Name: a guided materials screening approach for developing quantitative sol-gel derived protein microarrays
Uploaded: 2013-08-26T12:00:00
Duration: 10 min 44 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Guided Materials Screening Approach for Developing Quantitative Sol-gel Derived Protein Microarrays at JoVE.com

Forfatterne takker Maria Monton, Julie Lebert, Jessamyn Little, Xin Ge og Laura Lautens om bistand til udvikling af protein microarrays. Forfatterne takker også naturvidenskab og Engineering Research Council of Canada (NSERC) for at finansiere dette arbejde. Forfatterne takker også Canada Foundation for Innovation og Ontario Innovation Trust for støtte for dette arbejde. JDB holder Canada Research Chair i Bioanalytisk kemi og Biointerfaces.

<ol>
	<li>Schena, M. M., Shalon, D. D., Davis, R. W. R., Brown, P. O. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+monitoring+of+gene+expression+patterns+with+a+complementary+DNA+microarray.">Quantitative monitoring of gene expression patterns with a complementary DNA microarray.</a> Science (New York, N.Y.). 270 (5235), 467-470 (1995).</li><li>MacBeath, G., Schreiber, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Printing+proteins+as+microarrays+for+high-throughput+function+determination.">Printing proteins as microarrays for high-throughput function determination.</a> Science (New York, N.Y.). 289 (5485), 1760-1763 (2000).</li><li>Zhu, H. H., Bilgin, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+analysis+of+protein+activities+using+proteome+chips.">Global analysis of protein activities using proteome chips.</a> Science (New York, N.Y.). 293 (5537), 2101-2105 (2001).</li><li>Hook, A. L., Chang, C. -. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combinatorial+discovery+of+polymers+resistant+to+bacterial+attachment.">Combinatorial discovery of polymers resistant to bacterial attachment.</a> Nature Biotechnology. , (2012).</li><li>Monton, M. R. N., Lebert, J. M., Little, J. R. L., Nair, J. J., McNulty, J., Brennan, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Sol-Gel-Derived+Acetylcholinesterase+Microarray+for+Nanovolume+Small-Molecule+Screening.">A Sol-Gel-Derived Acetylcholinesterase Microarray for Nanovolume Small-Molecule Screening.</a> Analytical Chemistry. 82 (22), 9365-9373 (2010).</li><li>Cho, E. J., Tao, Z., Tehan, E. C., Bright, F. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multianalyte+pin-printed+biosensor+arrays+based+on+protein-doped+xerogels.">Multianalyte pin-printed biosensor arrays based on protein-doped xerogels.</a> Analytical Chemistry. 74 (24), 6177-6184 (2002).</li><li>Cho, E. J., Tao, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tools+to+Rapidly+Produce+and+Screen+Biodegradable+Polymer+and+Sol-Gel-Derived+Xerogel+Formulations.+Applied+Spectroscopy.">Tools to Rapidly Produce and Screen Biodegradable Polymer and Sol-Gel-Derived Xerogel Formulations. Applied Spectroscopy.</a> Society for Applied Spectroscopy. 56 (11), 1385-1389 (2002).</li><li>Ge, X., Lebert, J. M., Monton, M. R. N., Lautens, L. L., Brennan, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Materials+Screening+for+Sol-Gel-Derived+High-Density+Multi-Kinase+Microarrays.">Materials Screening for Sol-Gel-Derived High-Density Multi-Kinase Microarrays.</a> Chemistry of Materials. 23 (16), 3685-3691 (2011).</li><li>Rupcich, N., Green, J. R. A., Brennan, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanovolume+Kinase+Inhibition+Assay+Using+a+Sol-Gel-Derived+Multicomponent+Microarray.">Nanovolume Kinase Inhibition Assay Using a Sol-Gel-Derived Multicomponent Microarray.</a> Analytical Chemistry. 77 (24), 8013-8019 (2005).</li><li>Rupcich, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coupled+enzyme+reaction+microarrays+based+on+pin-printing+of+sol-gel+derived+biomaterials.">Coupled enzyme reaction microarrays based on pin-printing of sol-gel derived biomaterials.</a> Analytica Chimica Acta. 500 (1-2), 3-12 (2003).</li><li>MacBeath, G. G., Schreiber, S. L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Printing+proteins+as+microarrays+for+high-throughput+function+determination.">Printing proteins as microarrays for high-throughput function determination.</a> Science (New York, N.Y.). 289 (5485), 1760-1763 (2000).</li><li>Stillman, B. A. B., Tonkinson, J. L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FAST+slides:+a+novel+surface+for+microarrays.">FAST slides: a novel surface for microarrays.</a> BioTechniques. 29 (3), 630-635 (2000).</li><li>Rupcich, N., Goldstein, A., Brennan, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+sol-gel+formulations+and+surface+treatments+for+the+development+of+pin-printed+protein+microarrays.">Optimization of sol-gel formulations and surface treatments for the development of pin-printed protein microarrays.</a> Chemistry of Materials. 15 (9), 1803-1811 (2003).</li><li>Gill, I., Ballesteros, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Encapsulation+of+biologicals+within+silicate,+siloxane,+and+hybrid+sol-gel+polymers:+An+efficient+and+generic+approach.">Encapsulation of biologicals within silicate, siloxane, and hybrid sol-gel polymers: An efficient and generic approach.</a> Journal of the American Chemical Society. 120 (34), 8587-8598 (1998).</li><li>Brook, M. A., Chen, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteins+entrapped+in+silica+monoliths+prepared+from+glyceroxysilanes.">Proteins entrapped in silica monoliths prepared from glyceroxysilanes.</a> Journal of Sol-gel Science and Technology. 31 (1), 343-348 (2004).</li><li>Brook, M. A., Chen, Y., Guo, K., Zhang, Z., Brennan, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sugar-modified+silanes:+precursors+for+silica+monoliths.">Sugar-modified silanes: precursors for silica monoliths.</a> Journal of Materials Chemistry. 14 (9), 1469 (2004).</li><li>Zhang, J., Chung, T., Oldenburg, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Simple+Statistical+Parameter+for+Use+in+Evaluation+and+Validation+of+High+Throughput+Screening+Assays.">A Simple Statistical Parameter for Use in Evaluation and Validation of High Throughput Screening Assays.</a> Journal of Biomolecular Screening. 4 (2), 67-73 (1999).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Next+generation+of+protein+microarray+support+materials:+Evaluation+for+protein+and+antibody+microarray+applications.">Next generation of protein microarray support materials: Evaluation for protein and antibody microarray applications.</a> Journal of Chromatography A. , 1-8 (2013).</li><li>Bhatia, R. B., Brinker, C. J., Gupta, A. K., Singh, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aqueous+Sol-Gel+Process+for+Protein+Encapsulation.">Aqueous Sol-Gel Process for Protein Encapsulation.</a> Chemistry of Materials. 12 (8), 2434-2441 (2000).</li></ol>

