Name: rapid protocol for preparation of electrocompetent escherichia coli and vibrio cholerae
Uploaded: 2013-10-08T18:30:00
Duration: 7 min 10 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Rapid Protocol for Preparation of Electrocompetent Escherichia coli and Vibrio cholerae at JoVE.com

Авторы выражают благодарность своим коллегам и сотрудникам нынешних и прошлых лабораторий, которые поддержали развитие этой техники. Лаборатория SP получает поддержку от Канадского института исследований в области здравоохранения Операционная Грант СС-84473 и Альберта Решения осуществляет инновации-санитарные правила (финансируемые Фондом Альберта наследия медицинской Endowment Fund Research). DP была поддержана Национальными Институтами Здоровья предоставляет MD001091-01 и GM068855-02.

1. Подготовка бактериальных культур, инструментов и реактивов (ДЕНЬ 1, вторая половина дня) <ol><li> Во второй половине дня, привить 1-5 мл автоклавного LB бульон в стерильной (например, 100 х 13 мм) испытаний боросиликатного стекла трубки с небольшой аликвоты бактерий (кишечной палочки или холерных вибрионов). </li><li> Установите засеянных пробирок в роликовой барабана размещены при 37 ° C Температура (теплый комнатной или инкубатора), включите ролика барабана на высокой скорости, и инкубировать O / N. </li><li> Подготовьте клеток разбрасыватель в форме &quot;хоккейной клюшки&quot; из стеклянной палочкой при нагревании до середины стержня в пламени горелки Бунзена пока стекло не смягчает, а затем направить изгиб мягко с помощью пинцета или щипцов в угол 135 ° . Нагреть стержень еще раз в средней точке между концом и первого изгиба и согнуть его под углом 45 ° внутрь (в направлении, противоположном направлению первого изгиба). </li><li> Подготовка LB-агар без антибиотиков и вылить в чашках Петри в подготовкеelectrocompetence протокола, и LB-агаром, содержащие соответствующий антибиотик (в соответствии с маркером устойчивости на вектора, электропорации), и хранить при 4 ° С. </li><li> Подготовьте фильтр стерилизовать 2 мМ CaCl 2 решение для V. вибрион, или автоклав DDH 2 O для Е. палочка, и хранить при температуре 4 ° C. </li></ol> 2. Рост Электрокомпетентные бактерий (ДЕНЬ 2, утро) <ol><li> Доставка по 100 мкл бактериальной культуры O / N на каждой чашке с агаром LB, замороженные запасы глицерина также могут быть использованы и доставляется на тарелку. </li><li> Опустите клюшка-образный распределитель клеток в 100% этанола, кратко процедить и сжечь оставшиеся EtOH стерилизовать перед использованием и распространением. Распространение бактериальной культуры 100 мкл O / N равномерно стерильный разбрасыватель стеклянная ячейка следя, чтобы не сорвать (перерыв) поверхность агара. </li><li> Инкубировать при 37 ° С в течение 4-6 ч, или до тех пор, тонкий газон роста бактерий не бытьприходит различимы. Клетки наиболее компетентным, когда активно растет. </li></ol> 3. Подготовка Электрокомпетентные бактериальных клеток (ДЕНЬ 2, вторая половина дня) <ol><li> Урожай бактерии со стерильным микробиологической петли следя, чтобы не проколоть сломать или поверхность агара. Один диаметр 2 мм бактериальную массу достаточно для одной трансформации. Как правило, это требует соскабливания поверхности тонкой газон с микробиологической петли два или три раза. Несколько образцов (обычно между 4-6) могут быть собраны из одной тарелки. </li><li> Ресуспендируют бактериальной массы в 1 мл ледяной 2 мМ CaCl 2 (для V.cholerae,) или стерильной DDH 2 O (дл E.coli) и хорошо перемешать до тех пор пока не сгустки не могут видеть, держать на льду. </li><li> Центрифуга друг бактериальной суспензии в течение 5 мин при 5000 мкг в в охлажденном микроцентрифуге установлен в 4 ° С, или в микроцентрифуге хранится в холодном помещении, установленным в 4 ° С. </li><li> Удалите супернатант, resuspв конечном бактериальный осадок в том же объеме охлажденного на льду 2 мМ CaCl 2 или стерильной DDH 2 O, и повторить стадии центрифугирования, как это сделано, прежде чем в два раза больше в течение всего три раза. </li><li> Удалить супернатант, ресуспендируют, затем ослабьте бактериальных гранул тщательно в 40 мкл ледяной 2 мМ CaCl 2 или стерильной DDH 2 O и держать на льду. </li></ol> 4. Трансформация Электрокомпетентные бактерий (ДЕНЬ 2, вторая половина дня) <ol><li> Добавить до 1 мкг плазмидной ДНК (в срок до 1 мкл воды или Трис-ЭДТА буфере) в 40 мкл бактериальной суспензии и передавать эту смесь в предварительно охлажденный, стерильный 0,2 см зазора кюветы. Концентрация соли в образце ДНК должна быть низкой, так как это будет способствовать дуги импульса на следующей стадии. </li><li> Вставьте кювету в электропорации камере модуля управления импульса и электропорации 1,8 кВ, 25 мкФ. Постоянная времени должно быть ~ 5,0 мс, и ни дуги не должно происходить. </li><li> Быстро восстановить клеточной суспензии ресуспендированием в 1 мл LB бульоне и передачи в ранее автоклавного тест боросиликатного стекла трубки. </li><li> Разрешить клетки восстановить путем инкубации при газированных условий роста (в роликовом барабане) при 37 ° С в течение 30 мин без выбора антибиотика. </li><li> Пластинчатый бактерии на заранее подготовленных LB чашках с агаром в присутствии соответствующего селективного агента (антибиотиками), и инкубируют при 37 ° CO / N. Если бактерии трансформировали с высокой концентрацией очищенного вектора (0,1-1 мкг плазмидной суперспирализованной), обеспечивают 10 мкл бактериальной культуры на краю LB агаром и со стерильным затравочное петли для отжима изолированных колоний с использованием метода квадранта полосу. Если перевязки смесь трансформировали, доставить 100 мкл бактериальной культуры на каждый агаром и равномерно ее с стерилизованные стеклянные клетки разбрасывателя. </li></ol> Если постоянная времени мало (бытьнизкая 3,5 мс), или пульсирующий приводит к дуги, а затем вновь осадить образец ДНК, мыть с 70% этанола в два раза для удаления солей перед сушкой и ресуспендированием в ТЕ буфере.

