Name: rapid protocol for preparation of electrocompetent escherichia coli and vibrio cholerae
Uploaded: 2013-10-08T18:30:00
Duration: 7 min 10 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Rapid Protocol for Preparation of Electrocompetent Escherichia coli and Vibrio cholerae at JoVE.com

De auteurs zijn dankbaar voor hun collega&#39;s en medewerkers van heden en verleden laboratoria die de ontwikkeling van deze techniek hebben gesteund. SP het laboratorium wordt ondersteund door het Canadese Institute for Health Research exploitatiesubsidie ​​MOP-84473 en Alberta Vernieuwt-Health Solutions (gefinancierd door de Alberta Heritage Foundation voor Medisch Onderzoek Endowment Fund). DP werd ondersteund door National Institutes of Health verleent MD001091-01 en GM068855-02.

1. Voorbereiding van de bacterieculturen, Tools en reagentia (DAG 1, Middag) <ol><li> In de late namiddag, te enten 1-5 ml geautoclaveerd LB-bouillon in steriele (bijvoorbeeld 100 x 13 mm) borosilicaatglas reageerbuizen met een kleine hoeveelheid van bacteriën (E. coli of V. cholerae). </li><li> Stel de geënte reageerbuizen in een roller trommel ondergebracht bij 37 ° C temperatuur (warme kamer of incubator), zet de rol trommel op hoge snelheid, en incubeer O / N. </li><li> Bereid een cel spreader in de vorm van een &quot;hockeystick&quot; van een glazen staaf door verhitting van het midden van de stang in de vlam van een bunsenbrander tot het glas verzacht en direct daarna de bocht voorzichtig met een pincet of een tang in een hoek van 135 ° . Verwarm de stang opnieuw in het middelpunt tussen het einde en de eerste bocht en buigen bij een 45 ° hoek naar binnen (in tegengestelde richting van de eerste bocht). </li><li> Bereid LB-agar zonder antibiotica en giet het in petrischaaltjes ter voorbereiding van deelectrocompetence protocol en LB-agarplaten die het geschikte antibioticum (volgens de resistentiemerker de vector worden geëlektroporeerd) en bewaar bij 4 ° C. </li><li> Bereid een filter gesteriliseerd 2 mM CaCl2 oplossing V. cholerae, of autoclaaf DDH 2 O voor E. coli en bewaar bij 4 ° C. </li></ol> 2. Groei van Elektrocompetente Bacteriën (DAG 2, Ochtend) <ol><li> Lever 100 ul van de O / N bacteriecultuur op elke LB-agar plaat, kan bevroren glycerol voorraden ook worden gebruikt en rechtstreeks afgeleverd op de plaat. </li><li> Dompel de hockeystick-vormige cel spreader in 100% EtOH, kort uitlekken en branden uit de resterende EtOH te steriliseren voor gebruik en verspreiding. Spreid de 100 ul O / N bacteriecultuur gelijkmatig met de steriele glazen cel spreader maken (break) de agar oppervlak zeker niet te verstoren. </li><li> Incubeer de platen bij 37 ° C gedurende 4-6 uur, of totdat een dunne grasveld van bacteriële groeikomt te onderscheiden. Cellen zijn meest competente als actief groeiende. </li></ol> 3. Voorbereiding van Elektrocompetente bacteriële cellen (DAG 2, Middag) <ol><li> Oogst de bacteriën met een steriele entnaald zorg ervoor niet te doorboren of breken het oppervlak van de agar. Een 2 mm bacteriële massa voldoende voor een transformatie. Typisch vereist dit schrapen het oppervlak van de dunne gazon met de entnaald twee of drie keer. Verschillende monsters (meestal tussen 4-6) kan worden verzameld uit dezelfde plaat. </li><li> Resuspendeer de bacteriële massa in 1 ml ijskoude 2 mM CaCl2 (voor V. cholerae) of steriele DDH 2 O (E. coli) en meng goed tot er geen klonten zichtbaar, houdt op ijs. </li><li> Centrifugeer elke bacteriesuspensie gedurende 5 min bij 5000 xg in een gekoelde microcentrifuge ingesteld op 4 ° C, of ​​in een microcentrifuge opgeslagen in een koude ruimte ingesteld op 4 ° C. </li><li> Verwijder het supernatant, resusphet einde van de bacteriële pellet in hetzelfde volume ijskoude 2 mM CaCl2 of steriele DDH 2 O, en herhaal de centrifugatiestap zoals voorheen twee keer meer voor een totaal van drie wasbeurten. </li><li> Verwijder supernatant, resuspendeer, en draai vervolgens de bacteriepellet grondig in 40 ul ijskoud 2 mM CaCl2 of steriele DDH 2 O en blijf op ijs. </li></ol> 4. Transformatie van Elektrocompetente Bacteriën (DAG 2, Middag) <ol><li> Voeg tot 1 ug plasmide-DNA (bij maximaal 1 ul water of Tris-EDTA-buffer) aan de 40 gl bacteriesuspensie en breng dit mengsel in een vooraf gekoelde, steriele 0,2 cm spleet cuvet. De zoutconcentratie in het DNA monster vanaf een, omdat het zal bijdragen tot boogvorming van de puls in de volgende stap. </li><li> Plaats de cuvet in de elektroporatie kamer van de puls controle module, en electroporate op 1,8 kV, 25 uF. De tijdconstante mag ~ 5,0 msec te zijn, en geen vonken moet plaatsvinden. </li><li> Snel te herstellen van de celsuspensie door resuspenderen in 1 ml LB-bouillon en breng aan eerdere, geautoclaveerd borosilicaatglas reageerbuis. </li><li> Laat de cellen te herstellen door het incuberen onder beluchte groeiomstandigheden (in een rol trommel) bij 37 ° C gedurende 30 min zonder antibioticumselectie. </li><li> Plate de bacteriën op de eerder bereide LB-agarplaten in aanwezigheid van het geschikte selectiemiddel (antibioticum) en incubeer bij 37 ° CO / N. Als bacteriën getransformeerd met een hoge concentratie van gezuiverde vector (0,1-1 ug plasmide), levert 10 gl bacteriecultuur op de rand van de LB agar plaat en met een steriele entnaald strook voor geïsoleerde kolonies met het kwadrant streak methode. Als een ligatiemengsel werd getransformeerd leveren 100 ui bacteriecultuur op elke agarplaat en gelijkmatig verdeeld met het gesteriliseerde glazen cel spreader. </li></ol> a Als de tijd constant is kort (belaag 3,5 msec), of pulserende leidt tot vonken, vervolgens opnieuw neerslaan van het DNA-monster, was met 70% EtOH tweemaal om zouten te verwijderen voor het drogen en resuspenderen in TE buffer.

