30-37 ° C i 30-45 min og derefter udpladet på halvfast medium (næringsagar plader) med caopriate selektive antibiotikum. I modsætning til den pulserende trin fremstillingen af elektrokompetente E. coli er fortsat en multipart procedure, der traditionelt udføres i store mængder. Kort fortalt er en overnatskultur af bakterier inokuleret i en Erlenmeyer-kolbe med 100 ml til 1 liter Luria Broth (LB), dyrket til midt-logaritmisk vækstfase (OD600 på &lt;1,0) og udsat for seriel vask med steril ikke -ionisk buffer eller dobbelt-destilleret vand (Hedeselskabet 2 O) i faldende volumener ved 4 ° C. Der skal udvises stor omhu for at holde cellerne kold under hele proceduren og forebygge forurening. Dette kræver brug af autoklaveret centrifugeringstrin spande og ikke-ioniske buffere eller ddH2O, en orbital rysteinkubator, et stort volumen højhastighedstog koelecentrifuge og et sæt af rotorer. Bakterier til slut resuspenderet i et lille volumen buffer suppleret med 10% glycerol og alikvoteres i ~ volumener 40 ul, which opbevares ved -80 ° C indtil brug. Opbevaring ved lav temperatur resulterer ofte i reducerede transformationseffektiviteter grund af tab af levedygtighed over tid. Elektrokompetente bakterieceller er også tilgængelige fra en række kommercielle kilder, men kun for et begrænset antal (ofte rekombination-mangel) E. coli-stammer, der almindeligvis anvendes som værter til at udbrede en bred vifte af plasmider. Som et resultat forskere stole på in-house metoder til at forberede deres egne stammer / mutanter til transformation. En alternativ, hurtig og effektiv protokol til udarbejdelse af elektrokompetente E. coli har været i brug ved et par molekylær bakteriologiske laboratorier i nogen tid nu, og er blevet udvidet til flere Gram-negative bakterier, i vores tilfælde V. cholerae. Ophavsmanden til protokollen ikke kan identificeres som det er blevet optimeret af andre forskere over tid. Metoden præsenteres her er blevet brugt i vores laboratorerne for næsten to årtier, og det er vores mål at dele denne nyttige protokol med vores kammerater.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Name of the Equipment</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalogue number</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gene Pulser Module</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>165-2668</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gene Pulser Cuvette Chamber</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>165-2669</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electrocuvettes (0.2 cm gap)</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>165-2082</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>13 x 100 mm Pyrex Rimless Culture Tubes</td>
			<td>Corning</td>
			<td>70820-13</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>13 mm Culture Tube Closures</td>
			<td>Cole Parmer</td>
			<td>EW-04500-00</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6 x 250 mm Glass Rod</td>
			<td>Lab Source</td>
			<td>11381D</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable Petri Dishes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>08-757-12</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Roller Drum Motor Assembly</td>
			<td>New Brunswick Scientific</td>
			<td>M1053-4004</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Roller Drum for 13 x 100 mm Culture Tubes</td>
			<td>New Brunswick Scientific</td>
			<td>M1053-0306</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride</td>
			<td>Sigma Chemicals</td>
			<td>C5670</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol, anhydrous/denatured</td>
			<td>Sigma Chemicals</td>
			<td>227649</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inoculating Loop</td>
			<td>Decon Labs</td>
			<td>MP182-5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Refrigerated Microcentrifuge 5451 R</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>22621425</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bunsen Burner</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>03-917Q</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB Broth MILLER</td>
			<td>EMD</td>
			<td>1.10285.0500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacteriological Agar</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S25127</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

rapid protocol for preparation of electrocompetent escherichia coli and vibrio cholerae

Elektroporation er blevet en meget anvendt fremgangsmåde til hurtigt og effektivt at indføre fremmed DNA i en lang række celler. Elektrotransformation er blevet den foretrukne metode til indføring af DNA i prokaryoter, der ikke er naturligt kompetent. Elektroporation er en hurtig, effektiv og strømlinet transformation metode, som foruden oprenset DNA og kompetente bakterier kræver kommercielt tilgængelige gen puls controller og kuvetter. I modsætning til det pulserende trin, udarbejdelse af elektrokompetente celler er tidskrævende og arbejdskrævende involverer gentagne runder af centrifugering og vasker i faldende mængder af sterile, koldt vand, eller ikke-ioniske buffere af store mængder af dyrket til midt-logaritmisk fase af vækst. Tid og kræfter kan spares ved at købe elektrokompetente celler fra kommercielle kilder, men valget er begrænset til almindeligt anvendte E. coli laboratoriestammer. Vi er hermed formidle en hurtig ogeffektiv metode til fremstilling af elektrokompetente E. coli, som har været i brug af bakteriologiske laboratorier i nogen tid, kan tilpasses til V. cholerae og andre prokaryoter. Selvom vi ikke kan konstatere, hvem til kredit for at udvikle den oprindelige teknik, er vi hermed gøre den tilgængelig for det videnskabelige samfund.

