Name: rapid protocol for preparation of electrocompetent escherichia coli and vibrio cholerae
Uploaded: 2013-10-08T18:30:00
Duration: 7 min 10 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Rapid Protocol for Preparation of Electrocompetent Escherichia coli and Vibrio cholerae at JoVE.com

Forfatterne er takknemlig til sine kolleger og ansatte med nåværende og tidligere laboratorier som har støttet utviklingen av denne teknikken. SP laboratorium støttes av Canadian Institute for Health Research Drifts Grant MOP-84473 og Alberta fornyer-Health Solutions (finansiert av Alberta Heritage Foundation for Medical Research Endowment Fund). DP ble støttet av National Institutes of Health gir MD001091-01 og GM068855-02.

En. Utarbeidelse av bakteriekulturer, Verktøy, og reagenser (DAG 1, Ettermiddag) <ol><li> På slutten av ettermiddagen, vaksinere 1-5 ml autoklaveres LB buljong i sterile (for eksempel 100 x 13 mm) borsilikatglass reagensglass med en liten delmengde av bakterier (E. coli eller V. cholerae). </li><li> Sett de inokulerte reagensglass i en berg tromme plassert ved 37 ° C temperatur (varmt rom eller inkubator), slå på rulletrommelen i høy hastighet, og inkuber O / N. </li><li> Tilbered en celle spreder i form av en &quot;hockeykølle» fra en glasstav ved oppvarming av midten av stangen i flammen fra en Bunsen-brenner inntil glasset mykner, og deretter direkte bøyen forsiktig med pinsetter eller tenger i en 135 ° vinkel . Varm opp stangen gang i midten punktet mellom enden og den første bøy og bøye den i en 45 ° vinkel innover (i motsatt retning av det første bend). </li><li> Forbered LB-agar uten antibiotika og hell i petriskåler i utarbeidelsen avelectrocompetence protokoll, og LB-agarplater inneholdende det passende antibiotikum (i henhold til motstands markør på vektoren som skal electroporated) og oppbevares ved 4 ° C. </li><li> Forbered et filter sterilisert 2 mM CaCl 2 løsning for V. cholerae, eller autoklav DDH 2 O for E. coli, og oppbevar ved 4 ° C. </li></ol> 2. Vekst av Electrocompetent Bakterier (DAY 2, Morning) <ol><li> Lever 100 pl av O / N bakteriekultur bort på hver LB agar plate, kan frosne glyserol aksjer også benyttes, og direkte levert på tallerkenen. </li><li> Dypp hockeykølle-formet celle spreader i 100% EtOE kort renne og brenne av de resterende EtOH å sterilisere den før bruk og spredning. Spre 100 mL O / N bakteriekultur jevnt med sterile glass celle spreader sørge for ikke å forstyrre (pause) agar overflaten. </li><li> Inkuber platen ved 37 ° C i 4-6 timer, eller inntil en tynn plen av bakterievekst blikommer skjelnes. Cellene er mest kompetente når aktivt voksende. </li></ol> Tre. Utarbeidelse av Electrocompetent bakterieceller (DAY 2, Ettermiddag) <ol><li> Høste bakterier med en steril inoculating sløyfe sørge for ikke å pierce eller bryte overflaten av agar. En 2 mm diameter bakteriell masse er tilstrekkelig for en enkelt transformasjon. Vanligvis krever dette skrape overflaten av den tynne plen med inokulering av sløyfen to eller tre ganger. Flere prøver (vanligvis mellom 4-6) kan hentes fra samme plate. </li><li> Resuspender bakteriell massen i en ml iskald 2 mM CaCl 2 (for V. cholerae) eller sterilt DDH 2 O (for E. coli) og bland godt til det ikke klumper er synlige, holde på is. </li><li> Sentrifuger hver bakteriesuspensjon i 5 min ved 5000 x g i en mikrosentrifuge i kjøleskap innstilt på 4 ° C, eller i en mikrosentrifuge som er lagret i et kaldt rom satt til 4 ° C. </li><li> Kast supernatanten, resuspende den bakterielle pellet i samme volum iskald 2 mM CaCl 2 eller sterilt DDH 2 O, og gjenta sentrifugeringstrinnet som utføres før ytterligere to ganger for totalt tre vaskinger. </li><li> Fjern supernatant, resuspender, og deretter løsne bakteriell pellet grundig i 40 mL iskald 2 mM CaCl 2 eller steril DDH 2 O og holde på is. </li></ol> 4. Transformasjon av Electrocompetent Bakterier (DAY 2, Ettermiddag) <ol><li> Legg opp til 1 ug av plasmid-DNA (i opp til 1 pl vann eller Tris-EDTA buffer) til 40 pl bakteriesuspensjon, og overføre denne blanding til en pre-avkjølt, steril 0,2 cm gap kyvetten. Saltkonsentrasjonen i DNA-prøven må være lav, fordi det vil bidra til lysbuedannelse av pulsen i det neste trinnet. </li><li> Sett kyvetten inn i electroporation kammeret av pulskontrollmodulen, og electroporate ved 1,8 kV, 25 mF. Tidskonstanten bør være ~ 5,0 msek, og ingen lysbuedannelse skal skje. </li><li> Raskt gjenopprette cellesuspensjonen ved resuspendering i 1 ml LB-næringsløsning og overfør til tidligere autoklavert borsilikatglass reagensrør. </li><li> Tillate cellene å utvinne ved inkubering i henhold karbonisert vekstbetingelser (i en valsetrommel) ved 37 ° C i 30 min uten antibiotika markering. </li><li> Plate bakteriene til de tidligere fremstilte LB agar plater i nærvær av det passende selektivt middel (antibiotikum), og inkuberes ved 37 ° CO / N. Dersom bakteriene blir transformert med en høy konsentrasjon av renset vektor (0,1-1 ug supertvunnet plasmid), leverer 10 pl av bakteriekulturen på kanten av LB-agar-plate og med en steril løkke inokulere rekke for isolerte kolonier ved hjelp av kvadrant strek-metoden. Hvis en ligeringsblanding ble transformert, levere 100 pl av bakteriekulturen på hver agar-plate og jevnt spre den med den steriliserte glasscelle sprederen. </li></ol> en Hvis tidskonstanten er kort (værelav 3,5 msek), eller pulsing fører til lysbuedannelse, så re-utfelles DNA-prøven, vaskes med 70% EtOH to ganger for å fjerne saltene før tørking og resuspendere i TE-buffer.