<ol>
	<li>Neumann, E., Schaefer-Ridder, M., Wang, Y., Hofschneider, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+transfer+into+mouse+lyoma+cells+by+electroporation+in+high+electric+fields.">Gene transfer into mouse lyoma cells by electroporation in high electric fields.</a> EMBO J. 1 (7), 841-845 (1982).</li><li>Dower, W. J., Miller, J. F., Ragsdale, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+efficiency+transformation+of+E.+coli+by+high+voltage+electroporation.">High efficiency transformation of E. coli by high voltage electroporation.</a> Nucleic Acids Res. 16 (13), 6127-6145 (1988).</li><li>Taketo, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+transfection+of+Escherichia+coli+by+electroporation.">DNA transfection of Escherichia coli by electroporation.</a> Biochim. Biophys. Acta. 949 (3), 318-324 (1988).</li><li>Fiedler, S., Wirth, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transformation+of+bacteria+with+plasmid+DNA+by+electroporation.">Transformation of bacteria with plasmid DNA by electroporation.</a> Anal. Biochem. 170 (1), 38-44 (1988).</li><li>O'Callaghan, D., Charbit, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+efficiency+transformation+of+Salmonella+typhimurium+and+Salmonella+typhi+by+electroporation.">High efficiency transformation of Salmonella typhimurium and Salmonella typhi by electroporation.</a> Mol. Gen. Genet. 223 (1), 156-158 (1990).</li><li>Hamashima, H., Nakano, T., Tamura, S., Arai, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+transformation+of+Vibrio+parahaemolyticus,+Vibrio+alginolyticus,+and+Vibrio+cholerae+non+O-1+with+plasmid+DNA+by+electroporation.">Genetic transformation of Vibrio parahaemolyticus, Vibrio alginolyticus, and Vibrio cholerae non O-1 with plasmid DNA by electroporation.</a> Microbiol. Immunol. 34 (8), 703-708 (1990).</li><li>Grones, J., Turna, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transformation+of+microorganisms+with+the+plasmid+vector+with+the+replicon+from+pAC1+from+Acetobacter+pasteurianus.">Transformation of microorganisms with the plasmid vector with the replicon from pAC1 from Acetobacter pasteurianus.</a> Biochem. Biophys. Res. Commun. 206 (3), 942-947 (1995).</li><li>Allen, S. P., Blaschek, H. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electroporation-induced+transformation+of+intact+cells+of+Clostridium+perfringens.">Electroporation-induced transformation of intact cells of Clostridium perfringens.</a> Appl. Environ. Microbiol. 54, 2322-2324 (1988).</li><li>Belliveau, B. H., Trevors, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transformation+of+Bacillus+cereus+vegetative+cells+by+electroporation.">Transformation of Bacillus cereus vegetative cells by electroporation.</a> Appl. Environ. Microbiol. 55, 1649-1652 (1989).</li><li>Chassy, B. M., Flickinger, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transformation+of+Lactobacillus+casei+by+electroporation.">Transformation of Lactobacillus casei by electroporation.</a> FEMS Microbiol. Lett. 44, 173-177 (1987).</li><li>Dunny, G. M., Lee, L. N., LeBlanc, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+electroporation+and+cloning+vector+system+for+gram-positive+bacteria.">Improved electroporation and cloning vector system for gram-positive bacteria.</a> Appl. Environ. Microbiol. 57 (4), 1194-1201 (1991).</li><li>Micheletti, P. A., Sment, K. A., Konisky, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+a+coenzyme+M-auxotrophic+mutant+and+transformation+by+electroporation+in+Methanococcus+voltae.">Isolation of a coenzyme M-auxotrophic mutant and transformation by electroporation in Methanococcus voltae.</a> J. Bacteriol. 173 (11), 3414-3418 (1991).</li><li>Schleper, C., Kubo, K., Zillig, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+particle+SSV1+from+the+extremely+thermophilic+archaeon+Sulfolobus+is+a+virus:+demonstration+of+infectivity+and+of+transfection+with+viral+DNA.">The particle SSV1 from the extremely thermophilic archaeon Sulfolobus is a virus: demonstration of infectivity and of transfection with viral DNA.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 89 (16), 7645-7649 (1992).</li><li>Aune, T. E., Aachmann, F. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methodologies+to+increase+the+transformation+efficiencies+and+the+range+of+bacteria+that+can+be+transformed.">Methodologies to increase the transformation efficiencies and the range of bacteria that can be transformed.</a> Appl. Microbiol. Biotechnol. 85 (5), 1301-1313 (2010).</li><li>Hanahan, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studies+on+transformation+of+Escherichia+coli+with+plasmids.">Studies on transformation of Escherichia coli with plasmids.</a> J. Mol. Biol. 166, 557 (1983).</li><li>Unterweger, D., Kitaoka, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Constitutive+Type+VI+Secretion+System+Expression+Gives+Vibrio+cholerae+Intra-+and+Interspecific+Competitive+Advantages.">Constitutive Type VI Secretion System Expression Gives Vibrio cholerae Intra- and Interspecific Competitive Advantages.</a> PLoS One. 7 (10), e48320 (2012).</li></ol>

