Name: rapid protocol for preparation of electrocompetent escherichia coli and vibrio cholerae
Uploaded: 2013-10-08T18:30:00
Duration: 7 min 10 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Rapid Protocol for Preparation of Electrocompetent Escherichia coli and Vibrio cholerae at JoVE.com

Författarna är tacksamma till sina kollegor och personal av nuvarande och tidigare laboratorier som har stött utvecklingen av denna teknik. SP: s laboratorium stöds av det kanadensiska institutet för hälsoforskning Drift Grant MOP-84.473 och Alberta Innovates-Health Solutions (som finansieras av Alberta Heritage Foundation för medicinsk forskning Endowment Fund). UP stöddes av National Institutes of Health bidrag MD001091-01 och GM068855-02.

1. Framställning av bakteriekulturer, verktyg, och reagens (DAG 1, eftermiddag) <ol><li> Sent på eftermiddagen, ympa 1-5 ml autoklaveras LB buljong i steril (t.ex. 100 x 13 mm) borosilikatglas provrör med en liten portion av bakterier (E. coli eller V. cholerae). </li><li> Ställ de ympade provrör i en rulltrumma inhyst vid 37 ° C temperatur (varmt rum eller inkubator), slå på rulltrumman i hög hastighet, och inkubera O / N. </li><li> Bered en cellspridare i form av en &quot;hockeyklubba&quot; från en glasstav genom uppvärmning av mitten av stången i lågan från en bunsenbrännare tills glaset mjuknar och sedan direkt böjen försiktigt med en pincett eller tång in i en 135 ° vinkel . Värm stången en gång i mittpunkten mellan änden och den första böjen och böj den i 45 ° vinkel inåt (i motsatt riktning mot den första kurvan). </li><li> Förbered LB-agar utan antibiotika och häll i petriskålar i utarbetandet avelectrocompetence protokollhanterarna, och LB-agarplattor innehållande lämpligt antibiotikum (enligt den resistensmarkör på vektorn som ska elektroporeras) och lagra vid 4 ° C. </li><li> Förbered en filtersteriliserad 2 mM CaCl2-lösning för V. cholerae, eller autoklav DDH 2 O för E. coli, och förvara vid 4 ° C. </li></ol> 2. Tillväxt av elektro Bakterier (DAG 2, Morgon) <ol><li> Deliver 100 pl av O / N bakteriekultur till varje LB-agarplatta, kan frusna glycerolstamlösningar också användas och levereras direkt på plattan. </li><li> Doppa hockeyklubba formade cell spridare i 100% EtOH, kort dränera och bränna bort den kvarvarande EtOH för att sterilisera den före användning och spridning. Sprid 100 ^ O / N bakteriekultur jämnt med den sterila glascell spridare se till att inte störa (paus) agarytan. </li><li> Inkubera plattan vid 37 ° C under 4-6 timmar, eller till dess att en tunn matta av bakteriell tillväxt varakommer urskiljbara. Celler är mest kompetent när aktiv tillväxt. </li></ol> 3. Beredning av elektrobakterieceller (DAG 2, Eftermiddag) <ol><li> Skörda bakterierna med en steril inokulering slinga och se till att inte punkteras eller bryta ytan av agar. Ett 2 mm diameter bakteriell massa är tillräcklig för en enda transformation. Normalt kräver detta skrapning på ytan av den tunna gräsmatta med inokulering slinga två eller tre gånger. Flera prover (vanligtvis mellan 4-6) kan samlas in från samma tallrik. </li><li> Resuspendera bakteriemassan i 1 ml iskall 2 mM CaCl2 (för V. cholerae) eller steril DDH 2 O (för E. coli) och blanda väl tills inga klumpar är synliga, hålla på is. </li><li> Centrifugera varje bakteriesuspension i 5 min vid 5000 x g i en kyld mikrocentrifug inställt på 4 ° C, eller i en mikrocentrifug lagras i ett kallt rum inställt på 4 ° C. </li><li> Kasta bort supernatanten, resuspavsluta den bakteriella pelleten i samma volym iskall 2 mM CaCl2 eller steril DDH 2 O, och upprepa centrifugeringssteget som gjort tidigare två gånger för totalt tre tvättar. </li><li> Avlägsna supernatanten, resuspendera, och sedan lossa den bakteriella pelleten noggrant i 40 pl iskall 2 mM CaCl2 eller steril DDH 2 O och hålla på is. </li></ol> 4. Transformation av elektro Bakterier (DAG 2, Eftermiddag) <ol><li> Lägg till upp till 1 mikrogram av plasmid-DNA (i upp till 1 l vatten eller Tris-EDTA-buffert) till 40 ^ bakteriesuspensionen och överföra denna blandning i en pre-kyld, steril 0,2 cm gap kyvett. Saltkoncentrationen i DNA-provet måste vara låg, eftersom den kommer att bidra till Ijusbågsbildning av pulsen i nästa steg. </li><li> Sätt i kyvetten i elektroporation kammare av pulskontrollmodulen, och electroporate vid 1,8 kV, 25 mF. Tidskonstanten bör vara ~ 5,0 msek och ingen gnistbildning bör ske. </li><li> Snabbt återställa cellsuspensionen genom återsuspendering i 1 ml LB buljong och överför till tidigare autoklaveras borosilikatglas provrör. </li><li> Låt cellerna att återhämta sig genom inkubation enligt kolsyrat tillväxtbetingelser (i en valstrumma) vid 37 ° C under 30 min utan antibiotikaselektion. </li><li> Plåt bakterierna på den tidigare framställda LB-agarplattor i närvaro av det lämpliga selektiva medlet (antibiotika) och inkubera vid 37 ° CO / N. Om bakterier transformeras med en hög koncentration av renat vektor (0,1-1 ng supertvinnad plasmid), levererar 10 | il av bakteriekulturen till kanten på LB-agarplatta och med en steril inokulering slinga strimma för isolerade kolonier med användning av kvadranten strimma metoden. Om en Ligeringsblandningen transformerades, leverera 100 | il av bakteriekulturen på varje agarplatta och jämnt sprida det med den steriliserade glascell spridare. </li></ol> a Om tidskonstanten är kort (varalåg 3,5 ms), eller pulsning leder till överslag, sedan åter fälla ut DNA-provet, tvätta med 70% EtOH två gånger för att avlägsna salter före torkning och återsuspendering i TE-buffert.