<ol>
	<li>Neumann, E., Schaefer-Ridder, M., Wang, Y., Hofschneider, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+transfer+into+mouse+lyoma+cells+by+electroporation+in+high+electric+fields.">Gene transfer into mouse lyoma cells by electroporation in high electric fields.</a> EMBO J. 1 (7), 841-845 (1982).</li><li>Dower, W. J., Miller, J. F., Ragsdale, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+efficiency+transformation+of+E.+coli+by+high+voltage+electroporation.">High efficiency transformation of E. coli by high voltage electroporation.</a> Nucleic Acids Res. 16 (13), 6127-6145 (1988).</li><li>Taketo, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+transfection+of+Escherichia+coli+by+electroporation.">DNA transfection of Escherichia coli by electroporation.</a> Biochim. Biophys. Acta. 949 (3), 318-324 (1988).</li><li>Fiedler, S., Wirth, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transformation+of+bacteria+with+plasmid+DNA+by+electroporation.">Transformation of bacteria with plasmid DNA by electroporation.</a> Anal. Biochem. 170 (1), 38-44 (1988).</li><li>O'Callaghan, D., Charbit, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+efficiency+transformation+of+Salmonella+typhimurium+and+Salmonella+typhi+by+electroporation.">High efficiency transformation of Salmonella typhimurium and Salmonella typhi by electroporation.</a> Mol. Gen. Genet. 223 (1), 156-158 (1990).</li><li>Hamashima, H., Nakano, T., Tamura, S., Arai, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+transformation+of+Vibrio+parahaemolyticus,+Vibrio+alginolyticus,+and+Vibrio+cholerae+non+O-1+with+plasmid+DNA+by+electroporation.">Genetic transformation of Vibrio parahaemolyticus, Vibrio alginolyticus, and Vibrio cholerae non O-1 with plasmid DNA by electroporation.</a> Microbiol. Immunol. 34 (8), 703-708 (1990).</li><li>Grones, J., Turna, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transformation+of+microorganisms+with+the+plasmid+vector+with+the+replicon+from+pAC1+from+Acetobacter+pasteurianus.">Transformation of microorganisms with the plasmid vector with the replicon from pAC1 from Acetobacter pasteurianus.</a> Biochem. Biophys. Res. Commun. 206 (3), 942-947 (1995).</li><li>Allen, S. P., Blaschek, H. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electroporation-induced+transformation+of+intact+cells+of+Clostridium+perfringens.">Electroporation-induced transformation of intact cells of Clostridium perfringens.</a> Appl. Environ. Microbiol. 54, 2322-2324 (1988).</li><li>Belliveau, B. H., Trevors, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transformation+of+Bacillus+cereus+vegetative+cells+by+electroporation.">Transformation of Bacillus cereus vegetative cells by electroporation.</a> Appl. Environ. Microbiol. 55, 1649-1652 (1989).</li><li>Chassy, B. M., Flickinger, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transformation+of+Lactobacillus+casei+by+electroporation.">Transformation of Lactobacillus casei by electroporation.</a> FEMS Microbiol. Lett. 44, 173-177 (1987).</li><li>Dunny, G. M., Lee, L. N., LeBlanc, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+electroporation+and+cloning+vector+system+for+gram-positive+bacteria.">Improved electroporation and cloning vector system for gram-positive bacteria.</a> Appl. Environ. Microbiol. 57 (4), 1194-1201 (1991).</li><li>Micheletti, P. A., Sment, K. A., Konisky, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+a+coenzyme+M-auxotrophic+mutant+and+transformation+by+electroporation+in+Methanococcus+voltae.">Isolation of a coenzyme M-auxotrophic mutant and transformation by electroporation in Methanococcus voltae.</a> J. Bacteriol. 173 (11), 3414-3418 (1991).</li><li>Schleper, C., Kubo, K., Zillig, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+particle+SSV1+from+the+extremely+thermophilic+archaeon+Sulfolobus+is+a+virus:+demonstration+of+infectivity+and+of+transfection+with+viral+DNA.">The particle SSV1 from the extremely thermophilic archaeon Sulfolobus is a virus: demonstration of infectivity and of transfection with viral DNA.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 89 (16), 7645-7649 (1992).</li><li>Aune, T. E., Aachmann, F. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methodologies+to+increase+the+transformation+efficiencies+and+the+range+of+bacteria+that+can+be+transformed.">Methodologies to increase the transformation efficiencies and the range of bacteria that can be transformed.</a> Appl. Microbiol. Biotechnol. 85 (5), 1301-1313 (2010).</li><li>Hanahan, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studies+on+transformation+of+Escherichia+coli+with+plasmids.">Studies on transformation of Escherichia coli with plasmids.</a> J. Mol. Biol. 166, 557 (1983).</li><li>Unterweger, D., Kitaoka, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Constitutive+Type+VI+Secretion+System+Expression+Gives+Vibrio+cholerae+Intra-+and+Interspecific+Competitive+Advantages.">Constitutive Type VI Secretion System Expression Gives Vibrio cholerae Intra- and Interspecific Competitive Advantages.</a> PLoS One. 7 (10), e48320 (2012).</li></ol>