Vi har gennemført en række transformationer med E. coli og V. cholerae at sammenligne transformation effektiviteten af vores hurtige metode med en tilpasning af de (traditionelle) metode oprindeligt beskrevet af Dower et al. 2 til fremstilling af elektrokompetente bakterier. For at udføre den traditionelle fremstilling af kompetente celler blev 500 ml LB i en 2 L-Erlenmeyerkolbe podes med 500 ul overnatskultur af E. coli DH5a eller V. cholerae O395, inkuberet i en orbital rysteapparat (215 rpm ved 37 ° C) og høstet ved OD600 på mellem 0,5-1,0. Kolben blev afkølet på is, og kulturerne centrifugeret i en forafkølet rotor ved 4.000 xg i 10 minutter ved 4 ° C. Cellepellets blev grundigt resuspenderet i 500 ml iskold 2 mM CaCl2 til V. cholerae og ddH2O for E. coli, og centrifugeres igen under de samme betingelser. Efterfølgende runder af resuspension end centrifugering blev udført i faldende mængder af mellem 200 og 100 ml volumener og sørg for kultur forblev afkølet ved 4 ° C. Endelig blev en resuspension og centrifugering i et 10 ml volumen udført med 10% glycerol. Den endelige pellet blev resuspenderet i 2 ml 10% glycerol og 40 gl portioner blev frosset ved -80 ° C og opbevares ikke længere end en uge før elektroporering. Elektroporation betingelser, herunder puls indstillinger og kuvette størrelse var identisk for de to bakteriearter i alle elektroporeringer uanset metode til fremstilling af kompetente celler. Den eneste forskel var, at vi udførte de vasker i koldt ddH2O for E. coli og kold 2 mM CaCl2 til V. cholerae. Tabel 1 viser resultaterne af bakterier transformeret ved elektroporation identisk, men gjort kompetent enten med den hurtige protokol eller med den traditionelle metode. Vi ansat stammen O395 og DH5a så almindeligtly anvendte repræsentative stammer af V. cholerae og E. coli henholdsvis kan lignende resultater opnås med andre stammer af samme art (omend ikke hver enkelt stamme er blevet testet) og sandsynligvis tilpasses til andre Gram-negative bakterier og sandsynligvis ud. For at sikre, at celle numre lige var til stede i hver batch pulserede blev elektrokompetente bakterier genereret udnytte den hurtige metode sammenlægges ved indsamling, blandet, holdes homogent suspenderet, og alikvoteres i mængder 40 ul kort før elektroporation. Elektrokompetente bakterier genereret udnytte den traditionelle metode blev behandlet på samme måde inden frysning i 40 gl portioner. Efter levering af pulsen, blev hver batch af 40 ul elektroporerede bakterier suspenderet i 400 ul LB og seriefortyndes 1:10. Ét hundrede mikroliter af hver fortynding blev udpladet på LB-agar i nærvær af 100 ug / ml ampicillin og spredes ved hjælp af en steril glascelle sprederenog inkuberet ved 37 ° C natten over. For at kvantificere det totale antal af bakterier, der anvendes i hver transformation blev mængder af elektrokompetente bakterier af hver forberedt parti 40 pi serielt fortyndet og udpladet på LB-agar uden antibiotika identisk parallelt. En portion af lige så behandlede bakterier fra hvert parti blev elektroporeret med 1 gl Tris-EDTA (TE)-buffer, men uden DNA (mock transformation), serielt fortyndet og udpladet på LB-agar uden antibiotika til at estimere antallet af celler tabt ved levering af elektrisk puls. Endelig blev en ekstra variation forsøget udføres for at afgøre, om 30 min inkubationer ved 37 ° C i 1 ml LB efter elektroporation men før udpladning på LB-agar vil påvirke inddrivelsen af ​​transformerede celler. kolonidannende enheder (CFU&#39;er) blev optalt den følgende dag. Til dette forsøg anvendte vi pUC18, en almindelig laboratorie-plasmid, og partier af kompetente bakterier består af etpproximately 10 8 CFU for celler fremstillet ved anvendelse af den traditionelle metode, og 10 7 CFU&#39;er for celler fremstilles ved anvendelse af den hurtige protokol. Elektroporation alene (uden DNA) reducerede levedygtige CFU&#39;er med 10-100 fold, uanset hvilken metode