Name: a guided materials screening approach for developing quantitative sol-gel derived protein microarrays
Uploaded: 2013-08-26T12:00:00
Duration: 10 min 44 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Guided Materials Screening Approach for Developing Quantitative Sol-gel Derived Protein Microarrays at JoVE.com

Авторы благодарят Марию Monton, Джули Lebert, Jessamyn Little, Xin Ge и Лаура Lautens за помощь в развитии белка микрочипов. Авторы также благодарят естественным наукам и инженерным исследованиям Совета Канады (NSERC) для финансирования этой работы. Авторы также благодарят Канада Фонд инноваций и Целевого Онтарио Инновации для поддержки этой работы. JDB заведует кафедрой исследований в Канаде Биоаналитическая химии и Biointerfaces.

<ol>
	<li>Schena, M. M., Shalon, D. D., Davis, R. W. R., Brown, P. O. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+monitoring+of+gene+expression+patterns+with+a+complementary+DNA+microarray.">Quantitative monitoring of gene expression patterns with a complementary DNA microarray.</a> Science (New York, N.Y.). 270 (5235), 467-470 (1995).</li><li>MacBeath, G., Schreiber, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Printing+proteins+as+microarrays+for+high-throughput+function+determination.">Printing proteins as microarrays for high-throughput function determination.</a> Science (New York, N.Y.). 289 (5485), 1760-1763 (2000).</li><li>Zhu, H. H., Bilgin, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+analysis+of+protein+activities+using+proteome+chips.">Global analysis of protein activities using proteome chips.</a> Science (New York, N.Y.). 293 (5537), 2101-2105 (2001).</li><li>Hook, A. L., Chang, C. -. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combinatorial+discovery+of+polymers+resistant+to+bacterial+attachment.">Combinatorial discovery of polymers resistant to bacterial attachment.</a> Nature Biotechnology. , (2012).</li><li>Monton, M. R. N., Lebert, J. M., Little, J. R. L., Nair, J. J., McNulty, J., Brennan, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Sol-Gel-Derived+Acetylcholinesterase+Microarray+for+Nanovolume+Small-Molecule+Screening.">A Sol-Gel-Derived Acetylcholinesterase Microarray for Nanovolume Small-Molecule Screening.</a> Analytical Chemistry. 82 (22), 9365-9373 (2010).</li><li>Cho, E. J., Tao, Z., Tehan, E. C., Bright, F. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multianalyte+pin-printed+biosensor+arrays+based+on+protein-doped+xerogels.">Multianalyte pin-printed biosensor arrays based on protein-doped xerogels.</a> Analytical Chemistry. 74 (24), 6177-6184 (2002).</li><li>Cho, E. J., Tao, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tools+to+Rapidly+Produce+and+Screen+Biodegradable+Polymer+and+Sol-Gel-Derived+Xerogel+Formulations.+Applied+Spectroscopy.">Tools to Rapidly Produce and Screen Biodegradable Polymer and Sol-Gel-Derived Xerogel Formulations. Applied Spectroscopy.</a> Society for Applied Spectroscopy. 56 (11), 1385-1389 (2002).</li><li>Ge, X., Lebert, J. M., Monton, M. R. N., Lautens, L. L., Brennan, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Materials+Screening+for+Sol-Gel-Derived+High-Density+Multi-Kinase+Microarrays.">Materials Screening for Sol-Gel-Derived High-Density Multi-Kinase Microarrays.</a> Chemistry of Materials. 23 (16), 3685-3691 (2011).</li><li>Rupcich, N., Green, J. R. A., Brennan, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanovolume+Kinase+Inhibition+Assay+Using+a+Sol-Gel-Derived+Multicomponent+Microarray.">Nanovolume Kinase Inhibition Assay Using a Sol-Gel-Derived Multicomponent Microarray.</a> Analytical Chemistry. 77 (24), 8013-8019 (2005).</li><li>Rupcich, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coupled+enzyme+reaction+microarrays+based+on+pin-printing+of+sol-gel+derived+biomaterials.">Coupled enzyme reaction microarrays based on pin-printing of sol-gel derived biomaterials.</a> Analytica Chimica Acta. 500 (1-2), 3-12 (2003).</li><li>MacBeath, G. G., Schreiber, S. L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Printing+proteins+as+microarrays+for+high-throughput+function+determination.">Printing proteins as microarrays for high-throughput function determination.</a> Science (New York, N.Y.). 289 (5485), 1760-1763 (2000).</li><li>Stillman, B. A. B., Tonkinson, J. L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FAST+slides:+a+novel+surface+for+microarrays.">FAST slides: a novel surface for microarrays.</a> BioTechniques. 29 (3), 630-635 (2000).