Geen toelichtingen zijn van toepassing.

Transformatie efficiëntie is onderworpen aan een verscheidenheid van factoren, ongeacht de methode toegepast om competente cellen te bereiden. Analoog variabelen gelden voor deze methode, moet grote zorg worden dat zodra de cellen geoogst uit de agarplaat zodat zij gehandhaafd op een constante lage temperatuur (niet hoger dan 4 ° C). De bacteriële gazon moeten actief worden groeien op het moment van de collectie; cellen moet in midden-logaritmische groeifase. Kwaliteit van DNA (bijvoorbeeld verontreiniging van zouten) beïnvloedt transformatie-efficiëntie. Bijzonder bij toepassing van deze methode, de agar niet worden uitgesplitst agar fragmenten in de cuvette wordt boogvorming van de puls veroorzaken. De meeste problemen ondervonden met deze techniek worden geassocieerd met twee problemen, het verzamelen van de bacteriën tijdens het juiste venster van de tijd van de agar plaat wanneer ze actief groeien. Het verzamelen van hen te vroeg zal onvoldoende aantal cellen opleveren en zal maken deafschrapen van de LB agar plaat frustrerend omdat de &quot;pellicule&quot; vormen ze moeilijk te heffen van het oppervlak van de plaat. Het verzamelen van bacteriën te laat zal hun bevoegdheid drastisch verminderen. Het venster van de tijd zal uiteraard variëren afhankelijk van de dichtheid van het inoculum uitgeplaat op LB agarplaten. De tweede kritische stap is om de bacteriën koud (4 ° C) houden van het moment dat ze gelicht agarplaat en geresuspendeerd in CaCl2 of DDH 2 O tot ze uitgeplaat op LB agar volgende transformatie. De microfugebuizen met de bacteriën, cuvetten en buffer moet pre-gekoeld en bewaard op ijs te allen tijde tot de bacteriën worden verzilverd. Echter, kunnen extra problemen ontstaan ​​wanneer de steriele DDH 2 O of CaCl2 bevatten neerslag of verontreinigd zijn. Om deze reden adviseren wij om dit reagens vers bereiden. Problemen transformatie wordt vergemakkelijkt door inbegrip van de controles bij het transformeren bacteria bevoegde diensten die door een methode. Een negatieve controle bestaande uit een partij van niet-getransformeerde bevoegde bacteriën uitgeplaat op een LB agar plaat met de selectieve merker zal snel te bepalen of het antibioticum op de plaat effectief. Een positieve controle transformatie met een bekende plasmide voorbereiding van goede kwaliteit en kwantiteit die het op dezelfde selectieve merker als de experimentele monster zal nuttig zijn bij het bepalen of de bacteriën zijn bekwaam, maar ook of de experimentele DNA getransformeerd was voldoende in hoeveelheid of kwaliteit. De voordelen van deze techniek zijn meerdere, de methode kan binnen dezelfde dag dat een transformatie is gepland voor worden uitgevoerd. Wij hebben geconstateerd dat ingevroren bacteriële glycerol voorraad direct kunnen worden verzilverd op de LB-agar zonder enig verlies in electrocompetence, we hebben dit gedaan in &quot;noodgevallen&quot; situaties (na het vergeten om de overnacht cultuur van de dag voor de start). Hoewel we niet konden testen ezeer stam bekend, E. coli of V. cholerae stam die kan worden getransformeerd door elektroporatie is vatbaar voor dit protocol is in onze handen. De techniek is snel, efficiënt, en de opbrengsten transformatie efficiëntie die vergelijkbaar zijn met die verkregen uit het voorbereiden elektrocompetente bacteriën gebruik van traditionele methoden. De methode elimineert de behoefte aan een hoge snelheid centrifuge en bijbehorende rotoren, een orbitale incubator shaker en steriele centrifuge emmers (containers), en grote hoeveelheden geautoclaveerd buffer. Hoewel de Tabel van specifieke reagentia en apparatuur is vrij uitgebreid, zullen de meeste laboratoria die elektroporatie uit te voeren de meeste, zo niet alle, van deze materialen al beschikbaar. Misschien wel het allerbelangrijkste, kan de techniek gemakkelijk worden toegepast op elektrocompetente laboratorium-specifieke stammen met mutant achtergronden snel genereren. Wij zijn niet op de hoogte van eventuele beperkingen van deze techniek omdat het de traditionele bereidingswijze van elec heeft vervangentrocompetent bacteriën in onze laboratoria. De resultaten van onze experimenten hier werden uitgevoerd met verse elektrocompetente cellen geproduceerd met traditionele methode die waren bewaard bij -80 ° C gedurende niet langer dan 1 week. Echter, bevroren elektrocompetente cel voorraden verliezen competentie en levensvatbaarheid of gedurende langere perioden van opslag. Onze verkorte protocol maakt de bereiding van verse elektrocompetente cellen dezelfde dag de transformatie is gepland, zonder zorgen over de leeftijd van de voorraad, die kan leiden tot verminderde transformant opbrengst. We hebben niet getracht opslaan elektrocompetente cellen geproduceerd volgens snelle methode voor gebruik op een andere dag als dit niet noodzakelijk is. Hoewel hier niet getoond, de efficiëntie van de elektrocompetente cellen bereid in onze snelle werkwijze is voldoende voor ligatie mengsels. De transformaties gerapporteerd voor niet-O1 V. cholerae in een recent artikel van Unterweger et al..17 werden uitgevoerd met elektrocompetente bacteriën bereid volgens de hier beschreven (behalve die welke door conjugatie uitgevoerd) methode. Deze techniek biedt onderzoekers stammen met mutant achtergronden snel en effectief te transformeren zonder grote celbatches bereiden. Deze snelle bereiding van elektrocompetente bacteriën werkwijze kan worden aangepast aan andere prokaryoten die zijn aangetoond vatbaar voor elektroporatie als het principe van de voorbereiding en de elektroporatie instellingen naar dezelfde als die van de traditionele protocollen zijn.