der anvendes til at fremstille de elektrokompetente celler. Som vist i tabel 1, transformant udbytte var inden for 10 6 -10 7 CFU&#39;er / ug DNA område i tredobbelte eksperimenter (standardafvigelser i parentes) for E. coli (DH5a) og V. cholerae (O395) henholdsvis ved hjælp af den traditionelle, længerevarende metode til elektrokompetente forberedelse celle. Transformant udbytte optrådte faldt 10 gange 10 5 -10 6 CFU / ug DNA i tredobbelte eksperimenter (standardafvigelse i parentes) for E. coli og V. cholerae henholdsvis ved hjælp af den hurtige metode. Af denne grund har vi fastsatte den procentdel af transformerede bakterier ved at dividere transformerede CFUmed antallet af CFU genvundet fra &quot;mock transformationer&quot; (uden plasmid) fra ellers identiske partier af kompetente celler. Procentdelen af transformerede bakterier var inden for en log (2,5-9,4%), uanset metoden til forberedelse og arter forvandlet (tabel 1 parentes tal). Disse resultater tyder på, at effektiviteten af den hurtige metode er sammenlignelig med den traditionelle længerevarende fremgangsmåde til fremstilling af kompetente celler, og at de repræsentative stammer af Vibrio cholerae og Escherichia coli er lige egnede til den hurtige procedure. Vi fandt, at transformation effektivitet, for plasmider som pUC18 huser β-lactamase kassetter, er ikke påvirket af den 30 min restitutionstid i LB bouillon. Det samme antal transformanter blev udvundet om cellerne blev udpladet på LB-agar i nærvær af ampicillin direkte efter elektroporation eller om de blev tilladt en 30-45 min restitutionstidi LB-bouillon ved 37 ° C før udpladning. Vore fund, ampicillin-resistens ikke kræver udvækst under selektive betingelser tyder på, at β-lactamase-ekspression sker tilstrækkeligt hurtigt efter transformation. Dog skal det bemærkes, at vi udført seriefortyndinger af pulserende bakterier i LB bouillon, hvilket kan have bidraget til nyttiggørelse fra det elektriske stød og igangsætte genekspression. <img alt="Figur 1" src="/files/ftp_upload/50684/50684fig1.jpg" /> Figur 1. Grafisk afbildning af den metode til hurtig fremstilling af elektrokompetente bakterier. Efter 4-6 timer (afhængigt af tætheden af inokula) et tilstrækkeligt antal bakterier kan indsamles til at udføre 4-6 omdannelser fra en enkelt LB-agarplade. For at sikre lige antal kompetente celler for hvert endelige volumen skal elektroporeres blev bakterier indsamlet fra LB-agar plade oprindeligt samles og vaskes sammen, så aliquoted i 40 gl volumener afhængig af størrelsen af ​​pellet (større pellets blev fortyndet i større mængder delelige med 40 pi). <table border="1"><tbody><tr><td colspan="3"> Antal Ampicillin-resistente transformanter / ug DNA (Ampicillin-resistente transformanter udvindes [%]) </td></tr><tr><td> Strain </td><td> Traditionelle metode </td><td> Hurtig metode </td></tr><tr><td> E. coli (DH5a) </td><td> 2,3 x 10 6 (± 7,3 x 10 5) [9,4%] </td><td> 3 x 10 6 (± 7,1 x 10 5) [2,5%] </td></tr><tr><td> V. cholerae (O395) </td><td> 4 x 10 7 (± 1,7 x 10 7) [5%] </td><td> 6,7 x 10 5 (± 2,1 x 10 5) [3,3%] </td></tr></tbody></table> Tabel 1. Transformation effektivitet per mikrogram DNA (pUC18) af elektrokompetente bacteria fremstillet ved den traditionelle metode i forhold til den hurtige metode. Alle transformationer blev udført med 500 ng pUC18 DNA (~ 80% supersnoet DNA som visualiseret ved 1% agarosegel-elektroforese), og de elektroporerede celler blev serielt fortyndet 10-fold i LB-medium før udpladning for CFU på LB-agar med antibiotika. Kontrollen af ​​ikke-elektroporerede bakterier og bakterier elektroporerede uden plasmid, serielt fortyndet og udpladet på LB-agar uden antibiotika blev udført for hvert sæt af transformationer at bestemme det samlede antal af levedygtige bakterier forud for og efter pulsering. De elektroporerede kontroller repræsenterede basislinien for procent af levedygtige bakterier med succes forvandlet.