</li><li>Rupcich, N., Goldstein, A., Brennan, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+sol-gel+formulations+and+surface+treatments+for+the+development+of+pin-printed+protein+microarrays.">Optimization of sol-gel formulations and surface treatments for the development of pin-printed protein microarrays.</a> Chemistry of Materials. 15 (9), 1803-1811 (2003).</li><li>Gill, I., Ballesteros, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Encapsulation+of+biologicals+within+silicate,+siloxane,+and+hybrid+sol-gel+polymers:+An+efficient+and+generic+approach.">Encapsulation of biologicals within silicate, siloxane, and hybrid sol-gel polymers: An efficient and generic approach.</a> Journal of the American Chemical Society. 120 (34), 8587-8598 (1998).</li><li>Brook, M. A., Chen, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteins+entrapped+in+silica+monoliths+prepared+from+glyceroxysilanes.">Proteins entrapped in silica monoliths prepared from glyceroxysilanes.</a> Journal of Sol-gel Science and Technology. 31 (1), 343-348 (2004).</li><li>Brook, M. A., Chen, Y., Guo, K., Zhang, Z., Brennan, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sugar-modified+silanes:+precursors+for+silica+monoliths.">Sugar-modified silanes: precursors for silica monoliths.</a> Journal of Materials Chemistry. 14 (9), 1469 (2004).</li><li>Zhang, J., Chung, T., Oldenburg, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Simple+Statistical+Parameter+for+Use+in+Evaluation+and+Validation+of+High+Throughput+Screening+Assays.">A Simple Statistical Parameter for Use in Evaluation and Validation of High Throughput Screening Assays.</a> Journal of Biomolecular Screening. 4 (2), 67-73 (1999).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Next+generation+of+protein+microarray+support+materials:+Evaluation+for+protein+and+antibody+microarray+applications.">Next generation of protein microarray support materials: Evaluation for protein and antibody microarray applications.</a> Journal of Chromatography A. , 1-8 (2013).</li><li>Bhatia, R. B., Brinker, C. J., Gupta, A. K., Singh, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aqueous+Sol-Gel+Process+for+Protein+Encapsulation.">Aqueous Sol-Gel Process for Protein Encapsulation.</a> Chemistry of Materials. 12 (8), 2434-2441 (2000).</li></ol>

Нам нечего раскрывать.

Методологии, описанной здесь был выбран как наиболее подходящий для идентификации печати полученных золь-гель материалов с контактом принтер, производя времени и экономически эффективного способа быстрого определения оптимальных материалов без необходимости скрининга большого количества материалов. Из общего числа ~ 20000 потенциальных материалов, можно было определить ~ 200 материалов, которые были пригодны для печати на основе гелеобразования время в одиночестве. Это значительно снизило количество материалов, необходимых для быть подготовлены для последующего испытания печати. Эти печатные материалы затем были напечатаны на 4 слайд поверхностей в общей сложности 768 материала ползуна. В среднем, 50 мест / повторов одного материала могут быть напечатаны в ~ 3 мин, в том числе загрузки образца месте осаждения и пин-код очистки. Из них 155 материалов, или примерно 20%, разрешено для печати максимальное количество пятен на решение поглощение и производится воспроизводимых размеров месте. Следует отметить, что из 4 слIDE поверхностей испытания, материалы печатных лучше в следующем порядке: амин&gt; эпоксидной&gt; альдегид&gt; ПММА, PMMA слайды не производят полезные массивы для любых материалов. Это было вероятно, связано с полярностью покрытия. Сравнение вышеупомянутых поверхностей слайдов, более полярным амин и эпоксидной были лучше подходит для водных золей по сравнению с ПММА слайдов. Кроме того, испытанных поверхности, амин покрытием слайды обеспечить потенциал положительно заряженную поверхность для хранения анионный золь на связь. Мы подозреваем, наночастицы диоксида кремния на границе раздела между ползуном и золь взаимодействуют вдоль поверхности. Оба эпоксидных и поверхности альдегид слайд имеют те же начального заряда на основе взаимодействия. Для обеспечения оптимальной осаждения месте настоятельно рекомендуется использовать предварительно покрытых слайдов из поставщиков, таких как Arrayit. В доме-покрытие производит несовместимым поверхностей, которые приводят к плохой воспроизводимости месте 13, а в некоторых случаях может привести к количественной вероятностиблем. 