Ingen avsløringer er aktuelt.

Transformasjon effektivitet er avhengig av en rekke faktorer, uavhengig av den anvendes til å frem kompetente celler metode. Analoge verdier gjelder for denne metoden, stor forsiktighet må utvises at når cellene er høstet fra agar-plate slik at de blir opprettholdt ved konstant kald temperatur (ikke høyere enn 4 ° C). Den bakteriematten skal være aktivt voksende på tidspunktet for innsamling; cellene må være i midten av logaritmisk vekstfase. Kvalitet på DNA (dvs. forurensning av salter) påvirker transformasjon effektivitet. Nærmere bestemt, ved å benytte denne metoden, agar bør ikke bli brutt som agar-fragmenter i kuvetten vil føre til overslag på pulsen. De fleste problemene med denne teknikken er forbundet med to problemer, samle bakterier om den riktige tidsvindu fra agar-plate når de aktivt voksende. Samle dem også snart vil gi utilstrekkelige celle tall og vil gjengiskraping av LB agarplate frustrerende fordi &quot;pellicule&quot; de danner er vanskelig å løfte opp fra overflaten av platen. Samle bakterier for sent vil redusere sin kompetanse dramatisk. Vinduet tid vil naturligvis variere avhengig av tettheten av podestoff belagt på LB agarplater. Den andre kritiske trinnet er å holde bakteriene kald (4 ° C) fra det øyeblikk de blir løftet av agar-plate og resuspendert i CaCl 2 eller DDH 2 O inntil de blir sådd ut på LB-agar etter transformasjon. De mikrofuge-rør inneholdende bakterier, kyvetter og buffer bør være pre-kjølt og holdt på is hele tiden inntil bakteriene blir belagt. Imidlertid kan flere problemer oppstå når det sterile DDH 2 O eller CaCl 2 inneholder bunnfall eller er forurenset. Av denne grunn anbefaler vi å forberede denne reagensen frisk. Feilsøking transformasjon er tilrettelagt av blant annet kontroller når du transformerer BActeria gjengis kompetent av noen metode. En negativ kontroll bestående av en gruppe av ikke-transformerte kompetente bakterier belagt på en LB-agarplate inneholdende det selektive markør hurtig vil bidra til å bestemme hvorvidt antibiotikum på plate er effektiv. En positiv kontroll transformasjon med et plasmid kjent fremstilling av god kvalitet og kvantitet harbo samme selektiv markør som den eksperimentelle prøve vil være nyttig for å bestemme hvorvidt bakteriene er kompetente, men også om den eksperimentelle DNA transformert var tilstrekkelig mengde eller kvalitet. Fordelene ved denne teknikk er flere, kan metoden bli utført innenfor samme dag som en transformasjon er planlagt. Vi har funnet at frossen bakteriell glyserol lager kan være belagt direkte på LB agar uten tap i electrocompetence, vi har gjort dette i &quot;krise&quot; situasjoner (etter glemme å starte natten kultur dagen før). Selv om vi ikke kunne teste eveldig belastning kjent, noe E. coli eller V. cholerae stamme som kan bli forvandlet ved elektroporering har vært mottagelig for denne protokollen i våre hender. Teknikken er rask, effektiv, og avlingene transformasjon effektivitet sammenlignes med de man får fra å forberede electrocompetent bakterier ansette tradisjonelle metoder. Fremgangsmåten eliminerer behovet for høyhastighetssentrifuge og tilhørende rotorer, en orbital risteinkubator, og sterile sentrifugerør bøtter (beholdere), og store volumer av autoklavert buffer. Selv om Tabell over spesifikke reagenser og utstyr er ganske omfattende, vil de fleste laboratorier som utfører elektroporering har de fleste, om ikke alle, av disse materialene som allerede er tilgjengelig. Kanskje viktigst, kan teknikken bli lett brukes til å generere electrocompetent laboratoriespesifikke stammer med muterte bakgrunn raskt. Vi er uvitende om eventuelle begrensninger i denne teknikken som det har erstattet den tradisjonelle metoden for utarbeidelse av elektrocompetent bakterier i våre laboratorier. Resultatene av eksperimentene er vist her ble utført med friske electrocompetent celler fremstilt med den tradisjonelle metode som var blitt lagret ved -80 ° C i ikke lenger enn en uke. Men frosne electrocompetent celle bestandene mister kompetanse og eller levedyktighet over lengre lagring. Vår forkortet protokollen tillater utarbeidelse av friske electrocompetent celler samme dag transformasjonen er planlagt uten bekymringer om alder av bestanden som kan resultere i redusert transform yield. Vi har ikke forsøkt å lagre electrocompetent celler produseres ved hjelp av den raske metode for bruk på en annen dag, da dette ikke har vært nødvendig. Selv om det ikke er vist her, effektiviteten av de electrocompetent celler utarbeidet ved hjelp av vår raske metoden er tilstrekkelig for ligation blandinger. De transformasjoner som er rapportert for ikke-O1 V. cholerae i en fersk artikkel av Unterweger et al.17 ble utført ved hjelp electrocompetent bakterier fremstilt ved fremgangsmåten som beskrives her (med unntak av de som utføres av konjugasjon). Denne teknikken gir forskere å forvandle stammer med mutant bakgrunn raskt og effektivt uten å måtte forberede store grupper av celler. Denne raske fremstilling av electrocompetent bakterier metoden kan tilpasses andre prokaryote celler som har blitt vist å være mottagelig for elektroporering som prinsippet for fremstilling og electroporation innstillinger kommer til å være den samme som for tradisjonelle protokoller.

