Name: a guided materials screening approach for developing quantitative sol-gel derived protein microarrays
Uploaded: 2013-08-26T12:00:00
Duration: 10 min 44 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Guided Materials Screening Approach for Developing Quantitative Sol-gel Derived Protein Microarrays at JoVE.com

Forfatterne takker Maria Monton, Julie Lebert, Jessamyn Lille, Xin Ge og Laura Lautens for å få hjelp i utvikling av protein mikromatriser. Forfatterne også takke Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada (NSERC) for å finansiere dette arbeidet. Forfatterne også takke Canada Foundation for innovasjon og Ontario Innovation Trust for støtte i dette arbeidet. JDB holder Canada Research Chair i Bioanalytical kjemi og Biointerfaces.

<ol>
	<li>Schena, M. M., Shalon, D. D., Davis, R. W. R., Brown, P. O. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+monitoring+of+gene+expression+patterns+with+a+complementary+DNA+microarray.">Quantitative monitoring of gene expression patterns with a complementary DNA microarray.</a> Science (New York, N.Y.). 270 (5235), 467-470 (1995).</li><li>MacBeath, G., Schreiber, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Printing+proteins+as+microarrays+for+high-throughput+function+determination.">Printing proteins as microarrays for high-throughput function determination.</a> Science (New York, N.Y.). 289 (5485), 1760-1763 (2000).</li><li>Zhu, H. H., Bilgin, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+analysis+of+protein+activities+using+proteome+chips.">Global analysis of protein activities using proteome chips.</a> Science (New York, N.Y.). 293 (5537), 2101-2105 (2001).</li><li>Hook, A. L., Chang, C. -. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combinatorial+discovery+of+polymers+resistant+to+bacterial+attachment.">Combinatorial discovery of polymers resistant to bacterial attachment.</a> Nature Biotechnology. , (2012).</li><li>Monton, M. R. N., Lebert, J. M., Little, J. R. L., Nair, J. J., McNulty, J., Brennan, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Sol-Gel-Derived+Acetylcholinesterase+Microarray+for+Nanovolume+Small-Molecule+Screening.">A Sol-Gel-Derived Acetylcholinesterase Microarray for Nanovolume Small-Molecule Screening.</a> Analytical Chemistry. 82 (22), 9365-9373 (2010).</li><li>Cho, E. J., Tao, Z., Tehan, E. C., Bright, F. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multianalyte+pin-printed+biosensor+arrays+based+on+protein-doped+xerogels.">Multianalyte pin-printed biosensor arrays based on protein-doped xerogels.</a> Analytical Chemistry. 74 (24), 6177-6184 (2002).</li><li>Cho, E. J., Tao, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tools+to+Rapidly+Produce+and+Screen+Biodegradable+Polymer+and+Sol-Gel-Derived+Xerogel+Formulations.+Applied+Spectroscopy.">Tools to Rapidly Produce and Screen Biodegradable Polymer and Sol-Gel-Derived Xerogel Formulations. Applied Spectroscopy.</a> Society for Applied Spectroscopy. 56 (11), 1385-1389 (2002).</li><li>Ge, X., Lebert, J. M., Monton, M. R. N., Lautens, L. L., Brennan, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Materials+Screening+for+Sol-Gel-Derived+High-Density+Multi-Kinase+Microarrays.">Materials Screening for Sol-Gel-Derived High-Density Multi-Kinase Microarrays.</a> Chemistry of Materials. 23 (16), 3685-3691 (2011).</li><li>Rupcich, N., Green, J. R. A., Brennan, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanovolume+Kinase+Inhibition+Assay+Using+a+Sol-Gel-Derived+Multicomponent+Microarray.">Nanovolume Kinase Inhibition Assay Using a Sol-Gel-Derived Multicomponent Microarray.</a> Analytical Chemistry. 77 (24), 8013-8019 (2005).</li><li>Rupcich, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coupled+enzyme+reaction+microarrays+based+on+pin-printing+of+sol-gel+derived+biomaterials.">Coupled enzyme reaction microarrays based on pin-printing of sol-gel derived biomaterials.</a> Analytica Chimica Acta. 500 (1-2), 3-12 (2003).</li><li>MacBeath, G. G., Schreiber, S. L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Printing+proteins+as+microarrays+for+high-throughput+function+determination.">Printing proteins as microarrays for high-throughput function determination.</a> Science (New York, N.Y.). 289 (5485), 1760-1763 (2000).</li><li>Stillman, B. A. B., Tonkinson, J. L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FAST+slides:+a+novel+surface+for+microarrays.">FAST slides: a novel surface for microarrays.</a> BioTechniques. 29 (3), 630-635 (2000).</li><li>Rupcich, N., Goldstein, A., Brennan, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+sol-gel+formulations+and+surface+treatments+for+the+development+of+pin-printed+protein+microarrays.">Optimization of sol-gel formulations and surface treatments for the development of pin-printed protein microarrays.</a> Chemistry of Materials. 15 (9), 1803-1811 (2003).</li><li>Gill, I., Ballesteros, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Encapsulation+of+biologicals+within+silicate,+siloxane,+and+hybrid+sol-gel+polymers:+An+efficient+and+generic+approach.">Encapsulation of biologicals within silicate, siloxane, and hybrid sol-gel polymers: An efficient and generic approach.</a> Journal of the American Chemical Society. 120 (34), 8587-8598 (1998).</li><li>Brook, M. A., Chen, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteins+entrapped+in+silica+monoliths+prepared+from+glyceroxysilanes.">Proteins entrapped in silica monoliths prepared from glyceroxysilanes.</a> Journal of Sol-gel Science and Technology. 31 (1), 343-348 (2004).</li><li>Brook, M. A., Chen, Y., Guo, K., Zhang, Z., Brennan, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sugar-modified+silanes:+precursors+for+silica+monoliths.">Sugar-modified silanes: precursors for silica monoliths.</a> Journal of Materials Chemistry. 14 (9), 1469 (2004).</li><li>Zhang, J., Chung, T., Oldenburg, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Simple+Statistical+Parameter+for+Use+in+Evaluation+and+Validation+of+High+Throughput+Screening+Assays.">A Simple Statistical Parameter for Use in Evaluation and Validation of High Throughput Screening Assays.</a> Journal of Biomolecular Screening. 4 (2), 67-73 (1999).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Next+generation+of+protein+microarray+support+materials:+Evaluation+for+protein+and+antibody+microarray+applications.">Next generation of protein microarray support materials: Evaluation for protein and antibody microarray applications.</a> Journal of Chromatography A. , 1-8 (2013).</li><li>Bhatia, R. B., Brinker, C. J., Gupta, A. K., Singh, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aqueous+Sol-Gel+Process+for+Protein+Encapsulation.">Aqueous Sol-Gel Process for Protein Encapsulation.</a> Chemistry of Materials. 12 (8), 2434-2441 (2000).</li></ol>