Vi har intet at afsløre.

Metodikken beskrevet her blev valgt som den mest egnede til identifikation printable sol-gel afledte materialer med en kontakt printer, der producerer en tid-og omkostningseffektiv procedure til hurtig identifikation optimale materialer uden at screene store antal materialer. Fra i alt ~ 20.000 potentielle materialer, var det muligt at identificere ~ 200 materialer, der var egnet til udskrivning på grundlag af gelering tid alene. Det gør det væsentligt reduceret antallet af nødvendige materialer til at være forberedt på efterfølgende udskrivning forsøg. Disse printbare materialer blev derefter trykt på 4 glideflader for i alt 768 materiale-slide kombinationer. I gennemsnit kan 50 pletter / gentagelser af ét materiale blive trykt i ~ 3 min, herunder prøve lastning, spot deposition og pin rengøring. Af dem, tillod 155 materialer, eller omkring 20%, til udskrivning af det maksimale antal af pletter pr opløsning optagelse og produceret reproducerbare pletstørrelser. Det skal bemærkes, at af de 4 slide overflader testet materialer trykt bedre i rækkefølge: amin&gt; epoxy&gt; aldehyd&gt; PMMA, PMMA slides ikke frembringe nyttige arrays til alle materialer. Dette var sandsynligvis tilskrives polariteten af ​​overfladebelægningen. Sammenligne de førnævnte glideflader, blev den mere polære amin og epoxy bedre egnet til de vandige sole forhold til PMMA dias. Endvidere af de testede overflader, giver amin coatede objektglas en potentiel positivt ladet overflade for den indskudte anioniske sol til binding. Vi formoder, at silica nanopartikler ved grænsefladen mellem slæden og sol interagere langs overfladen. Både epoxy og aldehyd glideflader mangler den samme oprindelige ladning-interaktion. For at sikre optimal spot deposition er det stærkt anbefales at bruge pre-coatede objektglas fra en leverandør som Arrayit. In-house coating producerer inkonsistente overflader, der fører til dårlig spot reproducerbarhed 13, og i nogle tilfælde kan føre til kvantificering probblemer. 18. Af lige så stor betydning, temperatur og fugtighed påvirker &quot;trykbarhed&quot; af materialerne. Selv om der ikke detaljerede undersøgelser af virkningerne relateret til temperatur blev udført, blev trykning altid udføres ved stuetemperatur (23 ± 3 ° C). Luftfugtighed (over 80%) blev også kontrolleret inden print kammeret for at forhindre uregelmæssig form aflejring på grund af små deposition volumener (0,7-2,3 nl) og fordampning. Mens materialet skærmen blev styret til at identificere optimale sol-gel afledte materialer specielt til udskrivning af AChE og kinaser, et lille sæt af materialer blev identificeret, som arbejdede for begge typer af proteiner. Faktisk var begge af de materialer, der blev identificeret for kinase microarray fabrikation baseret på SS + PVA + glycerol, og begge materialer blev også identificeret inden for de 26 udvalgte materialer for AChE microarrays. Disse &quot;optimale&quot; materialer kan tilbyde en generisk udgangspunkt for at udvikle yderligere protei-doterede sol-gel-baserede microarrays, og små skærme centreret omkring disse sammensætninger kan identificere endnu bedre materialer til microarray fabrikation. Et andet punkt at bemærke er betydningen af ​​det anvendte enzym. I tilfælde af AChE (en temmelig robust enzym), beholdt 26 (eller omtrent 40%) af de oprindelige 66 materialer identificeret