Siden &#39;starten tidlig på 1980-tallet en, har elektroporering blitt en integrert molekylærbiologi teknikk, sannsynligvis den mest vanlige metoden benyttes for å transformere / transfektere levende celler med sirkulær eller lineær nukleinsyrer. Den ble først utviklet for transfeksjon av eukaryote celler 1, ble elektroporering senere tilpasset for transformasjon av E. coli-2, 3. I bakteriologi har elektroporering blitt laboratoriestandard, og er blitt modifisert til å omdanne en lang rekke bakterier, inkludert Gram-negative Pseudo 4, 5 Salmonella, Vibrio-arter 6, Serratiae og shigellae 7, Gram-positive Clostridia 8, Bacilli 9, 10 Lactobacilli og Enterokokker 11. Selv noen archaebacteria har vist seg mottagelig for transformasjon av elektroporering, inkludert Methanococci </em&gt; 12 og Sulfolobus arter 13. For en omfattende gjennomgang henvises til Aune og Aachmann 14. Effektivitet av transformasjon av elektroporering er angivelig 10-20 ganger høyere enn kjemisk kompetanse eller heat shock to. Men mye som forbereder bakterier for kjemisk kompetanse som optimaliseres ved Douglas Hanahan i 1980 15, cellene må også være forberedt på å bli electrocompetent. Electroporation er en rask og effektiv måte bakteriell transformasjon, krever electrocompetent bakterier, renset DNA, en puls kontroll modul som leverer den elektriske impulsen, og et kammer som rommer små engangs kyvetter som fungerer som en elektrode. Kort fortalt blir kalde, kompetente bakterier blandet med plasmid DNA, utsettes for en høy-spenningspuls i en kyvette, resuspendert i vekstmedier, inkubert ved 30-37 ° C i 30-45 min, og deretter sådd ut på halvfast medium (næringsagar plater) med caopriate selektiv antibiotika. I motsetning til den pulserende trinn, fremstillingen av electrocompetent E. coli forblir en flerdelt prosedyre som er tradisjonelt utført i store volumer. I korthet blir en over natten kultur av bakterier inokulert i en Erlenmeyerkolbe med 100 ml til 1 L Luria Broth (LB), dyrket til midt-logaritmisk fase av vekst (OD 600 på &lt;1,0), og som er utsatt for serievaskinger med en steril non -ionisk buffer-eller dobbelt-destillert vann (DDH 2 O) i avtagende volumer ved 4 ° C. Stor forsiktighet må tas for å holde cellene kaldt gjennom hele prosedyren og hindre forurensning. Dette krever bruk av autoklaveres sentrifuge bøtter og ikke-ioniske buffere eller DDH 2 O, en orbital risteinkubator, et stort volum med høy hastighet nedkjølt sentrifuge og et sett med rotorer. Bakterier blir til slutt resuspendert i et lite volum av buffer supplert med 10% glycerol, og alikvotert inn ~ 40 ul volumer, which lagres ved -80 ° C inntil bruk. Lav-temperaturlagring ofte resulterer i redusert transformasjonseffektivitet på grunn av tap av levedyktighet over tid. Electrocompetent bakterielle celler er også tilgjengelige fra en rekke kommersielle kilder, men bare i et begrenset antall (ofte rekombinasjon-manglende) E. coli-stammer som vanligvis blir anvendt som verter for å forplante en rekke plasmider. Som et resultat forskere avhengige av in-house metoder for å forberede sine egne stammer / mutanter for transformasjon. En alternativ, rask og effektiv protokoll for utarbeidelse av electrocompetent E. coli har vært i bruk av noen få molekylære bakteriologi laboratorier for noen tid nå, og har blitt utvidet til flere Gram-negative bakterier, i vårt tilfelle V. cholerae. Ikke kan identifiseres opphavs protokollen som det har blitt optimalisert av andre forskere over tid. Metoden som er presentert her er benyttet i vår laboratorkaper for nesten to tiår, og det er vårt mål å dele dette nyttig protokollen med våre kolleger.