Vi har ingenting å avsløre.

Den metodikk som beskrives her ble valgt som den mest passende for å identifisere utskrivbare sol-gel avledet materiale med en kontakt skriver, som produserer en tids-og kostnadseffektiv fremgangsmåte for rask identifisering av optimale materialer uten å screene et stort antall materialer. Fra et totalt ~ 20.000 mulige materialer, var det mulig å identifisere ~ 200 materialer som var egnet til trykking på grunnlag av geldannelsen tid alene. Dette betydelig redusert antall materialer som trengs for å være forberedt for senere utskrift prøvelser. Disse utskrivbare materiale ble deretter skrevet ut fire glideflatene for totalt 768 material-skli kombinasjoner. I gjennomsnitt kan 50 flekker / gjentak av ett materiale skrives ut i ~ 3 min, inkludert sample lasting, spot avsetning og pin rengjøring. Av disse 155 materialer, eller omtrent 20%, lov til å skrive ut det maksimale antall plasser pr løsning opptak og produsert reproduserbare spot størrelser. Det bør bemerkes at av de fire slide overflater testet, materialer trykt bedre i rekkefølge: amin&gt; epoxy&gt; aldehyd&gt; PMMA; PMMA lysbilder ikke produsere nyttige arrays for noen materialer. Dette var sannsynligvis tilskrives polariteten av overflatebelegget. Sammenligning av de nevnte glideflatene, ble den mer polare amin og epoksy er bedre egnet for de vandige solene sammenlignet med PMMA lysbilder. Videre, av de testede flater, aminet belagte objektglass som et mulig positivt ladet overflate for det avsatte anionisk sol til bindingen. Vi mistenker, nanopartiklene silika i grenseflaten mellom lysbilde og sol samhandle langs overflaten. Både epoxy og aldehyd glideflatene mangler den samme innledende kostnad-basert samhandling. For å sikre optimal sted deponering er det sterkt anbefalt å bruke forbelagte lysbilder fra en leverandør som Arrayit. In-house belegg gir inkonsistente overflater som fører til dårlig sted reproduserbarhet 13, og i noen tilfeller kan føre til kvantifisering probblemer. 18. Av like stor betydning, temperatur og fuktighet påvirker &quot;trykkbarhet&quot; av materialet. Selv om ingen detaljerte studier på effekter relatert til temperatur ble utført, ble utskrift alltid utført ved romtemperatur (23 ± 3 ° C). Fuktighet (større enn 80%) ble også kontrolleres innen print kammeret for å forhindre uregelmessig form avleiring på grunn av små mengder (0,7 til 2,3 deponering nl) og fordamping. Mens materialet skjermen ble guidet mot å identifisere optimale sol-gel avledet materialer spesielt for trykking av verke og kinaser, et lite sett med materialer ble identifisert som jobbet for begge typer proteiner. Faktisk ble begge de materialene som ble identifisert for kinase microarray fabrikasjon basert på SS + PVA + glyserol, og både materialer ble også identifisert i løpet av de 26 materialene som er valgt for AChE mikromatriser. Disse &quot;optimale&quot; materialer kan tilby et generisk utgangspunkt for å utvikle videre protei-dopet sol-gel baserte mikromatriser og små skjermer sentrert rundt disse preparatene kan identifisere enda bedre materialer for microarray fabrikasjon. Et annet punkt å merke seg er betydningen av det anvendte enzym. I tilfelle av AChE (en heller robust enzym), beholdt 26 (eller omkring 40%) av de opprinnelige 66 materiale identifisert som assay-kompatibel aktiviteten av innesluttet AChE. Imidlertid, for de mer delikate kinaser, var bare 2 av de 69 assay-kompatible sammensetninger, eller omtrent 3% til materialet, i stand til å beholde aktiviteten av alle kinaser. Selv om et tilstrekkelig antall forskjellige enzymer ikke har blitt studert for å gjøre konkluderende påstander, synes det som om optimalisering matrise fabrikasjon med forholdsvis ustabile enzymer kan føre til identifikasjon av materialer som kan innfange et bredt utvalg av proteiner for å tillate mutliplexed mikromatrise fabrikasjon. Uavhengig av det valgte proteinet, var det store cut-off faktor for identifisering trykkbare materialer behovet for en langmaterielle geling ganger (&gt; 2,5 t). Ved utvikling SS sol-gel baserte materialer, er det meget viktig å sikre at etter ionebytting og filtrering, er den sol ved omtrent pH 4.. Soler med en lavere initiell pH kan resultere i materialer med en lavere-enn-nøytral pH, noe som kan påvirke enzymaktivitet. 19. Justere mengden Dowex (ionebytterharpiks) til SS kan forandre endelig pH av sol. Når en ny batch av harpiksen er fremstilles forholdet mellom harpiks til SS må justeres slik at det dannes soler ved omtrent pH 4 ved å følge prosedyren i del 2 av protokollen. Likeledes er fremstillingen av krystallinske DGS ofte en kilde til feil i forbindelse med materiale svikt ved bruk av DGS baserte soler for innestengning biomolekyl. Selv om det ikke er rapportert her i detalj, må stor forsiktighet for å bli tatt i løpet av syntesen av krystallinske DGS, særlig behovet for å unngå tilstedeværelse av vann i løpet av syntesen, som kan produsere polyglycerated silikates heller enn monomere DGS. Også på grunn av den hygroskopiske natur av DGS, trenger den krystallinske prøve som skal lagres og uttørrede brukt i løpet av 6 måneder etter syntese. Krystallinske DGS eldre enn 6 måneder kan ikke løses fullt ut (på grunn av delvis kondensert Polyglyceryl silikat materiale) selv med lydbehandling i et surt miljø. Ufullstendig DGS oppløsning produserer solene med ukjente og ukontrollerbare silica innhold og dermed mindre robuste materialer. Et viktig poeng å merke seg med kontakt utskriften er kvaliteten på pinnene. Skadet eller mishandlet pins (figur 9) vil aldri gi reproduserbare arrays uavhengig av materialet som skrives ut. Det anbefales å sjekke pin kvalitet ved hjelp av en disseksjon mikroskop for å sikre ødelagt eller tett pins brukes ikke. Forsiktig håndtering sikrer lang levetid for pinnene. Fri bevegelse av tappen er også viktig. I tilfeller der fuktighet blir fanget i skrivehodet mellom hodet og pinnen, pinnenvil ikke plass på riktig måte og således vil ikke gjøre god kontakt med overflaten, noe som resulterer i en mangel på avleiring av materiale. I konklusjonen, har vi gitt en detaljert, flertrinns screening tilnærming for å utvikle high-density protein dopet pin-trykte mikromatriser. Denne screening omfatter optimalisering av materialegenskapene (geldannelsen tid og trykkbarhet) for å tillate trykking av materialer, fulgt av mer fokusert screening for å identifisere materialer som er forenlig med et bestemt assay og i stand til å beholde enzymaktivitet. Dette guidet materialet screening tilnærming kan brukes til flere microarray formater for å redusere tid og kostnader forbundet med å produsere effektive høy tetthet mikromatriser.