som assay-kompatibelt aktivitet indesluttet AChE. Men for de mere sarte kinaser, var kun 2 af de 69-assay-kompatible præparater, eller omkring 3% af de materialer, i stand til at bevare aktiviteten af ​​alle kinaser. Mens tilstrækkeligt antal forskellige enzymer ikke er blevet undersøgt for at gøre endegyldige udsagn, fremgår det, at optimering matrix fabrikation med relativt ustabile enzymer kan føre til identifikation af materialer, der kan vikle en bred vifte af proteiner til at tillade mutliplexed microarray fabrikation. Uafhængigt af den valgte protein, de store cut-off faktor til identifikation printbare materialer var behovet for en langmateriale geleringsproblemer gange (&gt; 2,5 timer). Ved udviklingen SS baserede sol-gel materialer, er det meget vigtigt at sikre, at der efter ionbytning og filtrering, solen er på omkring pH 4. Soler med en lavere pH-værdi kan resultere i materialer med en lavere-end-neutralt pH, hvilket kan påvirke enzymaktivitet. 19. justere mængden af Dowex (ionbytterharpiks) til SS kan ændre det endelige pH af solen. Når en ny batch af harpiks fremstilles forholdet mellem harpiks SS skal justeres således at producere soler på omkring pH 4 efter proceduren i punkt 2 i protokollen. Tilsvarende fremstillingen af ​​krystallinske DGS er ofte en kilde til fejl i forbindelse med materiale svigt ved anvendelse DGS baserede soler til biomolekyle indfangning. Selvom det ikke er rapporteret her i detaljer, stor omhu skal tages under syntesen af ​​krystallinske DGS, især behovet for at undgå tilstedeværelsen af ​​vand i løbet af syntesen, der kan producere polyglycerated silicates snarere end monomere DGS. Også på grund af den hygroskopiske natur af DGS, den krystallinske prøve skal lagres udtørret og anvendes inden for 6 måneder efter syntese. Krystallinske DGS ældre end 6 måneder, kan ikke opløses fuldstændigt (på grund af delvis kondenseret polyglyceryl silikat materiale) selv med lydbehandling i et surt miljø. Ufuldstændig DGS opløsning producerer soler med ukendte og ukontrollerbare indhold af silica og dermed mindre robuste materialer. Et vigtigt punkt at bemærke med kontakt udskrivning er kvaliteten af ​​ben. Beskadigede eller fejlhåndtering stifter (figur 9), vil aldrig give reproducerbare arrays uafhængigt af det materiale, der udskrives. Det anbefales at kontrollere pin kvalitet ved hjælp af en dissektion mikroskop for at sikre knuste eller tilstoppede ben er ikke brugt. Omhyggelig håndtering sikrer lang levetid for stifterne. Fri bevægelighed for stiften er også vigtig. I de tilfælde, hvor fugt er fanget i printhovedet mellem hovedet og pin, stiftenvil ikke sæde korrekt og vil således ikke gøre korrekt kontakt med overfladen, hvilket resulterer i en mangel på aflejring af materiale. Afslutningsvis har vi givet et detaljeret, flertrins screening tilgang til udvikling af high-density protein doterede pin-trykte microarrays. Screeningen omfatter optimering af materialeegenskaber (gelering tid og trykbarhed) for at tillade trykning af materialer, efterfulgt af mere fokuseret screening til at identificere materialer, der er kompatible med en given assay og i stand til at bevare enzymaktivitet. Denne guidede materiale screening tilgang kan anvendes til yderligere microarray-formater for at reducere tid og omkostninger forbundet med at producere effektive high-density microarrays.