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Name of the Equipment</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalogue number</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gene Pulser Module</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>165-2668</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gene Pulser Cuvette Chamber</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>165-2669</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electrocuvettes (0.2 cm gap)</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>165-2082</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>13 x 100 mm Pyrex Rimless Culture Tubes</td>
			<td>Corning</td>
			<td>70820-13</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>13 mm Culture Tube Closures</td>
			<td>Cole Parmer</td>
			<td>EW-04500-00</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6 x 250 mm Glass Rod</td>
			<td>Lab Source</td>
			<td>11381D</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable Petri Dishes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>08-757-12</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Roller Drum Motor Assembly</td>
			<td>New Brunswick Scientific</td>
			<td>M1053-4004</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Roller Drum for 13 x 100 mm Culture Tubes</td>
			<td>New Brunswick Scientific</td>
			<td>M1053-0306</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride</td>
			<td>Sigma Chemicals</td>
			<td>C5670</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol, anhydrous/denatured</td>
			<td>Sigma Chemicals</td>
			<td>227649</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inoculating Loop</td>
			<td>Decon Labs</td>
			<td>MP182-5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Refrigerated Microcentrifuge 5451 R</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>22621425</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bunsen Burner</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>03-917Q</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB Broth MILLER</td>
			<td>EMD</td>
			<td>1.10285.0500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacteriological Agar</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S25127</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

rapid protocol for preparation of electrocompetent escherichia coli and vibrio cholerae

Electroporation er blitt en utbredt metode for hurtig og effektivt å introdusere fremmed DNA inn i et bredt spekter av celler. Electrotransformation har blitt den foretrukne metode for å innføre DNA inn i prokaryoter som ikke er naturlig kompetente. Electroporation er en hurtig, effektiv og strømlinjeformet transformasjonsmetoden som, i tillegg til renset DNA og kompetente bakterier, krever kommersielt tilgjengelig genet puls kontrolleren og kyvetter. I motsetning til den pulserende trinn er fremstilling av electrocompetent celler tidkrevende og arbeidskrevende omfatter gjentatte runder med sentrifugering og vasker i avtagende mengder av sterile, kaldt vann, eller ikke-ioniske buffere av store volumer av kulturer dyrket til middels logaritmisk fase i vekst. Tid og krefter kan bli frelst ved å kjøpe electrocompetent celler fra kommersielle kilder, men utvalget er begrenset til vanlig ansatt E. coli laboratoriestammer. Vi er herved å spre en hurtig ogeffektiv metode for fremstilling av electrocompetent E. coli, som har vært i bruk av bakteriologi laboratorier i noen tid, kan tilpasses V. cholerae og andre prokaryote celler. Mens vi ikke kan fastslå hvem du kreditt for å utvikle den opprinnelige teknikken, er vi herved gjøre den tilgjengelig for det vitenskapelige miljøet.