<ol>
	<li>Neumann, E., Schaefer-Ridder, M., Wang, Y., Hofschneider, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+transfer+into+mouse+lyoma+cells+by+electroporation+in+high+electric+fields.">Gene transfer into mouse lyoma cells by electroporation in high electric fields.</a> EMBO J. 1 (7), 841-845 (1982).</li><li>Dower, W. J., Miller, J. F., Ragsdale, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+efficiency+transformation+of+E.+coli+by+high+voltage+electroporation.">High efficiency transformation of E. coli by high voltage electroporation.</a> Nucleic Acids Res. 16 (13), 6127-6145 (1988).</li><li>Taketo, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+transfection+of+Escherichia+coli+by+electroporation.">DNA transfection of Escherichia coli by electroporation.</a> Biochim. Biophys. Acta. 949 (3), 318-324 (1988).</li><li>Fiedler, S., Wirth, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transformation+of+bacteria+with+plasmid+DNA+by+electroporation.">Transformation of bacteria with plasmid DNA by electroporation.</a> Anal. Biochem. 170 (1), 38-44 (1988).</li><li>O'Callaghan, D., Charbit, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+efficiency+transformation+of+Salmonella+typhimurium+and+Salmonella+typhi+by+electroporation.">High efficiency transformation of Salmonella typhimurium and Salmonella typhi by electroporation.</a> Mol. Gen. Genet. 223 (1), 156-158 (1990).</li><li>Hamashima, H., Nakano, T., Tamura, S., Arai, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+transformation+of+Vibrio+parahaemolyticus,+Vibrio+alginolyticus,+and+Vibrio+cholerae+non+O-1+with+plasmid+DNA+by+electroporation.">Genetic transformation of Vibrio parahaemolyticus, Vibrio alginolyticus, and Vibrio cholerae non O-1 with plasmid DNA by electroporation.</a> Microbiol. Immunol. 34 (8), 703-708 (1990).</li><li>Grones, J., Turna, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transformation+of+microorganisms+with+the+plasmid+vector+with+the+replicon+from+pAC1+from+Acetobacter+pasteurianus.">Transformation of microorganisms with the plasmid vector with the replicon from pAC1 from Acetobacter pasteurianus.</a> Biochem. Biophys. Res. Commun. 206 (3), 942-947 (1995).</li><li>Allen, S. P., Blaschek, H. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electroporation-induced+transformation+of+intact+cells+of+Clostridium+perfringens.">Electroporation-induced transformation of intact cells of Clostridium perfringens.</a> Appl. Environ. Microbiol. 54, 2322-2324 (1988).</li><li>Belliveau, B. H., Trevors, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transformation+of+Bacillus+cereus+vegetative+cells+by+electroporation.">Transformation of Bacillus cereus vegetative cells by electroporation.</a> Appl. Environ. Microbiol. 55, 1649-1652 (1989).</li><li>Chassy, B. M., Flickinger, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transformation+of+Lactobacillus+casei+by+electroporation.">Transformation of Lactobacillus casei by electroporation.</a> FEMS Microbiol. Lett. 44, 173-177 (1987).</li><li>Dunny, G. M., Lee, L. N., LeBlanc, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+electroporation+and+cloning+vector+system+for+gram-positive+bacteria.">Improved electroporation and cloning vector system for gram-positive bacteria.</a> Appl. Environ. Microbiol. 57 (4), 1194-1201 (1991).</li><li>Micheletti, P. A., Sment, K. A., Konisky, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+a+coenzyme+M-auxotrophic+mutant+and+transformation+by+electroporation+in+Methanococcus+voltae.">Isolation of a coenzyme M-auxotrophic mutant and transformation by electroporation in Methanococcus voltae.</a> J. Bacteriol. 173 (11), 3414-3418 (1991).</li><li>Schleper, C., Kubo, K., Zillig, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+particle+SSV1+from+the+extremely+thermophilic+archaeon+Sulfolobus+is+a+virus:+demonstration+of+infectivity+and+of+transfection+with+viral+DNA.">The particle SSV1 from the extremely thermophilic archaeon Sulfolobus is a virus: demonstration of infectivity and of transfection with viral DNA.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 89 (16), 7645-7649 (1992).</li><li>Aune, T. E., Aachmann, F. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methodologies+to+increase+the+transformation+efficiencies+and+the+range+of+bacteria+that+can+be+transformed.">Methodologies to increase the transformation efficiencies and the range of bacteria that can be transformed.</a> Appl. Microbiol. Biotechnol. 85 (5), 1301-1313 (2010).</li><li>Hanahan, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studies+on+transformation+of+Escherichia+coli+with+plasmids.">Studies on transformation of Escherichia coli with plasmids.</a> J. Mol. Biol. 166, 557 (1983).</li><li>Unterweger, D., Kitaoka, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Constitutive+Type+VI+Secretion+System+Expression+Gives+Vibrio+cholerae+Intra-+and+Interspecific+Competitive+Advantages.">Constitutive Type VI Secretion System Expression Gives Vibrio cholerae Intra- and Interspecific Competitive Advantages.</a> PLoS One. 7 (10), e48320 (2012).</li></ol>