Microarrays har vundet popularitet i det videnskabelige samfund som en metode til at øge assay gennemløb. Da udviklingen af microarray-teknologi til at vurdere genekspression 1 i midten af 1990&#39;erne, har microarrays fundet anvendelse i udviklingen af high-throughput assays til at identificere protein-protein og protein-small molecule interaktioner, og for at finde nye materialer med unikke egenskaber. 2-5 For nylig er microarrays blevet udviklet, hvori specifikke materialer bruges til at immobilisere funktionelle proteiner, der producerer et tredimensionalt microarray element i hvilke proteiner er indesluttet, giver mulighed for facile måling af enzymatisk aktivitet og hæmning på microarray selv ved hjælp af en passende fluorescens assay, der er koblet til underlaget omsætning. 5-10 vigtigere, kan sådanne microarrays være konstrueret til at indeholde alle nødvendige komponenter til at screene prøver og kontroller sammen i et stærkt parallel mode. 5,8 &lt;/ P&gt; Tidlige eksempler på protein microarrays blev typisk fremstillet under anvendelse af standardmetoder til proteinimmobilisering på faste bærere, såsom kovalent binding, 11 affinitet fange 3 og fysisk adsorption. 12. Selv om disse metoder for bio-immobilisering giver mulighed for øget prøvekoncentration og accelererede reaktionskinetik kræves for assay miniaturisering, de hver lider ulemper. I almindelighed forårsager alle en reduktion i nativ biomolekyle funktionalitet på grund kemisk modifikation af overfladen, hindres adgang til aktive sites, eller forkert orientering på grund af ikke-specifik immobilisering. Således er alle metoder resulterer i lavere analysesensitivitet trods en stigning i biomolekyle aflejring, en reaktion, der sandsynligvis opstår som følge af behovet for kunstigt binde biomolekyler til en overflade. En ny fremgangsmåde til fremstilling af funktionelle biomolekyler microarrays er gennem pin-trykning af protein-dopedsilicasoler på faste bærere, som typisk enten funktionaliserede objektglas eller individuelle brønde i mikrobrøndsplader. Sol-gel proces selv finder sted i et vandigt miljø ved stuetemperatur, og det er den flydende precursor, der er trykt og derefter geler til indfange biomolekyler i 3D matrix, der giver mulighed for højt proteinindhold lastning 13 samt indfangning af flere komponenter inden samme microarray element. 13,14 tilpasning af sol-gel afledt materiale kan ske ved omhyggelig udvælgelse af forskellige silica forstadier, samt ved at ændre den vandige komponent ved anvendelse af forskellige puffere (pH, ionstyrke), og inddragelse af forskellige tilsætningsstoffer (polymerer, små molekyler) for at opnå en optimal materiale særlige karakter afhænger af biomolekylet der er indfanget. 10. En potentiel begrænsning forbundet med at udvikle sol-gel protein microarrays via pin-udskrivning erbehovet for at identificere sol-gel-baserede kompositmaterialer, der kan udskrives, uden gelering i stift eller viser uønskede egenskaber (reproducerbare pletstørrelser, revner, dårlig vedhæftning, uforenelighed med assaykomponenterne, dårlig protein aktivitet) en gang trykt på en overflade. 5. Samtidig optimering af alle disse parametre hinder En tilgang hvori materialer kan designes de novo, eller behandles langsomt på en seriel måde. På den anden side, er tilfældigt screening af mange tusinde eller titusinder af materialer hverken tid-eller omkostningseffektivt. I denne artikel beskriver vi en rettet screening tilgang, der tillader hurtig identifikation af egnede materialer til fremstilling af protein microarrays uden behov for tilfældigt screening af store mængder af materialer. Ved hjælp af en guidet fremgangsmåde, der er egnede til microarray trykning først identificeret, efterfulgt af en række små skærme til at identificere optimale sol-gel afledt materialeral kombinationer, der kan udskrives reproducerbart, uden revner og er kompatible med en given assay. Endelig er optimale materialer identificeret på baggrund af fastholdelse af enzym-aktiviteter og resultater i en endelig lille molekyle screening assay. På denne måde, kan optimale materialer identificeres fra mange tusinde kandidater kun bruger et par hundrede analysetrin. Vi viser denne fremgangsmåde til fremstilling af både high-density acetylcholinesterase og multikinasehæmmer microarrays og anvendelsen af ​​sådanne microarrays for små-molekyle screening.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Reagent/Material</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly(vinyl alcohol) (PVA)</td>
			<td>Sigma-Alderich</td>
			<td>360627</td>
			<td>80% hydrolozyed, Mw 600</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyethylene glycol 600 (PEG)</td>
			<td>Sigma-Alderich</td>
			<td>87333</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyethylenimine (PEI)</td>
			<td>Sigma-Alderich</td>
			<td>482595</td>
			<td>50% (w/w) solution in water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carboxyethylsilanetriol (Si-COOH)</td>
			<td>Gelest, Inc.</td>
			<td>SIC2263.0</td>
			<td>25% in water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-(3-triethoxysilylpropyl) gluconamide(GLS)</td>
			<td>Gelest, Inc.</td>
			<td>SIT8189.0</td>
			<td>50% in ethanol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>bis[(3-methyldimethoxysilyl)propyl]polypropylene oxide (MDSPPO)</td>