18 Не менее важно, температуру и влажность влияют на &quot;печатных&quot; материалов. Пока никаких детальных исследований на эффекты, связанные с температурой не проводились, печать всегда проводить при комнатной температуре (23 ± 3 ° C). Влажность (более 80%) также регулировать в печатающую камеры для предотвращения осаждения нерегулярной формы из-за небольших объемов осаждения (0,7-2,3 нл) и испарения. Хотя материал сито направляется к определению оптимального полученных золь-гель материалов, специально для печати АХЭ и киназы, небольшой набор материалов были идентифицированы, который работал на обоих типах белков. Действительно, и из материалов, которые были определены для изготовления биочипов киназы были основаны на SS + глицерин + ПВА, и оба материала также были определены в течение 26 материалов, выбранных для AChE микрочипов. Эти &quot;оптимальный&quot; материалы могут предложить общую отправную точку для дальнейшего развития PROTEв легированном золь-гель на основе микрочипов и небольших экранов вокруг этих композиций может идентифицировать еще лучше материалы для изготовления биочипов. Второй момент, который следует отметить, важность использованного фермента. В случае AChE (а надежные фермента), 26 (или около 40%) исходных материалов 66 определены как анализ совместимые сохранена активность захваченного AChE. Однако для более тонких киназы, только 2 из 69 анализа совместимой композиции, или примерно 3% от материалов, смогли сохранить активность всех киназ. В то время как достаточное количество различных ферментов не были изучены, чтобы сделать окончательный заявления, очевидно, что оптимизация изготовление массив с относительно нестабильными ферментов может привести к идентификации материалов, которые могут захватывать широкий спектр белков, чтобы позволить mutliplexed микрочипов изготовления. Независимо от выбранного белка, основные отсечки фактор для идентификации печати материалов была необходимость в течение длительногоМатериал гелеобразования раза (&gt; 2,5 ч). При разработке СС на основе золь-гель материалов, очень важно обеспечить, чтобы после ионного обмена и фильтрации золь при рН около 4. Золи с более низким начальным рН может привести к материалов с более низким, чем нейтральном рН, которые могут повлиять на активность фермента. 19 регулирования количества Dowex (ионообменная смола), чтобы SS может изменить конечный рН золя. Когда новый пакет смолу получают отношение смолы к SS должна быть отрегулирована таким образом, чтобы получить золи при рН около 4 процедуре, описанной в разделе 2 протокола. Кроме того, получение кристаллической DGS часто является источником ошибки, связанной с материальными сбоя при использовании DGS золи на основе биомолекул для захвата. Хотя это и не представленные здесь подробно, большое внимание должно быть принято во время синтеза кристаллического АРД, в частности необходимость избежать присутствия воды в процессе синтеза, которые могут производить polyglycerated кремнеземTES, а не мономерные DGS. Кроме того, из-за гигроскопичности ДГУ, кристаллический образец необходимо хранить высушенный и использовать в течение 6 месяцев после синтеза. Кристаллический АРД старше 6 месяцев не могут растворяться полностью (вследствие частично конденсированного полиглицерина силикатного материала), даже при обработке ультразвуком в кислой среде. Неполном растворении DGS производит золу с неизвестным и неконтролируемым содержанием кремнезема и, таким образом, менее надежные материалы. Важно отметить с контактной печати является качество контактов. Поврежденные или неправильно штифтов (рис. 9) никогда не будет производить воспроизводимых массивов зависит от материала печати. Рекомендуется проверить контактный качества с использованием рассечение микроскопом, чтобы обеспечить сломанной или забиты контакты не используются. Тщательная обработка обеспечивает длительный срок службы для контактов. Свободное передвижение контактный также важна. В случаях, когда влага удерживается в печатающую головку между головой и контактный, контактныйнельзя будет правильно и, следовательно, не будет делать надлежащий контакт с поверхностью, в результате чего отсутствие осаждения материала. В заключение, мы предоставили подробную, многоступенчатый подход для разработки скрининга высокой плотности белка легированных пин-печатный микрочипов. Скрининг включает в себя оптимизацию свойств материала (время гелеобразования и печатные), чтобы печать материалов, с последующим более сосредоточены скрининга для идентификации материалов, которые совместимы с данным анализа и возможность сохранить ферментативную активность. Этот управляемый подход скрининга материал может быть нанесен на дополнительные форматы микрочипов сократить время и затраты, связанные с производством эффективный высокой плотности микрочипов.