Mikromatriser har vunnet popularitet i det vitenskapelige samfunn som en metode for å øke analysen gjennomstrømming. Siden utviklingen av microarray teknologi for å vurdere genuttrykk 1 på midten av 1990-tallet har mikromatriser funnet bruk i utviklingen av high-throughput analyser for å identifisere protein-protein-og protein-lite molekyl interaksjoner, og å finne nye materialer med unike egenskaper. 2-5 Mer nylig har mikromatriser blitt utviklet hvori spesifikke materialer benyttes for å immobilisere funksjonelle proteiner, produsere en tredimensjonal mikroarray element innenfor hvilke proteiner som er fanget, noe som muliggjør lettvint måling av enzymatisk aktivitet, og inhibering på mikroarray seg selv ved hjelp av en passende fluorescens analysen som er koblet til underlaget omsetning. 5-10 Viktigere, kan slike mikromatriser være utformet for å omfatte alle nødvendige komponenter til skjermen prøver og kontroller sammen i en svært parallell måte. 5,8 &lt;/ P&gt; Tidlige eksempler på protein mikromatriser ble vanligvis fremstilt ved hjelp av standardmetoder for protein immobilisering på faste bærere, slik som kovalent tilknytning, 11 affinitet fange 3 og fysikalsk adsorpsjon. 12. Selv om disse metoder for bio-immobilisering tillate økt prøven konsentrasjon og akselerert reaksjonskinetikk kreves for analysen miniatyrisering, de hver lider ulemper. Generelt er alle føre til en reduksjon i native biomolekyl funksjonalitet på grunn av kjemisk modifisering av overflaten, hindres adgang til aktive seter, eller uriktig orientering på grunn av ikke-spesifikk immobilisering. Dermed har alle disse metoder gir lavere assay følsomhet til tross for en økning i biomolekyl avsetning, en reaksjon som sannsynligvis oppstår på grunn av behovet for å kunstig binde biomolekyler til en overflate. En voksende tilnærming for produksjon av funksjonelle biomolekyl mikromatriser er gjennom pin-utskrift av protein-dopetsilikasoler bort på fast underlag, som er typisk enten funksjonaliseres glassplater eller individuelle brønner i mikrobrønnplater. Den sol-gel-prosessen i seg selv finner sted i et vandig miljø ved romtemperatur, og det er den flytende forløper som er trykt og deretter geler som kunne fange biomolekyler i 3D-matrise, slik at for høy protein lasting 13 samt innlagring av flere komponenter innenfor den samme mikroarray element. 13,14 Tilpasning av sol-gel avledet materiale kan gjøres gjennom nøye utvalg av forskjellige silika-forløpere, samt ved å endre den vandige komponenten gjennom bruk av forskjellige buffere (pH, ionestyrke) og inkludering av forskjellige additiver (polymerer, små molekyler) til å oppnå et optimalt materiale, avhenger den spesifikke arten av dette på biomolekyl som er innfanget. 10. En potensiell begrensning forbundet med å utvikle sol-gel avledet protein mikromatriser via pin-utskrift erbehovet for å identifisere sol-gel komposittmaterialer som kan skrives ut uten herding i pin eller viser uønskede egenskaper (uforklarlige spot størrelser, sprekker, dårlig vedheft, inkompatibilitet med Analysekomponentene, dårlig protein aktivitet) når trykket på en overflate. fem Samtidig optimalisering av alle disse parametrene utelukker en tilnærming hvori materialene kan utformes de novo, eller undersøkt langsomt i en seriell måte. På den annen side, er tilfeldig screening av flere tusen eller titusener av materialer hverken tid-nor kostnadseffektiv. I denne artikkelen beskriver vi en rettet screening-metode som tillater hurtig identifisering av egnede materialer for fremstilling av protein mikromatriser uten behov for å tilfeldig screene et stort antall materialer. Ved hjelp av en guidet tilnærming, er materialer som egner seg for microarray utskrift først identifisert, etterfulgt av en rekke småskala skjermer for å identifisere optimal sol-gel avledet materialeral-kombinasjoner som kan skrives på reproduserbar måte, uten å sprekke, og er forenlig med et bestemt assay. Endelig er optimale materialer identifisert basert på retensjon av enzymaktivitet og ytelse i en endelig liten molekyl-screening-analyse. På denne måten, kan optimale materialer bli identifisert fra mange tusen kandidater ved hjelp av bare noen få hundre assay-fremgangsmåten. Vi demonstrerer denne tilnærmingen for fabrikasjon av både høy tetthet og acetylcholinesterase multikinase mikromatriser, og bruken av slike mikromatriser for små-molekyl-screening.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Reagent/Material</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly(vinyl alcohol) (PVA)</td>
			<td>Sigma-Alderich</td>
			<td>360627</td>
			<td>80% hydrolozyed, Mw 600</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyethylene glycol 600 (PEG)</td>
			<td>Sigma-Alderich</td>
			<td>87333</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyethylenimine (PEI)</td>
			<td>Sigma-Alderich</td>
			<td>482595</td>
			<td>50% (w/w) solution in water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carboxyethylsilanetriol (Si-COOH)</td>
			<td>Gelest, Inc.</td>
			<td>SIC2263.0</td>
			<td>25% in water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-(3-triethoxysilylpropyl) gluconamide(GLS)</td>
			<td>Gelest, Inc.</td>
			<td>SIT8189.0</td>
			<td>50% in ethanol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>bis[(3-methyldimethoxysilyl)propyl]polypropylene oxide (MDSPPO)</td>