			<td>Gelest, Inc.</td>
			<td>SIB1660.0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methyltrimethoxysilane (MTMS)</td>
			<td>Gelest, Inc.</td>
			<td>SIM6560.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bis(triethoxysiyly)ethane (Bis-TEOS)</td>
			<td>Gelest, Inc.</td>
			<td>SIB1817.0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3-Aminopropyltriethoxysilane (APTES)</td>
			<td>Gelest, Inc.</td>
			<td>SIA0610.0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Sigma-Alderich</td>
			<td>49767</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Sorbitol</td>
			<td>Sigma-Alderich</td>
			<td>240850</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-(+)-Trehalose dihydrate</td>
			<td>Sigma-Alderich</td>
			<td>T9531</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma-Alderich</td>
			<td>X-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N&#949;-Acetyl-L-lysine</td>
			<td>Sigma-Alderich</td>
			<td>A4021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris(hydroxymethyl)aminomethane</td>
			<td>Sigma-Alderich</td>
			<td>154563</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma-Alderich</td>
			<td>H3375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydroxide, 1.0 N</td>
			<td>LabChem Inc.</td>
			<td>LC24350-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric Acid, 1.0 N/0.1 N</td>
			<td>LabChem Inc.</td>
			<td>LC15300-2/LC152220-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride</td>
			<td>Sigma-Alderich</td>
			<td>M8266</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diglycerolsilane (DGS)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Prepared in laboratory</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium silicate solution</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>SS338-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dowex 50WX8-100 ion exchance resin</td>
			<td>Sigma-Alderich</td>
			<td>217492</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetylthiocholine iodide</td>
			<td>Sigma-Alderich</td>
			<td>1480</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetylcholinesterase from Electrophorus electricus (electric eel)</td>
			<td>Sigma-Alderich</td>
			<td>C2888</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BODIPY FL L-Cystine</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>B-20340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pro-Q Diamond Phosphoprotein/Phosphopeptide Microarray Stain Kit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>P33706</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adenosine 5&#39;triphosphate disodium salt (ATP) solution</td>
			<td>Sigma-Alderich</td>
			<td>A6559</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MAP Kinase 2 (MAPK2)</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>454850</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>p38&#945;/SAPK2a (T106M), active</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>14-687M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epidermal growth factor (EGFR)</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td></td>
			<td>Donated by Millipore</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycogen synthase kinase 3&#946; (GSK-3&#946;)</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>14-306</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Myelin basic protein (MBP)</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td></td>
			<td>Substrate for MAPK2 and p38&#945;, Donated by Millipore</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GSM</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>12-533</td>
			<td>Substrate for GSK-3&#946;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-glu-tyr polypeptide p(E4Y)</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>12-440</td>
			<td>Substrate for EGFR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stealth pin</td>
			<td>ArrayIt</td>
			<td>SMP3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stealth pin</td>
			<td>ArrayIt</td>
			<td>SMP7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amine coated slides</td>
			<td>ArrayIt</td>
			<td>SMM2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aldehyde coated slides</td>
			<td>ArrayIt</td>
			<td>SMA2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Exposy coated slides</td>
			<td>ArrayIt</td>
			<td>SME2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly(methylmethacrylate) (PMMA) coated slides</td>
			<td>Exakt Technologies Inc.</td>
			<td>41500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.2-&#956;m syringe filter</td>
			<td>PALL Life Sciences</td>
			<td>4612</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Virtek Contact Printer</td>
			<td>BioRad</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Novaray Fluorescence Slide Imager</td>
			<td>Alpha Innotech Corporation</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Desktop microarray centrifuge</td>
			<td>ArrayIt</td>
			<td>MHC110V</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MilliQ Synthesis A10</td>
			<td>Millipore</td>
			<td></td>
			<td>Used to filter all water required for experiments</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a guided materials screening approach for developing quantitative sol-gel derived protein microarrays