<ol>
	<li>Neumann, E., Schaefer-Ridder, M., Wang, Y., Hofschneider, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+transfer+into+mouse+lyoma+cells+by+electroporation+in+high+electric+fields.">Gene transfer into mouse lyoma cells by electroporation in high electric fields.</a> EMBO J. 1 (7), 841-845 (1982).</li><li>Dower, W. J., Miller, J. F., Ragsdale, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+efficiency+transformation+of+E.+coli+by+high+voltage+electroporation.">High efficiency transformation of E. coli by high voltage electroporation.</a> Nucleic Acids Res. 16 (13), 6127-6145 (1988).</li><li>Taketo, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+transfection+of+Escherichia+coli+by+electroporation.">DNA transfection of Escherichia coli by electroporation.</a> Biochim. Biophys. Acta. 949 (3), 318-324 (1988).</li><li>Fiedler, S., Wirth, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transformation+of+bacteria+with+plasmid+DNA+by+electroporation.">Transformation of bacteria with plasmid DNA by electroporation.</a> Anal. Biochem. 170 (1), 38-44 (1988).</li><li>O'Callaghan, D., Charbit, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+efficiency+transformation+of+Salmonella+typhimurium+and+Salmonella+typhi+by+electroporation.">High efficiency transformation of Salmonella typhimurium and Salmonella typhi by electroporation.</a> Mol. Gen. Genet. 223 (1), 156-158 (1990).</li><li>Hamashima, H., Nakano, T., Tamura, S., Arai, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+transformation+of+Vibrio+parahaemolyticus,+Vibrio+alginolyticus,+and+Vibrio+cholerae+non+O-1+with+plasmid+DNA+by+electroporation.">Genetic transformation of Vibrio parahaemolyticus, Vibrio alginolyticus, and Vibrio cholerae non O-1 with plasmid DNA by electroporation.</a> Microbiol. Immunol. 34 (8), 703-708 (1990).</li><li>Grones, J., Turna, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transformation+of+microorganisms+with+the+plasmid+vector+with+the+replicon+from+pAC1+from+Acetobacter+pasteurianus.">Transformation of microorganisms with the plasmid vector with the replicon from pAC1 from Acetobacter pasteurianus.</a> Biochem. Biophys. Res. Commun. 206 (3), 942-947 (1995).</li><li>Allen, S. P., Blaschek, H. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electroporation-induced+transformation+of+intact+cells+of+Clostridium+perfringens.">Electroporation-induced transformation of intact cells of Clostridium perfringens.</a> Appl. Environ. Microbiol. 54, 2322-2324 (1988).</li><li>Belliveau, B. H., Trevors, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transformation+of+Bacillus+cereus+vegetative+cells+by+electroporation.">Transformation of Bacillus cereus vegetative cells by electroporation.</a> Appl. Environ. Microbiol. 55, 1649-1652 (1989).</li><li>Chassy, B. M., Flickinger, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transformation+of+Lactobacillus+casei+by+electroporation.">Transformation of Lactobacillus casei by electroporation.</a> FEMS Microbiol. Lett. 44, 173-177 (1987).</li><li>Dunny, G. M., Lee, L. N., LeBlanc, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+electroporation+and+cloning+vector+system+for+gram-positive+bacteria.">Improved electroporation and cloning vector system for gram-positive bacteria.</a> Appl. Environ. Microbiol. 57 (4), 1194-1201 (1991).</li><li>Micheletti, P. A., Sment, K. A., Konisky, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+a+coenzyme+M-auxotrophic+mutant+and+transformation+by+electroporation+in+Methanococcus+voltae.">Isolation of a coenzyme M-auxotrophic mutant and transformation by electroporation in Methanococcus voltae.</a> J. Bacteriol. 173 (11), 3414-3418 (1991).</li><li>Schleper, C., Kubo, K., Zillig, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+particle+SSV1+from+the+extremely+thermophilic+archaeon+Sulfolobus+is+a+virus:+demonstration+of+infectivity+and+of+transfection+with+viral+DNA.">The particle SSV1 from the extremely thermophilic archaeon Sulfolobus is a virus: demonstration of infectivity and of transfection with viral DNA.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 89 (16), 7645-7649 (1992).</li><li>Aune, T. E., Aachmann, F. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methodologies+to+increase+the+transformation+efficiencies+and+the+range+of+bacteria+that+can+be+transformed.">Methodologies to increase the transformation efficiencies and the range of bacteria that can be transformed.</a> Appl. Microbiol. Biotechnol. 85 (5), 1301-1313 (2010).</li><li>Hanahan, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studies+on+transformation+of+Escherichia+coli+with+plasmids.">Studies on transformation of Escherichia coli with plasmids.</a> J. Mol. Biol. 166, 557 (1983).</li><li>Unterweger, D., Kitaoka, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Constitutive+Type+VI+Secretion+System+Expression+Gives+Vibrio+cholerae+Intra-+and+Interspecific+Competitive+Advantages.">Constitutive Type VI Secretion System Expression Gives Vibrio cholerae Intra- and Interspecific Competitive Advantages.</a> PLoS One. 7 (10), e48320 (2012).</li></ol>