Нет раскрытие не применимы.

Эффективность трансформации зависит от множества факторов, независимо от метода, используемого для подготовки компетентных клеток. Аналогичные переменные относятся к этому методу; большое внимание должно быть принято, что как только клетки собирают из агаровой пластине так, что они поддерживают на постоянном низкой температуре (не выше 4 ° C). Бактериальный газон должен быть активно растущий на момент сбора; клетки должны быть в середине логарифмической фазы роста. Качество ДНК (то есть загрязнения солей) влияет эффективность трансформации. В частности, при использовании этого метода агар не должны быть разбиты как агар фрагменты в кювете будет вызывать искрение импульса. Большинство проблем, с которыми сталкиваются с этой техникой связаны с двумя вопросами; сбора бактерий в течение надлежащего времени окна с агаром, когда они активно расти. Собирать их слишком рано даст недостаточное количество клеток и окажетсоскабливания на LB агар пластины разочарование, потому что &quot;pellicule&quot; они образуют трудно поднять с поверхности пластины. Коллекционирование бактерии слишком поздно уменьшится их компетентности резко. Окно времени, естественно, будет варьироваться в зависимости от плотности инокулята высевали на чашки с агаром LB. Второй важный шаг, чтобы сохранить бактерии холодной (4 ° С) с момента их стартовал агара тарелку и ресуспендировали в CaCl 2 или DDH 2 O, пока они не высевают на агар LB следующие преобразования. Микроцентрифуге трубки, содержащие бактерии, кюветы и буфер должен быть предварительно охлажден и выдерживали на льду в любое время до тех пор, пока бактерии высевали. Тем не менее, дополнительные проблемы могут возникнуть, когда стерильной DDH 2 O или CaCl 2 содержат осадок или загрязненные. По этой причине мы рекомендуем подготовить этот реагент свежим. Преобразование и устранение неисправностей способствует в том числе управления при преобразовании баcteria правомочность любым способом. Отрицательный контроль состоящий из выпечки нетрансформированных компетентных бактерий высевали на чашке с агаром LB, содержащей селективный маркер будет быстро помочь определить, является ли эффективным антибиотиком на тарелке. Позитивная трансформация управления с известного препарата плазмиды хорошего качества и количества, несущего такую ​​же селективный маркер как экспериментального образца будут полезны в определении того, бактерии являются компетентными, но и был ли экспериментальная ДНК преобразуется достаточным по количеству и качеству. Преимущества этого метода заключаются в несколько; метод может осуществляться в тот же день, что преобразование запланировано на. Мы обнаружили, что замороженные бактериальная запаса глицерина может быть покрытием непосредственно на агар LB без потери в electrocompetence, мы сделали это в ситуациях «чрезвычайных» (забыв начать ночной культуры накануне). Хотя мы не могли проверить еочень штамм известно, все бактерии E. палочка или В. вибрион штамм, который может быть преобразован путем электропорации был поддаются этому протоколу в наших руках. Методика является быстрым, эффективным и эффективность преобразования дает сопоставимы с результатами, полученными от подготовки Электрокомпетентные бактерии, использующие традиционные методы. Метод устраняет необходимость высокоскоростной центрифуге и связанных роторов, орбитальном инкубаторе шейкере и стерильных ведра центрифуг (контейнеры), и больших объемов автоклавного буфера. Хотя Таблица специфических реагентов и оборудования является довольно полной, большинство лабораторий, которые осуществляют электропорации будет иметь большинство, если не все, из этих материалов уже имеющихся. Возможно, наиболее важно то, что методика может быть легко применен к генерации Электрокомпетентные штаммов лабораторных конкретного мутанта с фоном быстро. Мы не знают о каких-либо ограничений этой техники, как он заменил традиционный метод подготовки электроновtrocompetent бактерии в наших лабораториях. Результаты наших экспериментов, представленных здесь проводились со свежими электрокомпетентных клеток, полученных с традиционным методом, которые хранились при температуре -80 ° С в течение не более 1 недели. Тем не менее, замороженные запасы Электрокомпетентные клеток теряют компетентность и или жизнеспособности в течение длительных периодов хранения. Наша сокращенный протокол допускает получение свежих электрокомпетентных клеток в тот же день преобразование планируется без опасений по поводу возраста складе, который может привести к снижению урожайности трансформированного. Мы не пытались хранения Электрокомпетентные клетки, произведенные с использованием быстрый метод для использования на другой день, так как это не было необходимости. Хотя это и не показано здесь, эффективность электрокомпетентных клеток получали с использованием наша быстрый метод является достаточным для лигирования смеси. Преобразования сообщили за неисполнение O1 V. вибрион в недавней статье Unterweger др..17 проводились с использованием Электрокомпетентные бактерий, приготовленные по способу, описанному здесь (за исключением тех осуществляется путем конъюгации). Этот метод дает исследователям превратить штаммы с мутантных фонов быстро и эффективно, без необходимости приготовление больших партий клеток. Это быстрое приготовление электрокомпетентные методом бактерий могут быть адаптированы к другим прокариот, которые были показаны на поддаваться электропорации, как принцип подготовки и настройки электропорации будут такими же, как традиционных протоколов.