Microarrays har fundet anvendelse i udviklingen af ​​high-throughput assays for nye materialer og opdagelsen af ​​små molekyler lægemiddelkandidater. Heri beskriver vi en guidet materiale screening metode til at kortlægge sol-gel-baserede materialer, der er egnede til fremstilling af tredimensionale protein microarrays. Den tilgang først identificerer materialer, der kan udskrives som microarrays, indsnævrer antallet af materialer ved at identificere dem, der er kompatible med en given enzym assay, og derefter skærper i på optimale materialer baseret på fastholdelse af maksimal enzymaktivitet. Denne tilgang anvendes til at udvikle microarrays egnet til to forskellige enzymassays, den ene med acetylcholinesterase, og den anden ved hjælp af et sæt af fire centrale kinaser involveret i kræft. I hvert tilfælde var det muligt at fremstille microarrays, der kunne anvendes til kvantitative små molekyler screeningsassays og produktion af dosis-afhængige inhibitor responskurver. Vigtigere er, at evnen screene mange materialer fremlagt oplysninger om de typer af materialer, der passer bedst både microarray produktion og fastholdelse af enzymaktivitet. De materialer data giver indsigt i basale materielle krav, der er nødvendige for at skræddersy optimale, high-density sol-gel afledte microarrays.

Ved at udføre en guidet faktoranalyse for materialet skærmen, var vi i stand til at minimere antallet af materialer testet fra ~ 20.000 til et par hundrede, der havde geleringsproblemer gange er velegnede til udskrivning. Ved at anvende en streng retningslinje kræver materiale Geleringstiden på 2,5 hr eller større, blev materialer, der kan tilstoppe udskrivning stifter eller producerer reproducerbare arrays udskrives aldrig. De printbare materialer er identificeret at have tilstrækkelige (&gt; 2,5 t) geleringsproblemer tider blev trykt på 4 forskellige funktionaliserede objektglas overflader. For at blive betragtet som &quot;udskrives&quot;, havde det maksimale antal spots pr optagelse volumen pin der skal udskrives (SMP3 = 200). Spots blev også vurderet for spot morfologi for at sikre ingen revnedannelse eller uønsket faseadskillelse havde fundet sted ved hjælp af simple brightfield mikroskopi, som vist i figur 2.. Fra dette tidspunkt af identificerede printbare materialer blev microarrays produceret med AChE ogkinaser inkorporeres i den bufrede vandige komponent. Materialer, der var kompatible med analysen procedure (herunder potentielle overprinting og vask eller farvning trin) blev identificeret ved at observere tilbageholdelse af microarray spots (krakeleringer, tab af pletter eller usædvanlige fluorescens mønstre) og en positiv kontrol (PC) til den negative kontrol (NC ) forhold større end 1, som observeret gennem billedet. Som det var omkring 50% af de materialer, en større PC / NC forholdet 3 blev anvendt til at definere optimale materialer med bibeholdelse af protein-aktivitet. Gennem denne metode, viser 26 sol-gel afledte materialer, der indeholder smerte og 2 materialer, der indeholder kinaser opfyldte&gt; 3 PC / NC kriterier. Figur 3 og 4 en grafisk oversigt over de 5 guidede materiale skærmen trin for identifikation af optimal AChE og kinase microarrays, hhv. Analyserne kan også valideres ved produktion af en Z &#39;score. 17. </sup&gt; Dette blev gjort ved hjælp af materiale, der producerede den højeste PC / NC forholdet. Figur 5 viser Z &#39;plot opnået ved sammenligning af signalet genereret fra 200 spots, 100 PC og 100 NC efter overprint indikatorfarvestoffet og substrat på AChE array. De AChE og kinase arrays resulterede i de respektive Z &#39;snesevis af 0,60 og 0,67, hvilket indikerer en fremragende analyse. Dog skal det bemærkes, at før analyse validering, på array-enzym, et farvestof, substrat og cofaktor koncentrationer skulle optimeres ved overprint en række koncentrationer af hver komponent og vælge den koncentration, der producerede det højeste signal, som beskrevet detaljeret andetsteds . 5. At validere assays blev kvantitative hæmning data opnået under anvendelse af kendte og ukendte AChE-inhibitorer, med resultater udført in duplo og anvendes til at producere dublerede jordlodder (figur 6A) og inhibering kurver (figur 6B og 6C). &lt;strong&gt; Spots blev først påtrykt blandinger af kendte biologisk aktive små molekyler inhibitorer derefter med farvestof og substrat, og kontrolsystemer blandinger, der indeholder enten kendte hæmmere eller ingen inhibitor blev inkluderet. Duplicate parceller blev genereret at vurdere enzymaktivitet, og eventuelle blandinger, der resulterede i mindre end 25% enzymaktivitet blev betragtet som positive for hæmning. Individuelle forbindelser fra sådanne blandinger blev derefter testet in duplo at identificere de specifikke lille molekyle (r) ansvarlig for hæmning. Når identificeret, disse små molekyler blev anvendt til at generere kvantitative inhiberingskurver at bestemme IC50-værdier og inhiberingskonstanter. Tilsvarende kvalitative resultater blev opnået ved anvendelse af multikinasehæmmer array med en fælles kinaseinhibitor, staurosporin. Figur 