Inga avslöjanden kommer.

Transformationseffektivitet är föremål för en mängd olika faktorer, oavsett den metod som användes för att framställa kompetenta celler. Analoga variabler gäller för denna metod, stor försiktighet måste iakttas så att när cellerna skördas från agarplatta så att de hålls vid konstant låg temperatur (högst 4 ° C). Bakterie gräsmatta måste aktivt växande vid tiden för insamlingen, celler måste vara i mitten av logaritmisk tillväxtfas. Kvalitet på DNA (dvs förorening av salter) påverkar omvandlingseffektiviteten. Specifikt, när man använder denna metod, agar bör inte brytas såsom agar-fragment i kyvetten orsakar Ijusbågsbildning av pulsen. De flesta problem med denna teknik är förknippade med två frågor, samla in bakterierna under rätt tidsfönster från agarplatta när de aktivt växer. Samla dem för tidigt kommer att ge tillräckligt cell nummer och kommer att göra detskrapa bort LB-agarplatta frustrerande eftersom &quot;pellicule&quot; bildar de är svåra att lyfta bort från ytan av plattan. Samla bakterier för sent kommer att minska sin kompetens dramatiskt. Den tidsfönster kommer naturligtvis att variera beroende på densiteten hos ympen pläterades på LB-agarplattor. Det andra viktiga steget är att hålla bakterierna kallt (4 ° C) från det ögonblick de lyfts bort agarplattan och suspenderades i CaCl2 eller DDH 2 O tills de är pläterade på LB-agar efter transformation. De mikrofugrör innehåller bakterierna, kyvetter och buffert bör vara pre-kylda och hålls på is hela tiden tills bakterierna stryks. Däremot kan ytterligare problem uppstå när det sterila DDH 2 O eller CaCl2 innehåller fällning eller är förorenade. Därför rekommenderar vi att förbereda detta reagens fräsch. Felsökning omvandlingen underlättas genom att inkludera kontroller när omvandla bacteria återges kompetent med en metod. En negativ kontroll som består av en sats av icke-transformerade kompetenta bakterier ströks ut på en LB-agarplatta innehållande den selektiva markören kommer snabbt att hjälpa till att avgöra huruvida den antibiotiska på plattan är effektiv. En positiv kontroll transformation med en känd plasmid beredning av god kvalitet och kvantitet hyser samma selektiva markören som det experimentella provet kommer att vara till hjälp för att avgöra om bakterierna är kompetent, men också om den experimentella DNA omvandlas var tillräckligt i kvantitet eller kvalitet. Fördelarna med denna teknik är många; metoden kan utföras inom samma dag som en transformation är planerad. Vi har funnit att fryst bakterie glycerol lager kan vara pläterade direkt på LB-agar utan någon förlust i electrocompetence, vi har gjort detta i &quot;akuta&quot; situationer (efter att glömma att starta natten kultur dagen innan). Även om vi inte kunde testa emycket påfrestning känt, någon E. coli eller V. cholerae stam som kan transformeras genom elektroporation har varit mottaglig för detta protokoll i våra händer. Tekniken är snabb, effektiv, och avkastning omvandlingseffektivitet jämförbara med de som erhållits från att förbereda elektro bakterier som använder traditionella metoder. Metoden eliminerar kravet på höghastighetscentrifug och tillhörande rotorer, en orbital inkubator shaker och sterila centrifughinkar (containrar), och stora volymer av autoklaverad buffert. Även om tabellen av särskilda reagenser och utrustning är ganska omfattande, kommer de flesta laboratorier som utför elektroporation har de flesta, om inte alla, av dessa material som redan finns tillgängliga. Kanske viktigast av allt, kan tekniken appliceras lätt att generera elektrolaboratoriespecifika stammar med muterade bakgrunder snabbt. Vi är omedvetna om eventuella begränsningar av denna teknik som det har ersatt den traditionella metoden för framställning av eltrocompetent bakterier i våra laboratorier. Resultatet av våra experiment som visas här utfördes med färska elektroceller produceras med den traditionella metoden som hade lagrats vid -80 ° C i högst 1 vecka. Men frusna elektrocelllager förlorar kompetens och eller livsduglighet under lång lagring. Vår förkortad protokoll möjliggör beredning av färska elektrokompetenta celler samma dag omvandlingen planeras utan oro ålder av beståndet som kan resultera i minskad trans avkastning. Vi har inte försökt lagra elektro celler som produceras med hjälp av en snabb metod för användning på en annan dag eftersom det inte har varit nödvändigt. Även om det inte visas här, effektiviteten i elektrokompetenta celler framställas med användning av vår snabba metod är tillräcklig för ligeringsblandningarna. De transformationer som rapporterats för icke-O1 V. cholerae i en nyligen publicerad artikel av Unterweger et al.17 genomfördes med hjälp av elektro bakterier som utarbetats av den metod som beskrivs här (utom de som utförs av konjugation). Denna teknik ger forskarna att omvandla stammar med muterade bakgrunder snabbt och effektivt utan att behöva förbereda stora partier av celler. Denna snabba beredningen av elektrokompetent bakterie metod kan anpassas till andra prokaryoter som har visat sig vara mottaglig för elektroporation som principen om förberedelser och elektroporation inställningarna kommer att vara desamma som för traditionella protokoll.