С момента своего &quot;создания в начале 1980-х 1, электропорации стала неотъемлемой техника молекулярной биологии, вероятно, самый распространенный метод, используемый для преобразования / трансфекции живые клетки с круглыми или линейных нуклеиновых кислот. Изначально разработанный для трансфекции эукариотических клеток 1, электропорацию был впоследствии адаптирован для трансформации E. палочка 2, 3. В бактериологии, электропорацию стал лабораторный стандарт и был изменен, чтобы трансформировать широкий спектр бактерий, включая грамотрицательных Pseudomonas 4, 5 сальмонелл, вибрионов 6, Serratiae и шигелл 7; грамположительных клостридии 8, 9 Bacilli, лактобациллы 10 и энтерококки 11. Даже некоторые археобактерий доказали поддаются трансформации путем электропорации, в том числе Methanococci </EM&gt; 12 и Sulfolobus видов 13. Для всестороннего обзора см. Aune и Aachmann 14. Эффективность преобразования путем электропорации, как сообщается, в 10-20 раз выше, чем химической компетенции или теплового шока 2. Однако, как готовится бактерии для химической компетенции, оптимизированы Дугласом Hanahan в 1980-е годы 15, клетки должны также быть готовы быть Электрокомпетентные. Электропорация является быстрым и эффективным средством бактериальной трансформации, требуя Электрокомпетентные бактерии, очищенную ДНК, модуль управления импульса, которая обеспечивает электрический импульс, и камеру, которая вмещает небольшие одноразовые кюветы, которые функционируют в качестве электрода. Вкратце, холод, компетентные бактерии смешивают с плазмидной ДНК, подвергнутой импульса высокого напряжения в кювете, ресуспендировали в ростовой среде, инкубировали при 30-37 ° С в течение 30-45 мин, а затем высевали на полутвердой среде (питательный агар пластины) с окopriate селективный антибиотик. В отличие от пульсирующего шага, подготовки электрокомпетентные Е. палочка остается составным процедура, которая традиционно проводится в больших объемах. Вкратце, ночной культуры бактерий инокулировали в колбу Эрленмейера с 100 мл до 1 л Luria Broth (LB), выращенных в середине логарифмической фазе роста (OD 600 &lt;1,0) и подвергают последовательных промывок с Нестерильно -ионной буфера или дважды дистиллированной воды (DDH 2 O) в снижении объемов при 4 ° С. Большое внимание должно быть принято, чтобы сохранить клетки холодно в течение всей процедуры и предотвращения загрязнения. Это требует использования автоклавного центрифугирования ведрами и неионных буферами или DDH 2 O, орбитальный шейкер-инкубатор, большой объем высокоскоростной охлаждаемой центрифуге и набор роторов. Бактерии, наконец ресуспендировали в небольшом объеме буфера с добавлением 10% глицерина и аликвоты в ~ 40 мкл объемы, белыйICH хранятся при -80 ° С до использования. Низкотемпературного хранения часто приводит к снижению эффективности преобразования из-за потери жизнеспособности в течение долгого времени. Электрокомпетентные бактериальные клетки, также доступны из различных коммерческих источников, но только для ограниченного числа (часто рекомбинации с дефицитом) E. штаммы палочки, обычно используемые в качестве хозяев для распространения широкий спектр плазмид. В результате исследователи полагаются на внутренние методы, чтобы подготовить свои собственные штаммы / мутантов для трансформации. Альтернативный, быстрый и эффективный протокол для приготовления электрокомпетентные Е. палочка была в использовании по несколько лабораторий молекулярной бактериологических в течение некоторого времени и был продлен на дополнительные грамотрицательных бактерий, в нашем случае В. вибрион. Виновник протокола не могут быть идентифицированы, поскольку это была оптимизирована другими исследователями в течение долгого времени. Метод, представленный здесь был использован в нашей laboratořх годов в течение почти двух десятилетий, и это наша цель, чтобы поделиться этой полезной протокол с нашими коллегами.