Sinds de &#39;oprichting in de vroege jaren 1980 1, is elektroporatie uitgegroeid tot een integraal moleculaire biologie techniek, waarschijnlijk de meest voorkomende methode gebruikt om / transfecteren levende cellen te transformeren met circulair of lineair nucleïnezuren. Oorspronkelijk ontwikkeld voor transfectie van eukaryote cellen 1, elektroporatie werd vervolgens aangepast voor transformatie van E. coli 2, 3. In bacteriologie, is elektroporatie uitgegroeid tot de laboratorium standaard en is aangepast aan een breed scala van bacteriën, waaronder Gram-negatieve Pseudomonas 4, Salmonella 5, Vibrios 6, Serratiae en Shigellae 7 transformeren, Gram-positieve Clostridia 8, Bacilli 9, Lactobacilli 10 en enterokokken 11. Zelfs sommige Archaebacteria zijn vatbaar voor transformatie bewezen door elektroporatie, waaronder Methanococci </em&gt; 12 en Sulfolobus soorten 13. Voor een uitgebreid overzicht verwijzen wij u naar Aune en Aachmann 14. Efficiëntie van transformatie door elektroporatie is naar verluidt 10-20 maal hoger dan chemische competentie of heat shock 2. Echter, net als voorbereiding bacteriën chemische bevoegdheid geoptimaliseerd door Douglas Hanahan in 1980 15 cellen moeten ook bereid worden elektrocompetente zijn. Elektroporatie is een snelle en effectieve bacteriële transformatie, waarbij elektrocompetente bacteriën, gezuiverd DNA, een puls regeleenheid de elektrische impuls levert, en een kamer die klein wegwerpcuvetten die fungeren als elektrode biedt. In het kort worden koude, competent bacteriën gemengd met plasmide DNA onderworpen aan een hoge spanningspuls in een cuvet, geresuspendeerd in kweekmedium geïncubeerd bij 30-37 ° C gedurende 30-45 min, en vervolgens uitgeplaat op halfvast medium (voedingsagar platen) met ca.opriate selectieve antibioticum. In tegenstelling tot de pulserende stap de bereiding van elektrocompetente E. coli blijft een multipart procedure, die gewoonlijk in grote volumes wordt uitgevoerd. Kort samengevat wordt een overnacht kweek van bacteriën geënt in een erlenmeyer van 100 ml tot 1 liter Luria Broth (LB), gekweekt tot mid-logaritmische groeifase (OD600 van &lt;1.0), en onderworpen aan seriële wassen met steriele non -ionische buffer of dubbel gedestilleerd water (DDH 2 O) in dalende volumes bij 4 ° C. Grote zorg moet worden genomen om de cellen koud gedurende de gehele procedure en besmetting te voorkomen. Dit vereist het gebruik van geautoclaveerd centrifugeren emmers en niet-ionische buffers of DDH 2 O, een orbitaalschudder incubator, een groot volume high-speed gekoelde centrifuge en een set van rotoren. Bacteriën worden tenslotte opnieuw gesuspendeerd in een klein volume buffer gesupplementeerd met 10% glycerol en verdeeld in ~ 40 ul volumes which opgeslagen bij -80 ° C tot gebruik. Lage temperatuur opslag leidt vaak tot verminderde efficiëntie van de transformatie door het verlies van levensvatbaarheid in de tijd. Elektrocompetente bacteriële cellen zijn ook verkrijgbaar bij diverse commerciële bronnen, maar slechts voor een beperkt aantal (vaak recombinatie-deficiënte) E. coli stammen algemeen gebruikt als gastheer voor diverse plasmiden propageren. Hierdoor onderzoekers afhankelijk methodes ontwikkeld om hun eigen stammen / mutanten te bereiden voor transformatie. Een alternatieve, snelle en efficiënte protocol voor de bereiding van elektrocompetente E. coli is in gebruik door een enkele moleculaire bacteriologie laboratoria al enige tijd en is uitgebreid met extra Gram-negatieve bacteriën, in ons geval V. cholerae. De opsteller van het protocol kan niet worden aangemerkt als deze is geoptimaliseerd door andere onderzoekers in de tijd. De hier gepresenteerde methode is gebruikt in onze laboratoies voor bijna twee decennia, en het is ons doel om deze nuttige protocol met onze collega&#39;s te delen.