Sedan &quot;starten i början av 1980-talet 1, har elektroporation blivit en integrerad molekylärbiologi teknik, sannolikt den enskilt vanligaste metod som används för att transformera / transfektera levande celler med cirkulära eller linjära nukleinsyror. Ursprungligen utvecklad för transfektion av eukaryota celler 1, var elektroporation därefter anpassats för transformation av E. coli 2, 3. I bakteriologi har elektroporation blivit laboratoriestandard och har modifierats för att omvandla ett brett spektrum av bakterier, inklusive gramnegativa Pseudo 4, Salmonellae 5, Vibrioner 6, Serratiae och shigella 7, Gram-positiva Clostridia 8, baciller 9, laktobaciller 10 och Enterococci 11. Även vissa Archaebacteria har visat sig mottaglig för transformation genom elektroporation, inklusive Methanococci </em&gt; 12 och Sulfolobus arter 13. För en omfattande översyn, se Aune och Aachmann 14. Effektiviteten av transformation genom elektroporation är enligt uppgift 10-20 gånger högre än kemisk kompetens eller värmechock 2. Men, ungefär som att förbereda bakterier för kemisk kompetens som optimerats av Douglas Hanahan på 1980-talet 15, celler måste också vara beredd att bli elektro. Elektroporation är ett snabbt och effektivt sätt att bakteriell omvandling, som kräver elektro bakterier, renat DNA, en pulsstyrmodul som levererar elektrisk impuls, och en kammare som rymmer små engångskuvetter som fungerar som en elektrod. I korthet är kalla, kompetenta bakterier blandades med plasmid-DNA, utsattes för en högspänningspuls i en kyvett, återsuspenderades i tillväxtmedium, inkuberades vid 30-37 ° C under 30-45 min, och sedan ströks ut på halvfast medium (näringsagar plattor) med caopriate selektiv antibiotikum. I motsats till den pulserande steg, framställning av elektrokompetent E. coli förblir en multi procedur som traditionellt utförs i stora volymer. Kortfattat är en nattgammal kultur av bakterier ympades i en Erlenmeyer-kolv med 100 ml till en L Luria Broth (LB), som odlats till mitten av logaritmisk tillväxtfas (OD 600 av &lt;1,0), och utsattes för serietvättningar med en steril icke -jonisk buffert eller dubbeldestillerat vatten (DDH 2 O) i fallande volymer vid 4 ° C. Stor försiktighet måste vidtas för att hålla cellerna kallt under hela proceduren och förhindra kontaminering. Detta kräver användning av autoklaverad centrifugeringsskopor och nonjoniska buffertar eller DDH 2 O, en orbital skakinkubator, en stor volym höghastighets kyld centrifug och en uppsättning av rotorer. Bakterier återuppslammades slutligen i en liten volym buffert kompletterad med 10% glycerol och alikvoterades i ~ 40 | il volymer, WHich lagras vid -80 ° C fram till användning. Lagring låg temperatur resulterar ofta i minskade omvandlingseffektivitet på grund av förlust av livskraft över tiden. Elektrobakterieceller finns också tillgängliga från olika kommersiella källor men bara för ett begränsat antal (ofta rekombination-brist) E. coli-stammar som vanligen användes som värdar för att fortplanta ett brett spektrum av plasmider. Som ett resultat av forskare förlitar sig på interna metoder för att laga sin egen stammar / mutanter för transformation. En alternativ, snabbt och effektivt protokoll för beredning av elektrokompetent E. coli har använts av några molekylär bakteriologi laboratorier under en tid nu och har utvidgats till ytterligare gramnegativa bakterier, i vårt fall V. cholerae. Upphovsmannen till protokollet kan inte identifieras som den har optimerats av andra forskare över tiden. Den metod som presenteras här har använts i vår laboratortalet för nästan två decennier, och det är vårt mål att dela denna användbara protokoll med våra kamrater.