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Name of the Equipment</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalogue number</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gene Pulser Module</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>165-2668</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gene Pulser Cuvette Chamber</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>165-2669</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electrocuvettes (0.2 cm gap)</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>165-2082</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>13 x 100 mm Pyrex Rimless Culture Tubes</td>
			<td>Corning</td>
			<td>70820-13</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>13 mm Culture Tube Closures</td>
			<td>Cole Parmer</td>
			<td>EW-04500-00</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6 x 250 mm Glass Rod</td>
			<td>Lab Source</td>
			<td>11381D</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable Petri Dishes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>08-757-12</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Roller Drum Motor Assembly</td>
			<td>New Brunswick Scientific</td>
			<td>M1053-4004</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Roller Drum for 13 x 100 mm Culture Tubes</td>
			<td>New Brunswick Scientific</td>
			<td>M1053-0306</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride</td>
			<td>Sigma Chemicals</td>
			<td>C5670</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol, anhydrous/denatured</td>
			<td>Sigma Chemicals</td>
			<td>227649</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inoculating Loop</td>
			<td>Decon Labs</td>
			<td>MP182-5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Refrigerated Microcentrifuge 5451 R</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>22621425</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bunsen Burner</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>03-917Q</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB Broth MILLER</td>
			<td>EMD</td>
			<td>1.10285.0500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacteriological Agar</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S25127</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

rapid protocol for preparation of electrocompetent escherichia coli and vibrio cholerae

Электропорации стала широко используемый метод для быстрого и эффективного введения чужеродной ДНК в широком диапазоне клеток. Electrotransformation стала методом выбора для введения ДНК в прокариот, которые, естественно, не компетентны. Электропорации является быстрое, эффективное и обтекаемый метод трансформации, что, в дополнение к очищенной ДНК и компетентных бактерий, требует коммерчески доступный ген контроллер импульса и кюветы. В отличие от шага пульсирующей, подготовка электрокомпетентных клеток занимает много времени и трудоемким участием неоднократные вспышки центрифугирования и промывки в уменьшении объемов стерильной холодной водой, или неионные буферов больших объемов культур, выращенных в середине логарифмической фазе рост. Время и усилия могут быть сохранены при покупке Электрокомпетентные клетки из коммерческих источников, но выбор ограничен, обычно используемые E. палочки лабораторные штаммы. Мы настоящим распространения быстрое иЭффективный метод подготовки Электрокомпетентные E. палочка, которая была в использовании по бактериологических лабораторий в течение некоторого времени, могут быть адаптированы к В. вибрион и другие прокариоты. Хотя мы не можем установить, кому кредит для развития оригинальную технику, мы настоящим делая его доступным для научного сообщества.