7A og 7B viser microarray billede og viser, at signalintensiteter efter overprint og farvning af multikinasehæmmermatrix er som forventet for en negativ kontrol (- ATP), positiv kontrol (+ ATP) og kendt inhibitor (+ ATP + indb.). At demonstrere evnen til at opnå kvantitative hæmning data fra microarrays, blev en koncentrationsafhængig hæmning assay udført for en enkelt kinase. Som vist i figur 8A og 8B, signalintensitet aftager som inhibitorkoncentration stiger, og reaktionen følger den forventede koncentration afhængig inhiberingskurve for p38α/MBP kinase / substrat-system. <img alt="Figur 1" src="/files/ftp_upload/50689/50689fig1.jpg" /> Figur 1. Generel skematisk for guidet materialer screening tilgang. Hver blok repræsenterer et skridt på skærmen i rækkefølge. Numre til venstre repræsenterer det totale antal af materialer fremstillet til analyse. Ved hjælp af en gelering tidsrum større end 2,5 timer (materialer med geleringsproblemer gange mindre end 2,5 timer are angivet af overstreget) er antallet af materialer, der passerede hver fase og fremføres under den materielle skærmen angivet ved tallet til højre. * Repræsenterer materialer med mindre end optimal faseseparation. <img alt="Figur 2" src="/files/ftp_upload/50689/50689fig2.jpg" /> Figur 2. Optiske billeder viser forskellige fejltilstande af materialer på trykbarheden trin på skærmen. Et billede af en &quot;god&quot; materiale (anden række, tredje kolonne) er også vist til sammenligning. Genoptrykt med tilladelse fra henvisningen 8, copyright 2013 American Chemical Society. <img alt="Figur 3" src="/files/ftp_upload/50689/50689fig3.jpg" /> Figur 3. En rettet materiale screening tilgang til identifikation af optimale materialer til fabrikere sol-gel-afledte AChE microarrays. Genoptrykt med permission fra henvisningen 5, copyright 2013 American Chemical Society. <img alt="Figur 4" src="/files/ftp_upload/50689/50689fig4.jpg" /> Figur 4.. En rettet materialer screening tilgang til identifikation af optimale materialer til fabrikere sol-gel-afledte kinase microarrays. Genoptrykt med tilladelse fra henvisningen 8, copyright 2013 American Chemical Society. <img alt="Figur 5" src="/files/ftp_upload/50689/50689fig5.jpg" /> Figur 5. (A) En del af AChE microarray viser HC (lys grøn) og LC (lys grøn) pletter (en sort-grøn palet blev anvendt pseudo for klarhed præsentation), (B) en forstørret visning af indrammede område at fremhæve spot morfologi og tilpasning;. og (C) en Z &#39;plot Streger angiver middelværdien af<html> replikater, mens stiplede linier svarer til 3SD. Genoptrykt med tilladelse fra henvisning 5, copyright 2013 American Chemical Society. <img alt="Figur 6" src="/files/ftp_upload/50689/50689fig6.jpg" /> Figur 6.. (A) Duplicate plot for den array screening af syntetiske analoger af Amaryllidaceae alkaloider, (B) IC50 parceller identificerede potentielle inhibitorer markeret som forbindelserne 1 og (C) forbindelse 2, med fejlsøjler repræsenterer en standardafvigelse af middelværdien fra 25 replikater. Repræsentative pletter er vist for at illustrere forskellene i signal proportionalt inhibitorkoncentrationer. Genoptrykt med tilladelse fra henvisning 5, copyright 2013 American Chemical Society. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/50689/50689fig6large.jpg" target="_blank">Klik her for at se større figur</a> . nt &quot;fo: keep-together.within-page =&quot; altid &quot;&gt; <img alt="Figur 7" src="/files/ftp_upload/50689/50689fig7.jpg" /> Figur 7. On-matrix analyse af fire kinaser hjælp 1.4SS/1.0PVA til indfangning og trykt på en amin-derivatiseret slide. (A) Et billede af en sektion af microarray hvor pletter med kinaser co-indesluttet med deres respektive substrater blev overtrykt med puffer (NC, øverste række) eller opløsninger, der indeholder ATP (PC, midterste række), eller ATP + staurosporin (nederste række). (B) søjlediagrammer, som sammenligner signalintensiteter mellem hæmmet og uhæmmede reaktioner, efter fradrag af baggrundssignaler og fejl barer repræsenterer en standardafvigelse af middelværdien fra 25 gentagelser. Genoptrykt med tilladelse fra henvisningen 8, copyright 2013 American Chemical Society. <img alt="Figur 8" src="/files/ftp_upload/50689/50689fig8.jpg" /> Figur 8. Inhibiti. på assay på en p38a/MBP microarray (A) Afsnit af microarrays viser repræsentative pletter overspotted med varierende koncentrationer af staurosporin, som anført (billeder blev opnået ved en enkelt scanning af den samme slide, sammensat billede er vist for klarhed). (B) IC50 kurve genereret fra de analyserede Array billeder. Intensiteten opnået ved 100 mM blev trukket fra alle billeder, alle andre intensiteter blev normaliseret ved at indstille intensiteten opnået ved 10 nM til en værdi på 100% aktivitet. Genoptrykt med tilladelse fra henvisningen 8, copyright 2013 American Chemical Society. <img alt="Figur 9" src="/files/ftp_upload/50689/50689fig9.jpg" /> Figur 9. Billeder af mikroskopiske stealth pin bruges til kontakt pin-udskrivning viser forskellige ufuldkommenheder: (A) tilstoppet, (B) bøjet.