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Name of the Equipment</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalogue number</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gene Pulser Module</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>165-2668</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gene Pulser Cuvette Chamber</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>165-2669</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electrocuvettes (0.2 cm gap)</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>165-2082</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>13 x 100 mm Pyrex Rimless Culture Tubes</td>
			<td>Corning</td>
			<td>70820-13</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>13 mm Culture Tube Closures</td>
			<td>Cole Parmer</td>
			<td>EW-04500-00</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6 x 250 mm Glass Rod</td>
			<td>Lab Source</td>
			<td>11381D</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable Petri Dishes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>08-757-12</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Roller Drum Motor Assembly</td>
			<td>New Brunswick Scientific</td>
			<td>M1053-4004</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Roller Drum for 13 x 100 mm Culture Tubes</td>
			<td>New Brunswick Scientific</td>
			<td>M1053-0306</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride</td>
			<td>Sigma Chemicals</td>
			<td>C5670</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol, anhydrous/denatured</td>
			<td>Sigma Chemicals</td>
			<td>227649</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inoculating Loop</td>
			<td>Decon Labs</td>
			<td>MP182-5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Refrigerated Microcentrifuge 5451 R</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>22621425</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bunsen Burner</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>03-917Q</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB Broth MILLER</td>
			<td>EMD</td>
			<td>1.10285.0500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacteriological Agar</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S25127</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

rapid protocol for preparation of electrocompetent escherichia coli and vibrio cholerae

Elektroporering har blivit en allmänt använd metod för att snabbt och effektivt införande av främmande DNA i ett brett spektrum av celler. Electrotransformation har blivit den föredragna metoden för att införa DNA i prokaryoter som inte naturligt kompetenta. Elektroporation är en snabb, effektiv och strömlinjeformad transformationsmetod som, förutom renat DNA och kompetenta bakterier, kräver kommersiellt tillgänglig gen puls controller och kyvetter. I motsats till pulsningssteget, är framställningen av elektrokompetenta celler tidskrävande och arbetsintensiv involverar upprepade omgångar av centrifugering och tvättningar i minskande volymer sterilt, kallt vatten eller icke-joniska buffertar med stora volymer av kulturer som odlats till mitten av logaritmisk fas i tillväxt. Tid och kraft kan sparas genom att köpa elektro celler från kommersiella källor, men urvalet är begränsat till vanligen använda E. coli laboratoriestammar. Vi skall sprida en snabb ocheffektiv metod för framställning av elektrokompetent E. coli, som har används av bakteriologi laboratorier under en tid, kan anpassas till V. cholerae och andra prokaryoter. Även om vi inte kan fastställa vem till krediter för att utveckla den ursprungliga tekniken, vi härmed göra den tillgänglig för den vetenskapliga gemenskapen.