Vi gjennomførte et sett av transformasjoner med E. coli og V. cholerae å sammenligne transformasjon effektiviteten av vår raske metodikk med en tilpasning av (tradisjonell) metoden opprinnelig beskrevet av tilhørte et al. 2 for utarbeidelse av electrocompetent bakterier. For å utføre den tradisjonelle fremstilling av kompetente celler, ble 500 ml LB i en 2 L-Erlenmeyer-kolbe inokulert med 500 mL over natten kultur av E. coli DH5α eller V. cholerae O395, ruges i en orbital shaker (215 rpm ved 37 ° C), og høstet på OD 600 på mellom 0,5-1,0. Kolben ble avkjølt på is, og kulturene sentrifugert i en pre-avkjølt rotor ved 4000 xg i 10 min ved 4 ° C. Cellepelletene ble grundig resuspendert i 500 ml iskald 2 mM CaCl 2 for V. cholerae og DDH 2 O for E. coli, og sentrifugeres på nytt under de samme betingelser. Påfølgende runder med resuspensjon end sentrifugering ble utført i synkende volumer av 200 og 100 ml volumer gjør at kulturen forble kjølt ved 4 ° C. Til slutt ble en resuspensjon og sentrifugering i et 10 ml volum utført med 10% glycerol. Den endelige pellet ble resuspendert i 2 ml 10% glyserol og 40 pl aliquoter ble frosset ved -80 ° C og lagres lenger enn en uke før elektroporering. Elektroporering betingelser inkludert puls innstillinger og kyvette størrelse var identiske for begge bakteriearter i alle electroporations uavhengig av metoden for fremstilling av kompetente celler. Den eneste forskjellen var at vi gjennomførte de vasker i kaldt DDH 2 O for E. coli og kaldt 2 mM CaCl 2 for V. cholerae. Tabell 1 viser resultatene av bakterier transformert ved elektroporering identisk, men gjengitt vedkommende enten med den raske protokoll eller med den tradisjonelle metode. Vi ansatt belastning O395 og DH5α som vanligly brukt, representative stammer av V. cholerae og E. coli henholdsvis tilsvarende resultater kan oppnås med andre stammer av samme art (selv om ikke hver enkelt stamme er blitt testet) og trolig tilpasses andre Gram-negative bakterier og sannsynligvis utover. For å sikre at like celle tall var til stede i hvert parti pulserende, ble electrocompetent bakterier generert utnytte den raske metoden samlet ved henting, blandet, holdt homogent suspendert, og alikvoteres i 40 mL volumer kort tid før elektroporering. Electrocompetent bakterier generert utnytte den tradisjonelle metoden ble behandlet på samme måte før den fryses ned i 40 ul delprøver. Etter levering av pulsen, ble hver gruppe på 40 pl electroporated bakterier suspendert i 400 pl LB-og seriefortynnet 1:10. Ett hundre mikroliter av hver fortynning ble platet ut på LB-agar i nærvær av 100 pg / ml ampicillin og spres ved hjelp av en steril glasscelle sprederog inkubert ved 37 ° C over natten. For å kvantifisere det totale antall bakterier som anvendes i hver transformasjon, ble 40 ul volumer av electrocompetent bakterier av hver forberedt batch serielt fortynnet og sådd ut på LB-agar uten antibiotika identisk i parallell. En aliquot av likt behandlede bakterier fra hver batch ble elektroporert med 1 pl Tris-EDTA (TE) buffer, men uten DNA (mock transformasjon), seriefortynnet og plettert på LB-agar uten antibiotika for å beregne antall celler tapt ved levering av elektrisk puls. Til slutt, ble en ytterligere variasjon av forsøket utført for å bestemme hvorvidt 30 min inkubering ved 37 ° C i 1 ml LB etter elektroporering, men forut for plating på LB-agar ville påvirke utvinningen av transformerte celler. kolonidannende enheter (CFUs) ble nummerert på følgende dag. For dette forsøk anvendes vi pUC18, en vanlig laboratorie-plasmid, og grupper av kompetente bakterier som består av etpproximately 10 8 CFUs for celler forberedt utnytte den tradisjonelle metoden og 10 7 CFUs for celler utarbeidet utnytte den raske protokollen. Electroporation alene (uten DNA) redusert levedyktige CFUs med 10-100 ganger uavhengig av hvilken metode som brukes til å forberede electrocompetent