Мы провели ряд преобразований с Е. палочка и В. вибрион сравнить эффективность трансформации нашего быстрого методологии с адаптации метода (традиционной), впервые описанного Dower др.. 2 для подготовки электрокомпетентных бактерий. Для проведения традиционной подготовки компетентных клеток 500 мл LB в 2 л колбу Эрленмейера-инокулировали 500 мкл ночной культуры E. палочка DH5α или В. вибрион O395, инкубировали в орбитальном шейкере (215 оборотов в минуту при 37 ° С) и собирают при OD 600 в интервале 0,5-1,0. Колбу охлаждают на льду и культуры центрифугируют в предварительно охлажденной ротора при 4000 х г в течение 10 мин при 4 ° С. Клеточные осадки тщательно ресуспендируют в 500 мл охлажденного льдом 2 мМ CaCl 2 на V. вибрион и DDH 2 O для Е. палочка, и снова центрифугировали при тех же условиях. Последующие раунды ресуспендирующего апд центрифугирование проводили в уменьшении объемов 200 и 100 мл объемы убедившись, что культура оставалась охлажденной при 4 ° С. Наконец, ресуспендирования и центрифугирования в объеме 10 мл проводили с 10% глицерина. Конечный осадок ресуспендировали в 2 мл 10% глицерина и 40 мкл аликвоты были заморожены при -80 ° С и хранили не дольше, чем за одну неделю до электропорации. Условия электропорации в том числе импульсных установок и размер кюветы были идентичны для обоих видов бактерий во всех electroporations независимо от способа получения компетентных клеток. Разница была лишь в том, что мы выполняли моет в холодной DDH 2 O для Е. палочка и холодной 2 мМ CaCl 2 для V. вибрион. Таблица 1 показывает результаты бактерии, трансформированные путем электропорации одинаково, но оказанные компетентным либо с быстрым протоколом или с традиционным методом. Мы использовали штамм O395 и DH5α так часто,лы, используемые, представительства штаммы V. вибрион и Е. палочка соответственно; аналогичные результаты могут быть получены с другими штаммами тех же видов (хотя и не каждый штамм был протестирован) и, вероятно, адаптированы к другим грамотрицательных бактерий и, возможно, за ее пределами. Чтобы гарантировать, что равное количество клеток присутствовали в каждой партии импульсного, Электрокомпетентные бактерии, полученные используя быстрый метод, объединяли после погашения, смешанные, продолжал равномерно приостановлено, и аликвоты в 40 мкл объемы незадолго до электропорации. Электрокомпетентные бактерии, созданные использующие традиционный метод, обрабатывали аналогичным перед замораживанием в 40 мкл аликвоты. После родов импульса, каждая партия 40 мкл электропорированные бактерий было приостановлено в 400 мкл LB и серийно разводили 1:10. Сто мкл каждого разведения высевали на LB-агаре в присутствии 100 мкг / мл ампициллина и распространение с использованием стерильной стекло клеток распределительи инкубировали при 37 ° С в течение ночи. Для количественной оценки общего количества бактерий, используемых в каждой трансформации, 40 мкл объемы электрокомпетентных бактерий каждого подготовленной порции серийно разводили и высевали на LB-агар без антибиотиков одинаково параллельно. Один Аликвота одинаково обработанных бактерий из каждой партии электропорировали с 1 мкл Трис-ЭДТА (ТЕ) буфер, но без ДНК (макет преобразование), серийно разведенной и высевали на LB агар без антибиотиков для оценки количества клеток, потерянных на поставку электрический импульс. И, наконец, еще один вариант для эксперимента проводили для определения того, 30 мин инкубации при 37 ° С в 1 мл LB после электропорации но до посева на LB-агар повлияет на восстановление трансформированных клеток. колониеобразующих единиц (КОЕ) были перечислены на следующий день. Для этого эксперимента мы использовали pUC18, общий лабораторный плазмиды, и партии компетентных бактерий, состоящий изpproximately 10 8 КОЕ для клеток получают, используя традиционный метод и 10 7 КОЕ для клеток, полученных с использованием быстрого протокол. Одна Электропорацию (без ДНК) уменьшается жизнеспособных КОЕ на 10-100 раз независимо от метода, используемого