Watch this Scientific Journal Video about Rapid Protocol for Preparation of Electrocompetent Escherichia coli and Vibrio cholerae at JoVE.com

Rapid Protocol for Preparation of Electrocompetent Escherichia coli and Vibrio cholerae

Hurtig Protokol for Udarbejdelse af elektrokompetente<em&gt; Escherichia coli</em&gt; Og<em&gt; Vibrio cholerae</em

Elektroporation er en almindeligt anvendt fremgangsmåde til indføring af DNA i bakterier i en proces kendt som transformation. Traditionelle protokoller til fremstilling af elektrokompetente celler er tidskrævende og arbejdskrævende. Denne artikel beskriver en alternativ, hurtig og effektiv metode til fremstilling af elektrokompetente celler i øjeblikket ansat af nogle laboratorier.

Electroporation has become a widely used method for rapidly and efficiently introducing foreign DNA into a wide range of cells. Electrotransformation has ...

Research

JoVE Journal

Biology

Rapid Protocol for Preparation of Electrocompetent Escherichia coli and Vibrio cholerae

Vibrio cholerae: Model Organism to Study Bacterial Pathogenesis - Interview

An Assay for Measuring the Activity of Escherichia coli Inducible Lysine Decarboxyase

An Assay for Measuring the Activity of Escherichia coli Inducible Lysine Decarboxyase

Escherichia coli is an enteric bacterium that is capable of growing over a wide range of pH values (pH 5 - 9)1 and, incredibly, is able to survive extreme ...

High Throughput Screening of Fungal Endoglucanase Activity in Escherichia coli

High Throughput Screening of Fungal Endoglucanase Activity in Escherichia coli

Cellulase enzymes (endoglucanases, cellobiohydrolases, and &beta;-glucosidases) hydrolyze cellulose into component sugars, which in turn can be converted ...

Mapping Bacterial Functional Networks and Pathways in Escherichia Coli using Synthetic Genetic Arrays

Mapping Bacterial Functional Networks and Pathways in Escherichia Coli using Synthetic Genetic Arrays

Kortlægning Bakterielle Funktionelle Networks og spredningsveje i<em&gt; Escherichia Coli</em&gt; Hjælp Syntetiske Genetiske Arrays

Phenotypes  are determined by a complex series of physical (e.g. protein-protein) and  functional (e.g. gene-gene or genetic) interactions (GI)1. While ...

Protocols for Implementing an Escherichia coli Based TX-TL Cell-Free Expression System for Synthetic Biology

Protocols for Implementing an Escherichia coli Based TX-TL Cell-Free Expression System for Synthetic Biology

Protokollerne til gennemførelse af en<em&gt; Escherichia coli</em&gt; Baseret TX-TL Cell-Free Expression System for syntetisk biologi

Ideal cell-free expression systems can theoretically emulate an in vivo cellular environment in a controlled in vitro platform.1 This is useful for ...

Detection of Live Escherichia coli O157:H7 Cells by PMA-qPCR

Detection of Live Escherichia coli O157:H7 Cells by PMA-qPCR

Detection Live<em&gt; Escherichia coli</em&gt; O157: H7 celler ved PMA-qPCR

A unique open reading frame (ORF) Z3276 was identified as a specific genetic marker for E. coli O157:H7. A qPCR assay was developed for detection of E. ...

Optimized Protocol for Retinal Wholemount Preparation for Imaging and Immunohistochemistry

Working with delicate tissue can be a complicating factor when performing immunohistochemical assessment. Here, we present a method that utilizes a ...

Non-chromatographic Purification of Recombinant Elastin-like Polypeptides and their Fusions with Peptides and Proteins from Escherichia coli

Non-chromatographic Purification of Recombinant Elastin-like Polypeptides and their Fusions with Peptides and Proteins from Escherichia coli

Ikke-kromatografisk oprensning af rekombinant elastin-lignende polypeptider og deres fusioner med peptider og proteiner fra<em&gt; Escherichia coli</em

Elastin-like polypeptides are repetitive biopolymers that exhibit a lower critical solution temperature phase transition behavior, existing as soluble ...

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

Grønt fluorescerende protein-baserede Expression Screening membranproteiner i<em&gt; Escherichia coli</em

The production of recombinant membrane proteins for structural and functional studies remains technically challenging due to low levels of expression and ...

The Multifaceted Benefits of Protein Co-expression in Escherichia coli

The Multifaceted Benefits of Protein Co-expression in Escherichia coli

Den mangesidede Fordele ved Protein Co-ekspression i<em&gt; Escherichia coli</em

We report here that the expression of protein complexes in vivo in Escherichia coli can be more convenient than traditional reconstitution experiments in ...