celler. Som vist i tabell 1, transformant utbyttet var innenfor 10 6 -10 7 CFUs / ug av DNA-område i tre gjentatte eksperimenter (standardavvik i parentes) for E. coli (DH5α) og V. cholerae (O395) henholdsvis med den tradisjonelle, omstendelig metode for electrocompetent celleforberedelsen. Transform avkastning dukket redusert 10 ganger til 10 5 -10 6 CFUs / mikrogram av DNA i tre replikat eksperimenter (standardavvik i parentes) for E. coli og V. cholerae henholdsvis ved hjelp av den raske metode. Av denne grunn vi bestemt prosentandel av transformerte bakterier ved å dele transform CFUsmed antall CFUs utvinnes fra &quot;mock&quot;-transformasjoner (uten plasmid) fra ellers identiske satser av kompetente celler. Prosentandelen av transformerte bakterier var innenfor ett log (2.5 til 9.4%) uavhengig av metode for forberedelse og arter transformert (Tabell 1 alternative tall). Disse resultater antyder at effektiviteten av den raske metode er sammenlignbar med den tradisjonelle omstendelig fremgangsmåte for fremstilling av kompetente celler, og at de representative stammer av Vibrio cholerae, og Escherichia coli er like mottagelig for den raske fremgangsmåten. Vi fant at transformasjonseffektivitet, for plasmider som pUC18 skjuler β-laktamase kassetter, ikke påvirkes av 30 min utvinning tid i LB buljong. Det samme antall transformanter ble gjenvunnet vidt cellene ble platet ut på LB-agar i nærvær av ampicillin direkte etter elektroporering, eller hvorvidt de ble tillatt en 30 til 45 minutters gjenopprettingstideni LB-buljong ved 37 ° C før pletteringen. Våre funn at ampicillin-resistens ikke krever utvekst i henhold til ikke-selektive betingelser antyder at β-lactamase ekspresjon skjer tilstrekkelig raskt ved transformasjon. Det bør imidlertid legges merke til at vi har utført seriefortynninger av pulserende bakterier i LB-næringsløsning, som kan ha bidratt til utvinning fra den elektriske sjokk og initiere genekspresjon. <img alt="Figur 1" src="/files/ftp_upload/50684/50684fig1.jpg" /> Figur 1. Grafisk fremstilling av metodikk for hurtig fremstilling av electrocompetent bakterier. Etter 4-6 timer (avhengig av tettheten av inokula) et tilstrekkelig antall bakterier kan samles for å utføre 4-6 transformasjoner fra en enkelt LB agarplate. For å sikre like mange kompetente celler for hver sluttvolum som skal electroporated, ble bakteriene samlet inn fra LB agarplate først slått sammen og vasket sammen så aliquoted i 40 ul volumer avhengig av størrelsen av pelleten (større pellets ble fortynnet i større mengder som er delelig med 40 mL). <table border="1"><tbody><tr><td colspan="3"> Antall Ampicillin-resistente transformants / mikrogram DNA (Ampicillin-resistente transformants gjenvunnet [%]) </td></tr><tr><td> Strain </td><td> Tradisjonelle metoden </td><td> Rapid metode </td></tr><tr><td> E. coli (DH5α) </td><td> 2,3 x 10 6 (± 7,3 x 10 5) [9,4%] </td><td> 3 x 10 til 6 (± 7,1 x 10 5) [2,5%] </td></tr><tr><td> V. cholerae (O395) </td><td> 4 x 10 7 (± 1,7 x 10 7) [5%] </td><td> 6,7 x 10 5 (± 2.1 x 10 5) [3,3%] </td></tr></tbody></table> Tabell 1. Transformation effektivitet per mikrogram av DNA (pUC18) av electrocompetent bacteria fremstilt ved den tradisjonelle fremgangsmåten, sammenlignet med den hurtige metode. Alle transformasjoner ble utført med 500 ng pUC18 DNA (~ 80% vunnet DNA som visualisert ved 1% agarosegel-elektroforese) og electroporated celler ble seriefortynnet 10 ganger i LB-næringsløsning før plettering for CFU på LB-agar med antibiotika. Styring av ikke-electroporated bakterier og bakterie electroporated uten plasmid, serielt fortynnet og sådd ut på LB-agar uten antibiotika ble utført for hvert sett av transformasjoner for å bestemme det totale antall levedyktige bakterier før og etter pulserende. De electroporated kontrollene representerer grunnlinjen for den prosent av levedyktige bakterier med hell transformeres.