для получения Электрокомпетентные клетки. Как показано в таблице 1, трансформант выход был в пределах 10 6 -10 7 КОЕ / мкг ДНК в диапазоне трех повторных экспериментов (стандартные отклонения в скобках) для Е. палочка (DH5α) и В. вибрион (O395) соответственно с использованием традиционного, более длительная метод электрокомпетентные клеточного препарата. Трансформант выход появился уменьшенный в 10 раз до 10 5 -10 6 КОЕ / мкг ДНК в трех повторных экспериментов (стандартное отклонение в скобках) для Е. палочка и В. вибрион соответственно с помощью экспресс-методу. По этой причине мы определили процент трансформированных бактерий путем деления трансформированных КОЕна число КОЕ извлекают из &quot;ложный преобразований&quot; (без плазмиды) от других идентичных партий компетентных клеток. Процент трансформированных бактерий было в течение одного журнала (2.5-9.4%), независимо от способа приготовления и видов трансформированных (Таблица 1 номера в скобках). Эти результаты показывают, что эффективность метода быстрого сравнима с традиционной более длительного порядке подготовки компетентных клеток и что представитель штаммы холерных и кишечной палочки в равной степени поддаются быстрой процедуры. Мы обнаружили, что эффективность трансформации, для плазмид, как pUC18 укрывательство β-лактамаз кассеты, не влияет на 30 мин времени восстановления в LB бульоне. Такое же количество трансформантов выдел ли, были ли клетки высевали на LB-агаре в присутствии ампициллина непосредственно после электропорации или им было позволено ли на 30-45 минут время восстановленияв LB бульоне при 37 ° С до обшивки. Наши выводы, что устойчивости к ампициллину не требует вырост под неселективных условиях предполагает, что выражение β-лактамазы происходит достаточно быстро при трансформации. Тем не менее, следует отметить, что мы провели серийных разведений импульсных бактерий в LB бульоне, который может способствовать восстановлению от поражения электрическим током и инициировать экспрессию генов. <img alt="Рисунок 1" src="/files/ftp_upload/50684/50684fig1.jpg" /> Рисунок 1. Графическое изображение методологии быстрого приготовления электрокомпетентных бактерий. После 4-6 ч (в зависимости от плотности инокулята) достаточное количество бактерий может быть собрана для выполнения 5:56 преобразования из одного LB агаром. Для обеспечения равного количества компетентных клеток для каждого конечного объема быть электропорации, бактерии, собранные из чашки с агаром LB, были первоначально объединены вместе и промывают затем др.iquoted в 40 мкл объемы в зависимости от размера гранул (более крупные гранулы разводили в больших объемах, кратных 40 мкл). <table border="1"><tbody><tr><td colspan="3"> Количество Устойчивые к ампициллину трансформанты / мкг ДНК (Устойчивые к ампициллину трансформанты восстановлены [%]) </td></tr><tr><td> Штамм </td><td> Традиционный метод </td><td> Скоростной метод </td></tr><tr><td> Кишечная палочка (DH5α) </td><td> 2,3 х 10 6 (± 7,3 × 10 5) [9.4%] </td><td> 3 × 10 6 (± 7,1 × 10 5) [2,5%] </td></tr><tr><td> В. вибрион (O395) </td><td> 4 х 10 7 (± 1,7 х 10 7) [5%] </td><td> 6,7 х 10 5 (± 2,1 × 10 5) [3.3%] </td></tr></tbody></table> Таблица 1. Эффективность трансформации на микрограмм ДНК (pUC18) из электрокомпетентные бacteria получают путем традиционного метода по сравнению с быстрым методом. Все преобразования проводились с 500 нг ДНК pUC18 (~ 80% суперспиральной ДНК, визуализировали путем электрофореза в 1% агарозном геле) и электропорации клетки серийно разводили в 10 раз в LB бульоне до покрытие для КОЕ на LB-агаре с антибиотиками. Управление не-электропорации бактерий и бактерий электропорации без плазмиды, серийно разводили и высевали на LB-агар без антибиотиков проводили для каждого набора преобразований, чтобы определить общее количество жизнеспособных бактерий до и после пульсирует. Электропорированные управления представлены базовую линию для процента жизнеспособных бактерий успешно трансформированных.