Vi genomförde ett antal transformationer med E. coli och V. cholerae att jämföra omvandlingseffektiviteten i vår snabba metod med en anpassning av (traditionella) metod som ursprungligen beskrivits av Dower et al. 2 för beredning av elektro bakterier. För att utföra traditionell framställning av kompetenta celler, 500 ml LB i en 2 L-Erlenmeyer-kolv inokulerades med 500 | il övernattskultur av E. coli DH5a eller V. cholerae O395, inkuberades i en orbital skakapparat (215 varv per minut vid 37 ° C) och skördades vid OD 600 på mellan 0,5 till 1,0. Kolven kyldes på is, och kulturerna centrifugerades i en i förväg kyld rötor vid 4000 x g under 10 min vid 4 ° C. Cellpellets noggrant återsuspenderades i 500 ml iskall 2 mM CaCl2 för V. cholerae och DDH 2 O för E. coli, och centrifugerades igen under samma betingelser. Efterföljande rundor av resuspension end centrifugering genomfördes i minskande volymer av 200 och 100 ml volymer och se kulturen förblev kyld vid 4 ° C. Slutligen genomfördes en återsuspension och centrifugering i en 10 ml volym utfördes med 10% glycerol. Den slutliga pelleten återsuspenderades i 2 ml 10% glycerol och 40 pl alikvoter frystes vid -80 ° C och lagrades inte längre än en vecka före elektroporering. Elektroporation förhållanden inklusive pulsinställningar och kyvett storlek var identiska för båda bakteriearter i alla electroporations oavsett metod för framställning av kompetenta celler. Den enda skillnaden var att vi genomfört de tvättar i kallt DDH 2 O för E. coli och kall 2 mM CaCl2 för V. cholerae. Tabell 1 visar resultaten av bakterier som transformerats genom elektroporation identiskt men återges behörighet antingen med den snabba protokoll eller med den traditionella metoden. Vi anställda stam O395 och DH5a som vanligtly används, representativa stammar av V. cholerae och E. coli respektive, kan liknande resultat erhållas med andra stammar av samma art (om än inte varje enskild stam har testats) och sannolikt anpassas till andra gramnegativa bakterier och förmodligen bortom. För att säkerställa att samma cell nummer fanns i varje sats pulseades elektro bakterier genererade utnyttja den snabba metoden poolade vid insamling, blandat, hålls homogent avbrytas, och alikvoteras i 40 il volymer strax före elektroporering. Elektro bakterier genererade använder den traditionella metoden behandlades på samma sätt innan frysning i 40 l alikvoter. Efter avgivandet av pulsades varje sats av 40 ^ il electroporated bakterier suspenderade i 400 ^ il LB och serieutspäddes 1:10. Etthundra mikroliter av varje spädning ströks ut på LB-agar i närvaro av 100 ng / ml ampicillin och spreds med en steril glascell spridareoch inkuberades vid 37 ° C över natten. För att kvantifiera det totala antalet bakterier som används i varje transformation, var 40 | il volymer av elektrokompetenta bakterier av varje beredd sats serieutspäddes och ströks ut på LB-agar utan antibiotika identiskt parallellt. En alikvot av lika behandlade bakterier från varje sats elektroporerades med 1 | il Tris-EDTA (TE)-buffert utan DNA (mock-transformation), serieutspäddes och ströks ut på LB-agar utan antibiotika för att uppskatta antalet celler som förlorats till följd av leverans av elektrisk puls. Slutligen, var ytterligare en variant på experimentet utförs för att avgöra om 30 min inkubation vid 37 ° C i 1 ml LB efter elektroporation men innan bordläggningen på LB-agar skulle påverka återhämtningen av transformerade celler. kolonibildande enheter (CFU) räknades följande dag. För detta experiment användes vi pUC18, en gemensam laboratorie plasmid, och partier av kompetenta bakterier som består av enpproximately 10 8 CFU för celler beredda att använda den traditionella metoden och 10 7 CFU för celler beredda att utnyttja den snabba protokollet. Enbart Elektroporation (utan DNA) reducerade livskraftiga CFU med 10-100 vika oavsett