Watch this Scientific Journal Video about Rapid Protocol for Preparation of Electrocompetent Escherichia coli and Vibrio cholerae at JoVE.com

Rapid Protocol for Preparation of Electrocompetent Escherichia coli and Vibrio cholerae

Rapid Protokoll for Utarbeidelse av Electrocompetent<em&gt; Escherichia coli</em&gt; Og<em&gt; Vibrio cholerae</em

Electroporation er en vanlig anvendt metode for å innføre DNA inn i bakterier i en prosess kjent som transformasjon. Tradisjonelle protokoller for fremstilling av electrocompetent celler er tidkrevende og arbeidskrevende. Denne artikkelen beskriver en alternativ, rask og effektiv metode for fremstilling av electrocompetent celler som for tiden anvendes av noen laboratorier.

Electroporation has become a widely used method for rapidly and efficiently introducing foreign DNA into a wide range of cells. Electrotransformation has ...

Research

JoVE Journal

Biology

Rapid Protocol for Preparation of Electrocompetent Escherichia coli and Vibrio cholerae

Vibrio cholerae: Model Organism to Study Bacterial Pathogenesis - Interview

An Assay for Measuring the Activity of Escherichia coli Inducible Lysine Decarboxyase

An Assay for Measuring the Activity of Escherichia coli Inducible Lysine Decarboxyase

Escherichia coli is an enteric bacterium that is capable of growing over a wide range of pH values (pH 5 - 9)1 and, incredibly, is able to survive extreme ...

High Throughput Screening of Fungal Endoglucanase Activity in Escherichia coli

High Throughput Screening of Fungal Endoglucanase Activity in Escherichia coli

Cellulase enzymes (endoglucanases, cellobiohydrolases, and &beta;-glucosidases) hydrolyze cellulose into component sugars, which in turn can be converted ...

Mapping Bacterial Functional Networks and Pathways in Escherichia Coli using Synthetic Genetic Arrays

Mapping Bacterial Functional Networks and Pathways in Escherichia Coli using Synthetic Genetic Arrays

Kartlegging Bakteriell Funksjonelle nettverk og veier i<em&gt; Escherichia Coli</em&gt; Ved hjelp av syntetisk Genetiske Arrays

Phenotypes  are determined by a complex series of physical (e.g. protein-protein) and  functional (e.g. gene-gene or genetic) interactions (GI)1. While ...

Protocols for Implementing an Escherichia coli Based TX-TL Cell-Free Expression System for Synthetic Biology

Protocols for Implementing an Escherichia coli Based TX-TL Cell-Free Expression System for Synthetic Biology

Protokoller for å gjennomføre en<em&gt; Escherichia coli</em&gt; Basert TX-TL Cell-Free Expression System for syntetisk biologi

Ideal cell-free expression systems can theoretically emulate an in vivo cellular environment in a controlled in vitro platform.1 This is useful for ...

Detection of Live Escherichia coli O157:H7 Cells by PMA-qPCR

Detection of Live Escherichia coli O157:H7 Cells by PMA-qPCR

Påvisning av Levende<em&gt; Escherichia coli</em&gt; O157: H7 celler ved PMA-qPCR

A unique open reading frame (ORF) Z3276 was identified as a specific genetic marker for E. coli O157:H7. A qPCR assay was developed for detection of E. ...

Optimized Protocol for Retinal Wholemount Preparation for Imaging and Immunohistochemistry

Working with delicate tissue can be a complicating factor when performing immunohistochemical assessment. Here, we present a method that utilizes a ...

Non-chromatographic Purification of Recombinant Elastin-like Polypeptides and their Fusions with Peptides and Proteins from Escherichia coli

Non-chromatographic Purification of Recombinant Elastin-like Polypeptides and their Fusions with Peptides and Proteins from Escherichia coli

Ikke-kromatografisk rensing av rekombinant Elastin-lignende polypeptider og deres Fusjoner med peptider og proteiner fra<em&gt; Escherichia coli</em

Elastin-like polypeptides are repetitive biopolymers that exhibit a lower critical solution temperature phase transition behavior, existing as soluble ...

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

Grønn Fluorescent Protein-baserte Expression Screening av membran proteiner i<em&gt; Escherichia coli</em

The production of recombinant membrane proteins for structural and functional studies remains technically challenging due to low levels of expression and ...

The Multifaceted Benefits of Protein Co-expression in Escherichia coli

The Multifaceted Benefits of Protein Co-expression in Escherichia coli

Det mangefasetterte Fordeler med Protein Co-uttrykk i<em&gt; Escherichia coli</em

We report here that the expression of protein complexes in vivo in Escherichia coli can be more convenient than traditional reconstitution experiments in ...