			<td>Gelest, Inc.</td>
			<td>SIB1660.0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methyltrimethoxysilane (MTMS)</td>
			<td>Gelest, Inc.</td>
			<td>SIM6560.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bis(triethoxysiyly)ethane (Bis-TEOS)</td>
			<td>Gelest, Inc.</td>
			<td>SIB1817.0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3-Aminopropyltriethoxysilane (APTES)</td>
			<td>Gelest, Inc.</td>
			<td>SIA0610.0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Sigma-Alderich</td>
			<td>49767</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Sorbitol</td>
			<td>Sigma-Alderich</td>
			<td>240850</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-(+)-Trehalose dihydrate</td>
			<td>Sigma-Alderich</td>
			<td>T9531</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma-Alderich</td>
			<td>X-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N&#949;-Acetyl-L-lysine</td>
			<td>Sigma-Alderich</td>
			<td>A4021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris(hydroxymethyl)aminomethane</td>
			<td>Sigma-Alderich</td>
			<td>154563</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma-Alderich</td>
			<td>H3375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydroxide, 1.0 N</td>
			<td>LabChem Inc.</td>
			<td>LC24350-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric Acid, 1.0 N/0.1 N</td>
			<td>LabChem Inc.</td>
			<td>LC15300-2/LC152220-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride</td>
			<td>Sigma-Alderich</td>
			<td>M8266</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diglycerolsilane (DGS)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Prepared in laboratory</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium silicate solution</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>SS338-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dowex 50WX8-100 ion exchance resin</td>
			<td>Sigma-Alderich</td>
			<td>217492</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetylthiocholine iodide</td>
			<td>Sigma-Alderich</td>
			<td>1480</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetylcholinesterase from Electrophorus electricus (electric eel)</td>
			<td>Sigma-Alderich</td>
			<td>C2888</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BODIPY FL L-Cystine</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>B-20340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pro-Q Diamond Phosphoprotein/Phosphopeptide Microarray Stain Kit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>P33706</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adenosine 5&#39;triphosphate disodium salt (ATP) solution</td>
			<td>Sigma-Alderich</td>
			<td>A6559</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MAP Kinase 2 (MAPK2)</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>454850</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>p38&#945;/SAPK2a (T106M), active</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>14-687M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epidermal growth factor (EGFR)</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td></td>
			<td>Donated by Millipore</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycogen synthase kinase 3&#946; (GSK-3&#946;)</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>14-306</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Myelin basic protein (MBP)</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td></td>
			<td>Substrate for MAPK2 and p38&#945;, Donated by Millipore</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GSM</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>12-533</td>
			<td>Substrate for GSK-3&#946;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-glu-tyr polypeptide p(E4Y)</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>12-440</td>
			<td>Substrate for EGFR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stealth pin</td>
			<td>ArrayIt</td>
			<td>SMP3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stealth pin</td>
			<td>ArrayIt</td>
			<td>SMP7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amine coated slides</td>
			<td>ArrayIt</td>
			<td>SMM2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aldehyde coated slides</td>
			<td>ArrayIt</td>
			<td>SMA2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Exposy coated slides</td>
			<td>ArrayIt</td>
			<td>SME2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly(methylmethacrylate) (PMMA) coated slides</td>
			<td>Exakt Technologies Inc.</td>
			<td>41500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.2-&#956;m syringe filter</td>
			<td>PALL Life Sciences</td>
			<td>4612</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Virtek Contact Printer</td>
			<td>BioRad</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Novaray Fluorescence Slide Imager</td>
			<td>Alpha Innotech Corporation</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Desktop microarray centrifuge</td>
			<td>ArrayIt</td>
			<td>MHC110V</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MilliQ Synthesis A10</td>
			<td>Millipore</td>
			<td></td>
			<td>Used to filter all water required for experiments</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a guided materials screening approach for developing quantitative sol-gel derived protein microarrays