vilken metod som används för att framställa de elektrokompetenta celler. Såsom visas i tabell 1, transformant utbytet var inom 10 6 -10 7 CFU / ^ g DNA intervall i tre upprepade experiment (standardavvikelser inom parentes) för E. coli (DH5a) och V. cholerae (O395) respektive med den traditionella, mer långsiktig metod för elektrokompetent cell förberedelse. Transformant avkastning dök minskade 10 gånger till 10 5 -10 6 CFU / ig DNA i tre likadana experiment (standardavvikelse inom parentes) för E. coli och V. cholerae respektive med den snabba metoden. Därför bestämde vi den procentuella andelen av transformerade bakterier genom att dividera transforme CFUsmed antalet CFU återhämtat sig från &quot;mock transformationer&quot; (utan plasmid) från övrigt identiska satser av kompetenta celler. Andelen transformerade bakterier var inom en log (2,5-9,4%) oavsett framställningsmetoden och arter omvandlade (Tabell 1 varie siffror). Dessa resultat tyder på att effektiviteten av den snabba metoden är jämförbar med den för den traditionella långdraget förfarande för framställning av kompetenta celler och att de representativa stammar av Vibrio cholerae och Escherichia coli är lika mottagliga för den snabba proceduren. Vi fann att omvandlingseffektiviteten, för plasmider som pUC18 hyser β-laktamas kassetter, inte påverkas av de 30 min återhämtningstid i LB buljong. Samma antal transformanter utvanns om cellerna ströks ut på LB-agar i närvaro av ampicillin direkt efter elektroporering, eller om de fick en 30-45 min återhämtningstidi LB-buljong vid 37 ° C före plätering. Våra resultat att ampicillin-resistens inte kräver utväxt i icke-selektiva förhållanden tyder på att β-laktamasuttryckning sker tillräckligt snabbt efter transformation. Dock bör det noteras att vi genomförde seriespädningar av pulsade bakterier i LB buljong, vilket kan ha bidragit till återhämtning från elektriska stötar och initiera genuttryck. <img alt="Figur 1" src="/files/ftp_upload/50684/50684fig1.jpg" /> Figur 1. Grafisk bild av metoden för snabb beredning av elektro bakterier. Efter 4-6 timmar (beroende på tätheten av inokulat) tillräckligt många bakterier kan samlas för att genomföra 4-6 transformationer från en enda LB agarplatta. För att säkerställa lika många kompetenta celler för varje slutvolymen ska elektroporeras var bakterier som samlats in från LB-agarplatta initialt samman och tvättas tillsammans sedan aliquoted i 40 | il volymer beroende på storleken av pelleten (större pelletar späddes i större volymer delbara med 40 | il). <table border="1"><tbody><tr><td colspan="3"> Antal Ampicillin-resistenta transformanter / ug DNA (Ampicillin-resistenta transformanter utvanns [%]) </td></tr><tr><td> Stam </td><td> Traditionell metod </td><td> Snabb metod </td></tr><tr><td> E. coli (DH5a) </td><td> 2,3 x 10 6 (± 7,3 x 10 5) [9,4%] </td><td> 3 x 10 6 (± 7,1 x 10 5) [2,5%] </td></tr><tr><td> V. cholerae (O395) </td><td> 4 x 10 7 (± 1,7 x 10 7) [5%] </td><td> 6,7 x 10 5 (± 2,1 x 10 5) [3,3%] </td></tr></tbody></table> Tabell 1. Omvandlingseffektiviteten per mikrogram DNA (pUC18) av elektrokompetent b.acteria framställes genom den traditionella metoden, jämfört med den snabba metoden. Alla transformationer utfördes med 500 ng pUC18-DNA (~ 80% supertvinnad DNA såsom visualiserades genom 1% agaros-gelelektrofores) och de elektroporerade cellerna späddes i serie 10-faldigt i LB-buljong innan utstrykning för CFU på LB-agar med antibiotika. Kontroll av icke-elektroporerade bakterier och bakterier elektroporerade utan plasmid, seriespäddes och pläterade på LB-agar utan antibiotika utfördes för varje uppsättning av transformationer för att fastställa det totala antalet livskraftiga bakterier före och efter pulserande. De elektroporerade kontrollerna representerade baslinjen för procent av livskraftiga bakterier framgångsrikt transformerats.