Watch this Scientific Journal Video about A Guided Materials Screening Approach for Developing Quantitative Sol-gel Derived Protein Microarrays at JoVE.com

A Guided Materials Screening Approach for Developing Quantitative Sol-gel Derived Protein Microarrays

En guidet materiale screening tilgang til at udvikle sol-gel protein dopede microarrays ved hjælp af en spirende pin-udskrivning fremstillingsmetode beskrives. Denne metode er påvist gennem udvikling af acetylcholinesterase og multikinasehæmmer microarrays, som anvendes til omkostningseffektiv små molekyler screening.

En guidet Materials Screening tilgang til udvikling af Kvantitative Sol-gel protein Microarrays

Microarrays have found use in the development of high-throughput assays for new materials and discovery of small-molecule drug leads. Herein we describe a ...

Research

JoVE Journal

Chemistry

Seeded Synthesis of CdSe/CdS Rod and Tetrapod Nanocrystals

We demonstrate a method for the synthesis of multicomponent nanostructures consisting of CdS and CdSe with rod and tetrapod morphologies. A seeded ...

Covalent Binding of BMP-2 on Surfaces Using a Self-assembled Monolayer Approach

Kovalent binding af BMP-2 på overflader med en selv-samlet monolag Approach

Bone morphogenetic protein 2 (BMP-2) is a growth factor embedded in the extracellular matrix of bone tissue. BMP-2 acts as trigger of mesenchymal cell ...

Synthesis and Purification of Iodoaziridines Involving Quantitative Selection of the Optimal Stationary Phase for Chromatography

Syntese og oprensning af Iodoaziridines Inddragelse kvantitativ udvælgelse af det optimale stationære fase til kromatografi

The highly diastereoselective preparation of cis-N-Ts-iodoaziridines through reaction of diiodomethyllithium with N-Ts aldimines is described. ...

Supercritical Nitrogen Processing for the Purification of Reactive Porous Materials

Superkritisk Nitrogen Behandling til rensning af reaktive porøse materialer

Supercritical fluid extraction and drying methods are well established in numerous applications for the synthesis and processing of porous materials. ...

Glycan Node Analysis: A Bottom-up Approach to Glycomics

Glycan Node Analyse: en bottom-up tilgang til Glycomics

Synthesized in a non-template-driven process by enzymes called glycosyltransferases, glycans are key players in various significant intra- and ...

Microfluidic Pneumatic Cages: A Novel Approach for In-chip Crystal Trapping, Manipulation and Controlled Chemical Treatment

Mikrofluide Pneumatiske Bure: en ny tilgang til In-chip Crystal fældefangst, Manipulation og kontrollerede kemiske behandling

The precise localization and controlled chemical treatment of structures on a surface are significant challenges for common laboratory technologies. ...

Synthesis of a Water-soluble Metal&#8211;Organic Complex Array

Synthesis of a Water-soluble MetalÃƒÆ’Ã‚Â¢ÃƒÂ¢Ã¢â‚¬Å¡Ã‚Â¬ÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã…â€œOrganic Complex Array

Syntese af en Vandopløseligt Metal-Organic Complex Array

We demonstrate a method for the synthesis of a water-soluble multimetallic peptidic array containing a predetermined sequence of metal centers such as ...

Facet-to-facet Linking of Shape-anisotropic Colloidal Cadmium Chalcogenide Nanostructures

Facet til facet sammenkædning af form-anisotrope kolloid Cadmium Chalcogenide nanostrukturer

Here, we describe a protocol that allows for shape-anisotropic cadmium chalcogenide nanocrystals (NCs), such as nanorods (NRs) and tetrapods (TPs), to be ...

Chemical Synthesis of Porous Barium Titanate Thin Film and Thermal Stabilization of Ferroelectric Phase by Porosity-Induced Strain

Kemisk syntese af porøse Barium Titanate tynd Film og termisk stabilisering af Ferroelectric fase af porøsitet-induceret stamme

Barium titanate (BaTiO3, hereafter BT) is an established ferroelectric material first discovered in the 1940s and still widely used because of its ...

Technical Aspect of the Automated Synthesis and Real-Time Kinetic Evaluation of [11C]SNAP-7941

Technical Aspect of the Automated Synthesis and Real-Time Kinetic Evaluation of [11C]SNAP-7941

Tekniske aspekt af automatiseret syntese og real-time Kinetic evaluering af [11C] SNAP-7941

Positron emission tomography (PET) is an essential molecular imaging technique providing insights into pathways and using specific targeted radioligands ...