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Name of the Equipment</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalogue number</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gene Pulser Module</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>165-2668</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gene Pulser Cuvette Chamber</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>165-2669</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electrocuvettes (0.2 cm gap)</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>165-2082</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>13 x 100 mm Pyrex Rimless Culture Tubes</td>
			<td>Corning</td>
			<td>70820-13</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>13 mm Culture Tube Closures</td>
			<td>Cole Parmer</td>
			<td>EW-04500-00</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6 x 250 mm Glass Rod</td>
			<td>Lab Source</td>
			<td>11381D</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable Petri Dishes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>08-757-12</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Roller Drum Motor Assembly</td>
			<td>New Brunswick Scientific</td>
			<td>M1053-4004</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Roller Drum for 13 x 100 mm Culture Tubes</td>
			<td>New Brunswick Scientific</td>
			<td>M1053-0306</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride</td>
			<td>Sigma Chemicals</td>
			<td>C5670</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol, anhydrous/denatured</td>
			<td>Sigma Chemicals</td>
			<td>227649</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inoculating Loop</td>
			<td>Decon Labs</td>
			<td>MP182-5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Refrigerated Microcentrifuge 5451 R</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>22621425</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bunsen Burner</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>03-917Q</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB Broth MILLER</td>
			<td>EMD</td>
			<td>1.10285.0500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacteriological Agar</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S25127</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

rapid protocol for preparation of electrocompetent escherichia coli and vibrio cholerae

Elektroporatie is een veel gebruikte werkwijze voor het snel en efficiënt introduceren van vreemd DNA in een groot aantal cellen. Elektrotransformatie geworden de voorkeursmethode voor het introduceren van DNA in prokaryoten die niet van nature competent. Elektroporatie is een snelle, efficiënte en gestroomlijnde transformatiewerkwijze die naast gezuiverde DNA en competente bacteriën, zijn los verkrijgbare gen pulse controller en cuvetten. In tegenstelling tot de pulserende stap bereiding van elektrocompetente cellen is tijdrovend en arbeidsintensief waarbij herhaalde rondes van centrifugeren en wassen afnemende hoeveelheden steriel, koud water of niet-ionische buffers grote hoeveelheden culturen gekweekt tot mid-logaritmische fase groei. Tijd en energie kan worden bespaard door de aankoop van elektrocompetente cellen van commerciële bronnen, maar de selectie is beperkt tot algemeen toegepaste E. coli laboratorium stammen. We worden hierbij verspreiden van een snelle enefficiënte methode voor het bereiden van electrocompetente E. coli, die is gebruikt door bacteriologische laboratoria enige tijd kunnen worden aangepast V. cholerae en andere prokaryoten. Hoewel we niet kunnen vaststellen wie tot krediet voor de ontwikkeling van de oorspronkelijke techniek worden we hierbij het beschikbaar maken voor de wetenschappelijke gemeenschap.