Mikromatriser har funnet bruk i utviklingen av high-throughput analyser for nye materialer og oppdagelse av små-molekyl narkotika fører. Heri beskriver vi en guidet materiale screening tilnærming for å identifisere sol-gel baserte materialer som er egnet for produksjon av tredimensjonale protein mikromatriser. Tilnærmingen identifiserer første materialer som kan skrives som mikromatriser, smalner ned antall materialer ved å identifisere de som er forenlig med et bestemt enzym analysen, og deretter hones inn på optimale materialer basert på oppbevaring av maksimal enzymaktivitet. Dette blir anvendt for å utvikle mikromatriser egnet for to forskjellige enzymanalyser, en ved hjelp av acetylcholinesterase og den andre ved hjelp av et sett med fire viktige kinaser som er involvert i kreft. I hvert tilfelle var det mulig å produsere mikromatriser som kunne brukes for kvantitativ små-molekyl screening-analyser og produksjon av doseavhengige inhibitor responskurver. Viktigere, muligheten til å skjerme mange kompisrials produsert informasjon om hvilke typer materialer som passer best både microarray produksjon og oppbevaring av enzymaktivitet. Materialet data gir innsikt i grunnleggende materielle krav som er nødvendige for å skreddersy optimale, høy tetthet sol-gel avledet mikromatriser.