Watch this Scientific Journal Video about Rapid Protocol for Preparation of Electrocompetent Escherichia coli and Vibrio cholerae at JoVE.com

Rapid Protocol for Preparation of Electrocompetent Escherichia coli and Vibrio cholerae

Snabb Protokoll för Beredning av elektro<em&gt; Escherichia coli</em&gt; Och<em&gt; Vibrio cholerae</em

Elektroporation är en vanligt använd metod för att införa DNA i bakterier i en process som kallas transformation. Traditionella protokoll för beredning av elektrokompetenta celler är tidsödande och arbetsintensivt. I artikeln beskrivs en alternativ, en snabb och effektiv metod för framställning av elektrokompetenta celler närvarande är anställda av vissa laboratorier.

Electroporation has become a widely used method for rapidly and efficiently introducing foreign DNA into a wide range of cells. Electrotransformation has ...

Research

JoVE Journal

Biology

Rapid Protocol for Preparation of Electrocompetent Escherichia coli and Vibrio cholerae

Vibrio cholerae: Model Organism to Study Bacterial Pathogenesis - Interview

Vibrio cholerae: modellorganism att studera Bakteriell patogenes - Intervju

An Assay for Measuring the Activity of Escherichia coli Inducible Lysine Decarboxyase

An Assay for Measuring the Activity of Escherichia coli Inducible Lysine Decarboxyase

Test för att mäta aktiviteten hos Escherichia coli Inducible Lysin Decarboxyase

Escherichia coli is an enteric bacterium that is capable of growing over a wide range of pH values (pH 5 - 9)1 and, incredibly, is able to survive extreme ...

High Throughput Screening of Fungal Endoglucanase Activity in Escherichia coli

High Throughput Screening of Fungal Endoglucanase Activity in Escherichia coli

Hög throughput screening av svamp Endoglucanase aktivitet i Escherichia coli</em

Cellulase enzymes (endoglucanases, cellobiohydrolases, and &beta;-glucosidases) hydrolyze cellulose into component sugars, which in turn can be converted ...

Mapping Bacterial Functional Networks and Pathways in Escherichia Coli using Synthetic Genetic Arrays

Mapping Bacterial Functional Networks and Pathways in Escherichia Coli using Synthetic Genetic Arrays

Kartläggning Bakteriella funktionella nätverk och vägar i<em&gt; Escherichia Coli</em&gt; Använda syntetiska genetiska Arrays

Phenotypes  are determined by a complex series of physical (e.g. protein-protein) and  functional (e.g. gene-gene or genetic) interactions (GI)1. While ...

Protocols for Implementing an Escherichia coli Based TX-TL Cell-Free Expression System for Synthetic Biology

Protocols for Implementing an Escherichia coli Based TX-TL Cell-Free Expression System for Synthetic Biology

Protokoll för Implementera en<em&gt; Escherichia coli</em&gt; Baserad TX-TL Cell-Free Expression System för syntetisk biologi

Ideal cell-free expression systems can theoretically emulate an in vivo cellular environment in a controlled in vitro platform.1 This is useful for ...

Detection of Live Escherichia coli O157:H7 Cells by PMA-qPCR

Detection of Live Escherichia coli O157:H7 Cells by PMA-qPCR

Upptäckt av Live<em&gt; Escherichia coli</em&gt; O157: H7 celler genom PMA-qPCR

A unique open reading frame (ORF) Z3276 was identified as a specific genetic marker for E. coli O157:H7. A qPCR assay was developed for detection of E. ...

Optimized Protocol for Retinal Wholemount Preparation for Imaging and Immunohistochemistry

Optimerad Protokoll för Retinal Wholemount Förberedelse för Imaging och Immunohistokemi

Working with delicate tissue can be a complicating factor when performing immunohistochemical assessment. Here, we present a method that utilizes a ...

Non-chromatographic Purification of Recombinant Elastin-like Polypeptides and their Fusions with Peptides and Proteins from Escherichia coli

Non-chromatographic Purification of Recombinant Elastin-like Polypeptides and their Fusions with Peptides and Proteins from Escherichia coli

Icke-kromatografisk rening av rekombinant Elastin liknande polypeptider och deras fusioner med peptider och proteiner från<em&gt; Escherichia coli</em

Elastin-like polypeptides are repetitive biopolymers that exhibit a lower critical solution temperature phase transition behavior, existing as soluble ...

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

Grönt fluorescerande protein-baserad expressions Screening av membranproteiner i<em&gt; Escherichia coli</em

The production of recombinant membrane proteins for structural and functional studies remains technically challenging due to low levels of expression and ...

The Multifaceted Benefits of Protein Co-expression in Escherichia coli

The Multifaceted Benefits of Protein Co-expression in Escherichia coli

Det mångfacetterade Fördelar med Protein Samexpression i<em&gt; Escherichia coli</em

We report here that the expression of protein complexes in vivo in Escherichia coli can be more convenient than traditional reconstitution experiments in ...