We voerden een reeks transformaties met E. coli en V. cholerae transformatie efficiëntie van onze snelle methodologie vergelijken met een aanpassing van de (klassieke) methode oorspronkelijk beschreven door Dower et al.. 2 voor de bereiding van elektrocompetente bacteriën. Voor het uitvoeren van de traditionele bereiding van competente cellen, 500 ml LB in een 2 L-Erlenmeyer kolf werd geïnoculeerd met 500 pi overnacht kweek van E. coli DH5a of V. cholerae O395, geïncubeerd in een orbitale schudinrichting (215 tpm bij 37 ° C) en geoogst bij OD 600 tussen 0,5-1,0. De kolf werd op ijs gekoeld en de kweken gecentrifugeerd in een vooraf gekoelde rotor bij 4000 xg gedurende 10 min bij 4 ° C. De celpellets werden grondig geresuspendeerd in 500 ml ijskoude 2 mM CaCl2 for V. cholerae en DDH 2 O voor E. coli en weer gecentrifugeerd onder dezelfde omstandigheden. Volgende ronden van resuspentie eend centrifugeren werden afnemende hoeveelheden van 200 en 100 ml volumes te zorgen dat de kweek bleef gekoeld bij 4 ° C uitgevoerd Tenslotte een resuspensie en centrifugatie in een volume van 10 ml werd met 10% glycerol. De uiteindelijke pellet werd geresuspendeerd in 2 ml 10% glycerol en 40 ul fracties werden bij -80 ° C ingevroren en niet langer opgeslagen dan een week voorafgaand aan elektroporatie. Elektroporatie voorwaarden waaronder pulse instellingen en cuvette grootte waren identiek voor beide soorten bacteriën in alle electroporations ongeacht de wijze van bereiding van competente cellen. Het enige verschil was dat voerden we de wassingen in koude DDH 2 O E. coli en koude 2 mM CaCl2 for V. cholerae. Tabel 1 toont de resultaten van bacteriën door elektroporatie identiek, maar bevoegd is, hetzij met de snelle protocol of met de traditionele methode gemaakt. We gebruikten stam O395 en DH5a als gemeenschappelijkely gebruikt, representatieve stammen van V. cholerae en E. coli respectievelijk vergelijkbare resultaten kunnen worden verkregen met andere stammen van dezelfde soort (hoewel niet elke stam getest) en waarschijnlijk aangepast aan andere Gram-negatieve bacteriën en waarschijnlijk daarbuiten. Om te verzekeren dat gelijk aantal cellen aanwezig in elke partij gepulste waren, werden elektrocompetente bacteriën gegenereerd met behulp van de snelle methode samengevoegd bij afhaling, gemengd, bleef homogeen gesuspendeerd en in porties verdeeld in 40 ul volumes kort voor elektroporatie. Elektrocompetente bacteriën gegenereerd met behulp van de traditionele methode werden eveneens voor het invriezen in 40 pi aliquots behandeld. Na levering van de puls, elke batch van 40 pi geëlectroporeerd bacteriën werd opgeschort in 400 ul LB en serieel verdund 1:10. Honderd microliter van elke verdunning werden uitgezet op LB-agar in aanwezigheid van 100 ug / ml ampicilline en verspreid met een steriele glazen cel spreaderen geïncubeerd bij 37 ° C geïncubeerd. Om het totale aantal bacteriën in iedere transformatie kwantificeren, werden 40 pl volumes elektrocompetente bacteriën van elke bereide batch serieel verdund en uitgeplaat op LB-agar zonder antibiotica identiek parallel. Een aliquot van gelijke behandeling bacteriën uit elke charge werd geëlektroporeerd met 1 ul Tris-EDTA (TE) buffer maar zonder DNA (mock transformatie), serieel verdund en uitgeplaat op LB-agar zonder antibiotica het aantal cellen verloren door levering van de schatting elektrische puls. Tenslotte een extra wijziging in de proef is in 1 ml LB uitgevoerd of 30 minuten incubaties bepaald bij 37 ° C na elektroporatie maar voorafgaand aan uitplaten op LB-agar zou de terugwinning van getransformeerde cellen beïnvloeden. kolonievormende eenheden (CFU&#39;s) werden geteld op de volgende dag. Voor dit experiment toegepast wij pUC18, een gemeenschappelijk laboratorium plasmide en batches van competente bacteriën uit eenpproximately 10 8 CFU op cellen bereid met behulp van de traditionele werkwijze en 10 7 CFU&#39;s op cellen bereid gebruik van de snelle protocol. Elektroporatie alleen (zonder DNA) verminderd levensvatbare CFU&#39;s met 10-100 vouw ongeacht de methode die wordt