Ved å utføre en guidet faktoranalyse for materialet skjermen, var vi i stand til å minimere antall materialer som er testet fra ~ 20 000 til noen få hundre som hadde geling ganger egner seg for utskrift. Ved å bruke en streng retningslinje som krever materielle gelation tid på 2,5 timer eller mer, ble materialer sannsynlig å tette utskrift pins eller produsere uforklarlige arrays aldri skrevet ut. De utskrivbare materiale identifisert til å ha tilstrekkelig (&gt; 2,5 t) geling ganger ble trykket på fire forskjellige functionalized glass glideflatene. For å bli betraktet som &quot;utskriftsvennlig&quot;, hadde det maksimale antall plasser pr opptak volumet av pinnen som skal skrives ut (SMP3 = 200). Flekker ble også vurdert for flekk morfologi å sikre at ingen uønsket sprekkdannelse eller faseseparasjon hadde skjedd ved hjelp av enkle lysfelt mikroskopi som vist i figur 2.. Fra dette stadiet av identifiserte utskrivbare materiale, ble mikromatriser produsert med verke ogkinaser innlemmes i bufret vandig komponent. Materialer som var kompatibel med analyseprosedyren (inkludert potensiell overtrykk og vasking eller flekker trinn) ble identifisert ved å observere oppbevaring av microarray flekker (ingen sprekker, tap av flekker eller uvanlige fluorescens mønstre) og en positiv kontroll (PC) til negativ kontroll (NC ) ratio større enn 1 som observeres gjennom bildet. Da dette var omtrent 50% av materialet, en større PC / NC-forhold på 3 ble brukt for å definere optimale materialer med retensjon av proteinaktivitet. Gjennom denne fremgangsmåte, 26 sol-gel avledet materialer som inneholder AChE og to materialer som inneholder kinaser tilfredsstilte&gt; 3 PC / NC kriterier. Figur 3 og Figur 4 viser en grafisk oversikt over de fem guidet materiale skjermen fremgangsmåten for identifisering av optimale AChE og kinase mikromatriser, henholdsvis. Assayene kan også bli validert gjennom generering av en Z-score. 17. </sup&gt; Dette ble gjort ved hjelp av det materialet som produserte den høyeste PC / NC-forhold. Figur 5 viser Z &#39;plottet framskaffet ved å sammenlikne det signal som genereres fra 200 steder, 100 PC og 100 NC etter overtrykking indikatoren fargestoff og substrat på AChE matrisen. Den AChE og kinasen arrays resulterte i de respektive Z &#39;score på 0,60 og 0,67, noe som indikerer en utmerket assay. Imidlertid bør det bemerkes at før analysen validering, på-array-enzymet, fargestoff, substrat og kofaktor konsentrasjoner måtte bli optimalisert ved overtrykking et område av konsentrasjoner av hver komponent, og å velge den konsentrasjon som produserte den høyeste signal, som beskrevet i detalj andre steder . 5 Å validere analyser, ble kvantitative hemming data innhentet ved hjelp av kjente og ukjente AChE hemmere, med resultater utført i duplikat og brukes til å produsere like plott (figur 6A) og inhiberingskurver (Tall 6B og 6C). &lt;sterke&gt; Flekkene ble først påtrykkes blandinger av kjente biologisk aktive små-molekyl-inhibitorer deretter med fargestoff og substrat, og kontroll-blandinger inneholdende enten kjente hemmere eller ingen inhibitor ble inkludert. Dupliserte tomter ble generert å vurdere enzymaktiviteten, og noen blandinger som resulterte i mindre enn 25% enzymaktivitet ble vurdert positivt for hemming. Individuelle forbindelser fra slike blandinger ble deretter testet i duplikat for å identifisere den spesifikke lite molekyl (er) som er ansvarlige for inhibering. Når de er identifisert, disse små molekylene ble brukt til å generere kvantitative inhiberingskurver for å bestemme IC50-verdier og inhiberingskonstantene. Lignende kvalitative resultater ble oppnådd ved hjelp av multikinase array med en felles kinase inhibitor, staurosporin. Figur 7A og 7B viser microarray image og vise at signalet intensiteter etter overtrykk og flekker multikinasematrise er som forventet for en negativ kontroll (- ATP), positiv kontroll (+ ATP) og kjent hemmer (+ ATP + inh). For å demonstrere evnen til å oppnå kvantitative data hemming fra mikromatriser, ble en konsentrasjonsavhengig inhibering assay utført for en enkelt kinase. Som vist i figurene 8A og 8B, minsker signalintensitet som inhibitorkonsentrasjon øker, og responsen følger den forventede konsentrasjonsavhengig inhibering kurven for p38α/MBP kinase / substrat-system. <img alt="Figur 1" src="/files/ftp_upload/50689/50689fig1.jpg" /> Figur 1. Generell skjematisk