Watch this Scientific Journal Video about Rapid Protocol for Preparation of Electrocompetent Escherichia coli and Vibrio cholerae at JoVE.com

Rapid Protocol for Preparation of Electrocompetent Escherichia coli and Vibrio cholerae

Быстрое Протокол по подготовке Электрокомпетентные<em&gt; Кишечная палочка</em&gt; И<em&gt; Холерный вибрион</em

Электропорации является обычно используют метод для введения ДНК в бактерии в процессе, известном как трансформации. Традиционные протоколы для подготовки электрокомпетентных клеток много времени и трудоемким. В этой статье описывается очередные, быстрое и эффективный метод подготовки электрокомпетентных клеток в настоящее время работающих в некоторых лабораториях.

Electroporation has become a widely used method for rapidly and efficiently introducing foreign DNA into a wide range of cells. Electrotransformation has ...

Research

JoVE Journal

Biology

Rapid Protocol for Preparation of Electrocompetent Escherichia coli and Vibrio cholerae

Vibrio cholerae: Model Organism to Study Bacterial Pathogenesis - Interview

Холерный вибрион: Модель Организм по изучению бактериальных Патогенез - Интервью

An Assay for Measuring the Activity of Escherichia coli Inducible Lysine Decarboxyase

An Assay for Measuring the Activity of Escherichia coli Inducible Lysine Decarboxyase

Тест для измерения активности Кишечной палочки Индуцибельной Лизин Decarboxyase

Escherichia coli is an enteric bacterium that is capable of growing over a wide range of pH values (pH 5 - 9)1 and, incredibly, is able to survive extreme ...

High Throughput Screening of Fungal Endoglucanase Activity in Escherichia coli

High Throughput Screening of Fungal Endoglucanase Activity in Escherichia coli

Высокопроизводительного скрининга грибной активность в эндоглюканазы Кишечной палочки</em

Cellulase enzymes (endoglucanases, cellobiohydrolases, and &beta;-glucosidases) hydrolyze cellulose into component sugars, which in turn can be converted ...

Mapping Bacterial Functional Networks and Pathways in Escherichia Coli using Synthetic Genetic Arrays

Mapping Bacterial Functional Networks and Pathways in Escherichia Coli using Synthetic Genetic Arrays

Сопоставление бактериальных функциональных сетей и путей в<em&gt; Escherichia Coli</em&gt; Использование синтетических генетических массивы

Phenotypes  are determined by a complex series of physical (e.g. protein-protein) and  functional (e.g. gene-gene or genetic) interactions (GI)1. While ...

Protocols for Implementing an Escherichia coli Based TX-TL Cell-Free Expression System for Synthetic Biology

Protocols for Implementing an Escherichia coli Based TX-TL Cell-Free Expression System for Synthetic Biology

Протоколы для Реализация<em&gt; Кишечная палочка</em&gt; На основании TX-TL Cell-СВОБОДА СЛОВА Система синтетической биологии

Ideal cell-free expression systems can theoretically emulate an in vivo cellular environment in a controlled in vitro platform.1 This is useful for ...

Detection of Live Escherichia coli O157:H7 Cells by PMA-qPCR

Detection of Live Escherichia coli O157:H7 Cells by PMA-qPCR

Обнаружение эфир<em&gt; Кишечная палочка</em&gt; O157: H7 Клетки по PMA-кПЦР

A unique open reading frame (ORF) Z3276 was identified as a specific genetic marker for E. coli O157:H7. A qPCR assay was developed for detection of E. ...

Optimized Protocol for Retinal Wholemount Preparation for Imaging and Immunohistochemistry

Working with delicate tissue can be a complicating factor when performing immunohistochemical assessment. Here, we present a method that utilizes a ...

Non-chromatographic Purification of Recombinant Elastin-like Polypeptides and their Fusions with Peptides and Proteins from Escherichia coli

Non-chromatographic Purification of Recombinant Elastin-like Polypeptides and their Fusions with Peptides and Proteins from Escherichia coli

Номера хроматографической очистки рекомбинантного Эластин-подобных полипептидов и их слияний с пептидов и белков с<em&gt; Кишечная палочка</em

Elastin-like polypeptides are repetitive biopolymers that exhibit a lower critical solution temperature phase transition behavior, existing as soluble ...

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

Зеленый флуоресцентный белок на основе Expression Скрининг мембранных белков в<em&gt; Кишечная палочка</em

The production of recombinant membrane proteins for structural and functional studies remains technically challenging due to low levels of expression and ...

The Multifaceted Benefits of Protein Co-expression in Escherichia coli

The Multifaceted Benefits of Protein Co-expression in Escherichia coli

Многогранная Преимущества белка ко-экспрессия в<em&gt; Кишечная палочка</em

We report here that the expression of protein complexes in vivo in Escherichia coli can be more convenient than traditional reconstitution experiments in ...