gebruikt om de elektrocompetente cellen te bereiden. Zoals getoond in Tabel 1, transformant opbrengst binnen 10 -10 6 7 CFU / ug DNA bereik in drie gelijke experimenten (standaarddeviaties tussen haakjes) voor E. coli (DH5a) en V. cholerae (O395) respectievelijk met behulp van de traditionele, langere methode voor elektrocompetente celpreparaat. Transformant opbrengst bleek gedaald 10-voudig tot 10 5 -10 6 CFU / ug DNA in drie gelijke experimenten (standaarddeviatie tussen haakjes) voor E. coli en V. cholerae respectievelijk met de snelle methode. Daarom bepaalden we het percentage getransformeerde bacteriën door te delen getransformeerde CFUdoor het aantal CFU&#39;s hersteld van &quot;mock transformaties&quot; (zonder plasmide) van verder identieke batches van competente cellen. Het percentage van de getransformeerde bacteriën was binnen een log (2,5-9,4%), ongeacht de wijze van bereiding en soorten getransformeerd (tabel 1 getallen tussen haakjes). Deze resultaten suggereren dat de doelmatigheid van de snelle werkwijze is vergelijkbaar met die van de traditionele langere procedure bereiden competente cellen en dat de representatieve stammen van Vibrio cholerae en Escherichia coli zijn even ontvankelijk voor de snelle procedure. We vonden dat de efficiëntie van de omzetting, voor plasmiden zoals pUC18 herbergen β-lactamase cassettes, wordt niet beïnvloed door de 30 minuten hersteltijd in LB-bouillon. Hetzelfde aantal transformanten werd teruggewonnen of de cellen werden uitgeplaat op LB agar in aanwezigheid van ampicilline direct na elektroporatie, of dat zij mochten een 30-45 minuten hersteltijdin LB-bouillon bij 37 ° C vóór plateren. Onze bevindingen dat ampicilline-resistentie niet uitgroei vereist onder niet-selectieve omstandigheden suggereert dat β-lactamase expressie optreedt voldoende snel na transformatie. Er moet echter worden opgemerkt dat wij in LB-bouillon, die hebben bijgedragen tot herstel van de elektrische schok en start genexpressie uitgevoerd seriële verdunningen van gepulste bacteriën. <img alt="Figuur 1" src="/files/ftp_upload/50684/50684fig1.jpg" /> Figuur 1. Grafische voorstelling van de methode voor de snelle bereiding van elektrocompetente bacteriën. Na 4-6 uur (afhankelijk van de dichtheid van de inocula) voldoende aantallen bacteriën worden verzameld 05:56 transformaties uitvoeren van een LB-agarplaat. Om gelijk aantal competente cellen voor elke uiteindelijke volume te geëlektroporeerd verzekeren, werden bacteriën verzameld uit de LB-agar plaat aanvankelijk samengevoegd en gewassen samen dan al.iquoted in 40 ui volumina afhankelijk van de grootte van de pellet (grotere pellets werden verdund in grotere hoeveelheden deelbaar is door 40 pi). <table border="1"><tbody><tr><td colspan="3"> Aantal Ampicilline-resistente transformanten / ug DNA (Ampicilline-resistente transformanten teruggewonnen [%]) </td></tr><tr><td> Spanning </td><td> Traditionele methode </td><td> Snelle methode </td></tr><tr><td> E. coli (DH5a) </td><td> 2.3 x 10 6 (± 7,3 x 10 5) [9,4%] </td><td> 3 x 10 6 (± 7,1 x 10 5) [2,5%] </td></tr><tr><td> V. cholerae (O395) </td><td> 4 x 10 7 (± 1,7 x 10 7) [5%] </td><td> 6,7 x 10 5 (± 2,1 x 10 5) [3,3%] </td></tr></tbody></table> Tabel 1. Transformatie-efficiëntie per microgram DNA (pUC18) elektrocompetente bBacteriën bereid volgens de traditionele methode vergeleken met de snelle methode. Alle transformaties werden uitgevoerd met 500 ng pUC18 DNA uitgevoerd (~ 80% supercoiled DNA zoals gevisualiseerd door 1% agarose gelelektroforese) en de geëlektroporeerde cellen werden serieel verdund 10-voudig in LB-medium voor uitplaten van CFU op LB-agar met antibiotica. Controles van niet-geëlektroporeerde bacteriën en bacteriën geëlektroporeerd zonder plasmide, serieel verdund en uitgeplaat op LB-agar zonder antibiotica werden voor elke reeks transformaties uitgevoerd aan het totale aantal levensvatbare bacteriën vooraf en na pulserende bepalen. De geëlektroporeerde controles vertegenwoordigde de basislijn voor het percentage van levensvatbare bacteriën met succes getransformeerd.