for guidet materialer screening tilnærming. Hver blokk representerer et skritt på skjermen i kronologisk rekkefølge. Tallene på venstre representerer det totale antall av materialene fremstilt for analyse. Ved hjelp av en gelation gang større enn 2,5 time (materialer med geling ganger mindre enn 2,5 timers are indikert av strikeout), er antall materialer som passerte hvert trinn og fremføres under den materielle skjermen indikeres av tallet til høyre. * Representerer materialer med mindre enn optimal fase separasjon. <img alt="Figur 2" src="/files/ftp_upload/50689/50689fig2.jpg" /> Figur 2. Optiske bilder som viser ulike former for svikt ved materialer på printability trinn på skjermen. Et bilde av en &quot;god&quot; materiale (andre rad, tredje kolonne) er også vist for sammenligning. Gjengitt med tillatelse fra 8 referanse, 2013 opphavsrett American Chemical Society. <img alt="Figur 3" src="/files/ftp_upload/50689/50689fig3.jpg" /> Figur 3. En rettet materialet screening tilnærming for identifisering av optimale materialer for fabrikasjon sol-gel-avledet AChE mikromatriser. Gjengitt med permission fra fem referanse, 2013 opphavsrett American Chemical Society. <img alt="Figur 4" src="/files/ftp_upload/50689/50689fig4.jpg" /> Figur 4. En rettet materialer screening tilnærming for identifisering av optimale materialer for fabrikasjon sol-gel-avledet kinase mikromatriser. Gjengitt med tillatelse fra 8 referanse, 2013 opphavsrett American Chemical Society. <img alt="Figur 5" src="/files/ftp_upload/50689/50689fig5.jpg" /> Figur 5. (A) En del av AChE microarray viser HC (lys grønn) og LC (lys grønn) flekker (en svart-grønn palett ble brukt som PseudoColor for klarhet i presentasjon), (B) et forstørret bilde av eske området for å markere stedet Morfologi og justering,. og (C) en Z &#39;plott Heltrukne linjer angir middelverdien av<html> gjentak, mens stiplede linjer tilsvarer 3SD. Gjengitt med tillatelse fra fem referanse, 2013 opphavsrett American Chemical Society. <img alt="Figur 6" src="/files/ftp_upload/50689/50689fig6.jpg" /> Figur 6. (A) Duplicate tomt for on-matrise screening av syntetiske analoger av Amaryllidaceae alkaloider, (B) IC 50 tomter av identifiserte potensielle hemmere merket som forbindelser en og (C) sammensatte 2, med feilstolper representerer ett standardavvik av gjennomsnittet fra 25 replikater. Representative flekker er vist for å illustrere forskjellene i signal proporsjonalt med inhibitor konsentrasjoner. Gjengitt med tillatelse fra referanse 5, copyright 2013 American Chemical Society. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/50689/50689fig6large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se større figur</a> . nt &quot;fo: keep-together.within-page =&quot; always &quot;&gt; <img alt="Figur 7" src="/files/ftp_upload/50689/50689fig7.jpg" /> Figur 7. På-rekke-analysen av fire kinaser ved hjelp 1.4SS/1.0PVA for innesperring og skrives ut på en amin-derivatiserte lysbilde. (A) et bilde av en seksjon av mikroarray i hvilke flekker med kinaser co-innesluttet med sine respektive substrater ble påtrykt bufferen (NC, øverste rad), eller løsninger som inneholder ATP (PC, midterste raden) eller ATP + staurosporin (nederste rad). (B) stolpediagram som sammenligner signal intensiteter mellom hemmet og uhemmet reaksjoner, etter fratrekk av bakgrunnssignaler og feil barer representerer ett standardavvik av gjennomsnittet fra 25 gjentak. Gjengitt med tillatelse fra 8 referanse, 2013 opphavsrett American Chemical Society. <img alt="Figur 8" src="/files/ftp_upload/50689/50689fig8.jpg" /> Figur 8. Inhibiti. on-analysen på en p38a/MBP mikroarray (A) Deler av mikromatriser viser representative flekker overspotted med varierende konsentrasjoner av staurosporin, som indikert (bildene ble fremstilt ved en enkelt skanning av samme lysbilde; sammensatte bildet er vist for tydelighetens skyld). (B) IC 50 kurve generert fra de analyserte rekke bilder. Intensiteten erholdt ved 100 mM ble subtrahert fra alle bildene, alle andre intensiteter ble normalisert ved å sette intensiteten erholdt ved 10 nM til en verdi på 100% aktivitet. Gjengitt med tillatelse fra 8 referanse, 2013 opphavsrett American Chemical Society. <img alt="Figur 9" src="/files/ftp_upload/50689/50689fig9.jpg" /> Figur 9. Bilder av mikroskopiske stealth pin brukes for kontakt pin-utskrift viser ulike feil: (A) er tilstoppet, (B) bøyd.

Watch this Scientific Journal Video about A Guided Materials Screening Approach for Developing Quantitative Sol-gel Derived Protein Microarrays at JoVE.com

A Guided Materials Screening Approach for Developing Quantitative Sol-gel Derived Protein Microarrays

En guidet materialet screening tilnærming for å utvikle sol-gel avledet protein dopet mikromatriser med en ny pin-utskrift metode for fabrikasjon er beskrevet. Denne metodikken er demonstrert gjennom utvikling av acetylkolinesterase og multikinase mikromatriser, som brukes for kostnadseffektiv små-molekyl screening.

En Guidet Materialer Screening tilnærming for å utvikle kvantitative Sol-gel produsert Protein Mikromatriser

Microarrays have found use in the development of high-throughput assays for new materials and discovery of small-molecule drug leads. Herein we describe a ...

Research

JoVE Journal

Chemistry

Seeded Synthesis of CdSe/CdS Rod and Tetrapod Nanocrystals

Last Syntese av CdSe / CDer Rod og tetrapoder nanokrystaller

We demonstrate a method for the synthesis of multicomponent nanostructures consisting of CdS and CdSe with rod and tetrapod morphologies. A seeded ...

Covalent Binding of BMP-2 on Surfaces Using a Self-assembled Monolayer Approach

Covalent Binding av BMP-2 på overflater Bruke en Self-montert med ett lag Approach

Bone morphogenetic protein 2 (BMP-2) is a growth factor embedded in the extracellular matrix of bone tissue. BMP-2 acts as trigger of mesenchymal cell ...

Synthesis and Purification of Iodoaziridines Involving Quantitative Selection of the Optimal Stationary Phase for Chromatography

Syntese og rensing av Iodoaziridines Involvering Kvantitativ Valg av Optimal stasjonær fase for Kromatografi

The highly diastereoselective preparation of cis-N-Ts-iodoaziridines through reaction of diiodomethyllithium with N-Ts aldimines is described. ...

Supercritical Nitrogen Processing for the Purification of Reactive Porous Materials

Kritisk Nitrogen Processing for rensing av reaktiv porøse materialer

Supercritical fluid extraction and drying methods are well established in numerous applications for the synthesis and processing of porous materials. ...

Glycan Node Analysis: A Bottom-up Approach to Glycomics

Glycan Node analyse: En bottom-up tilnærming til glycomics

Synthesized in a non-template-driven process by enzymes called glycosyltransferases, glycans are key players in various significant intra- and ...

Microfluidic Pneumatic Cages: A Novel Approach for In-chip Crystal Trapping, Manipulation and Controlled Chemical Treatment

Microfluidic Pneumatiske Cages: A Novel Approach for In-chip Crystal Trapping, Manipulasjon og kontrollert kjemisk behandling

The precise localization and controlled chemical treatment of structures on a surface are significant challenges for common laboratory technologies. ...

Synthesis of a Water-soluble Metal&#8211;Organic Complex Array

Synthesis of a Water-soluble MetalÃƒÆ’Ã‚Â¢ÃƒÂ¢Ã¢â‚¬Å¡Ã‚Â¬ÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã…â€œOrganic Complex Array

Syntese av en vann-løselig metall-organisk kompleks rekke

We demonstrate a method for the synthesis of a water-soluble multimetallic peptidic array containing a predetermined sequence of metal centers such as ...

Facet-to-facet Linking of Shape-anisotropic Colloidal Cadmium Chalcogenide Nanostructures

Fasett-til-fasett kobling av form-Anisotrop kolloidalt kadmium Chalcogenide nanostrukturer

Here, we describe a protocol that allows for shape-anisotropic cadmium chalcogenide nanocrystals (NCs), such as nanorods (NRs) and tetrapods (TPs), to be ...

Chemical Synthesis of Porous Barium Titanate Thin Film and Thermal Stabilization of Ferroelectric Phase by Porosity-Induced Strain

Syntese av porøse Barium Titanate tynn Film og termisk stabilisering av Ferroelectric fase av porøsitet-indusert stamme

Barium titanate (BaTiO3, hereafter BT) is an established ferroelectric material first discovered in the 1940s and still widely used because of its ...

Technical Aspect of the Automated Synthesis and Real-Time Kinetic Evaluation of [11C]SNAP-7941

Technical Aspect of the Automated Synthesis and Real-Time Kinetic Evaluation of [11C]SNAP-7941

Teknisk aspekt av automatisert syntese og Real-Time Kinetic evaluering av [11C] SNAP-7941

Positron emission tomography (PET) is an essential molecular imaging technique providing insights into pathways and using specific targeted radioligands ...