Watch this Scientific Journal Video about Rapid Protocol for Preparation of Electrocompetent Escherichia coli and Vibrio cholerae at JoVE.com

Rapid Protocol for Preparation of Electrocompetent Escherichia coli and Vibrio cholerae

Rapid protocol voor de bereiding van Elektrocompetente<em&gt; Escherichia coli</em&gt; En<em&gt; Vibrio cholerae</em

Elektroporatie is een algemeen gebruikte werkwijze voor het introduceren van DNA in bacteriën in een proces dat transformatie. Traditionele protocollen voor de bereiding van elektrocompetente cellen tijdrovend en arbeidsintensief. Dit artikel beschrijft een alternatieve, snelle en efficiënte werkwijze voor de bereiding van elektrocompetente cellen thans werkzaam sommige laboratoria.

Electroporation has become a widely used method for rapidly and efficiently introducing foreign DNA into a wide range of cells. Electrotransformation has ...

Research

JoVE Journal

Biology

Rapid Protocol for Preparation of Electrocompetent Escherichia coli and Vibrio cholerae

Vibrio cholerae: Model Organism to Study Bacterial Pathogenesis - Interview

Vibrio cholerae: modelorganisme Bacteriële Pathogenese Study - Interview

An Assay for Measuring the Activity of Escherichia coli Inducible Lysine Decarboxyase

An Assay for Measuring the Activity of Escherichia coli Inducible Lysine Decarboxyase

Een test voor het meten van de activiteit van de Escherichia coli Induceerbare Lysine Decarboxyase

Escherichia coli is an enteric bacterium that is capable of growing over a wide range of pH values (pH 5 - 9)1 and, incredibly, is able to survive extreme ...

High Throughput Screening of Fungal Endoglucanase Activity in Escherichia coli

High Throughput Screening of Fungal Endoglucanase Activity in Escherichia coli

High Throughput Screening van Fungal endoglucanase activiteit in Escherichia coli</em

Cellulase enzymes (endoglucanases, cellobiohydrolases, and &beta;-glucosidases) hydrolyze cellulose into component sugars, which in turn can be converted ...

Mapping Bacterial Functional Networks and Pathways in Escherichia Coli using Synthetic Genetic Arrays

Mapping Bacterial Functional Networks and Pathways in Escherichia Coli using Synthetic Genetic Arrays

Het in kaart brengen Bacteriële Functionele Netwerken en Wegen in<em&gt; Escherichia Coli</em&gt; Gebruik van synthetische Genetische Arrays

Phenotypes  are determined by a complex series of physical (e.g. protein-protein) and  functional (e.g. gene-gene or genetic) interactions (GI)1. While ...

Protocols for Implementing an Escherichia coli Based TX-TL Cell-Free Expression System for Synthetic Biology

Protocols for Implementing an Escherichia coli Based TX-TL Cell-Free Expression System for Synthetic Biology

Protocollen voor implementatie van een<em&gt; Escherichia coli</em&gt; Op basis TX-TL Cell-Free Expression System for Synthetic Biology

Ideal cell-free expression systems can theoretically emulate an in vivo cellular environment in a controlled in vitro platform.1 This is useful for ...

Detection of Live Escherichia coli O157:H7 Cells by PMA-qPCR

Detection of Live Escherichia coli O157:H7 Cells by PMA-qPCR

Detectie van Levende<em&gt; Escherichia coli</em&gt; O157: H7 cellen door PMA-qPCR

A unique open reading frame (ORF) Z3276 was identified as a specific genetic marker for E. coli O157:H7. A qPCR assay was developed for detection of E. ...

Optimized Protocol for Retinal Wholemount Preparation for Imaging and Immunohistochemistry

Geoptimaliseerd protocol voor Retina Wholemount Voorbereiding voor Imaging en Immunohistochemistry

Working with delicate tissue can be a complicating factor when performing immunohistochemical assessment. Here, we present a method that utilizes a ...

Non-chromatographic Purification of Recombinant Elastin-like Polypeptides and their Fusions with Peptides and Proteins from Escherichia coli

Non-chromatographic Purification of Recombinant Elastin-like Polypeptides and their Fusions with Peptides and Proteins from Escherichia coli

Niet-chromatografische zuivering van recombinant elastine-achtige polypeptiden en hun Fusies met peptiden en eiwitten van<em&gt; Escherichia coli</em

Elastin-like polypeptides are repetitive biopolymers that exhibit a lower critical solution temperature phase transition behavior, existing as soluble ...

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

Green Fluorescent Protein gebaseerd Expression Screening van membraaneiwitten in<em&gt; Escherichia coli</em

The production of recombinant membrane proteins for structural and functional studies remains technically challenging due to low levels of expression and ...

The Multifaceted Benefits of Protein Co-expression in Escherichia coli

The Multifaceted Benefits of Protein Co-expression in Escherichia coli

De veelzijdige voordelen van Protein Co-expressie in<em&gt; Escherichia coli</em

We report here that the expression of protein complexes in vivo in Escherichia coli can be more convenient than traditional reconstitution experiments in ...