Microarrays завоевали популярность в научном сообществе как способ увеличения пропускной анализа. С развитием технологии микрочипов для оценки экспрессии генов 1 в середине 1990-х, микрочипы нашли применение в развитии высокой пропускной анализов для выявления белок-белковых и белково-Малые взаимодействия молекул и найти новых материалов с уникальными свойствами. 2-5 Совсем недавно микрочипов были разработаны котором конкретные материалы используются для иммобилизации функциональных белков, образуя трехмерную микрочипов элемент, в котором белки захватываются, что обеспечивает легкое измерение ферментативной активности и ингибирование микрочипов себя, используя подходящий флуоресценции анализ, который соединен с подложкой оборота. 5-10 Важно отметить, что такие микрочипы могут быть разработаны, чтобы включить все компоненты, необходимые для скрининга образцов и контролей вместе в высшей степени параллельно моды. 5,8 &lt;/ P&gt; Ранние примеры белка микрочипов, как правило, получают с использованием стандартных методов иммобилизации белков на твердые носители, такие как ковалентное присоединение, 11 сродства захвата 3 и физической адсорбции. 12 Хотя эти методы биологической иммобилизации позволяет увеличить концентрацию образца и ускоренного кинетика реакции необходимы для Анализ миниатюризации, каждый из них страдает недостатками. В общем, все вызывают снижение родной биомолекулы функциональности вследствие химической модификации поверхности, пространственно затрудненные доступ к активным центрам или неправильной ориентации из-за неспецифического иммобилизации. Таким образом, все методы приводят к снижению чувствительности анализа, несмотря на увеличение осаждение биомолекул, ответ, вероятно, возникает из-за необходимости искусственно связывать биомолекул на поверхности. Новый подход к производству функциональных биомолекулы микрочипов через штифт печати белка, легированногозоли диоксида кремния на твердые носители, которые обычно либо функционализированный предметные стекла или отдельные лунки пластинок микролуночные. Золь-гель процесс сам по себе происходит в водной среде при комнатной температуре, а это жидкий предшественник, который напечатан а затем гели для улавливания биомолекул в 3D-матрицы, что обеспечивает высокое содержание белка загрузки 13, а также улавливание нескольких компонентов в пределах и тот же элемент микрочипов. 13,14 пошива из полученных золь-гель материал может быть сделано путем тщательного подбора различных предшественников диоксида кремния, а также путем изменения водного компонента посредством использования различных буферов (рН, ионная сила), и включение различные добавки (полимеры, небольшие молекулы), чтобы достичь оптимального материала, специфический характер которого зависит от биомолекулы, захваченной 10. Потенциальным ограничением, связанные с разработкой полученных золь-гель микрочипов белка через контакт-печатьнеобходимость выявления золь-гель на основе композиционных материалов, которые могут быть напечатаны без гелеобразующее в контактный или показ нежелательных свойств (невоспроизводимой размеров пятна, трещины, плохая адгезия, несовместимость с анализа компонентов, низкая активность белка) После печати на поверхности. 5 одновременных оптимизации всех этих параметров исключает материалов подход котором может быть выполнена заново, либо рассмотрены медленно в последовательной манере. С другой стороны, случайные скрининг многие тысячи или десятки тысяч материалов, ни времени, ни-рентабельным. В этой статье мы опишем направлены скрининга подход, который позволяет быструю идентификацию подходящих материалов для производства белковых микрочипов без необходимости случайно скрининга большого количества материалов. Использование управляемых подход, материалы, пригодные для печати микрочипов, сначала идентифицируют с последующей серией мелких экранов, чтобы определить оптимальный полученных золь-гель материаловдр. комбинаций, которые могут быть напечатаны воспроизводимым, без трещин и совместимы с данным анализом. Наконец, оптимальные материалы идентифицированы на основе сохранения ферментативной активности и производительности в конечном малые молекулы скрининге. Таким образом, оптимальные материалы могут быть идентифицированы из многих тысяч кандидатов с использованием только несколько сотен шагов анализа. Покажем это подход к изготовлению и высокой плотности ацетилхолинэстеразы и мультикиназный микрочипов и использование таких микрочипов для малых молекул скрининга.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Reagent/Material</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly(vinyl alcohol) (PVA)</td>
			<td>Sigma-Alderich</td>
			<td>360627</td>
			<td>80% hydrolozyed, Mw 600</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyethylene glycol 600 (PEG)</td>
			<td>Sigma-Alderich</td>
			<td>87333</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyethylenimine (PEI)</td>
			<td>Sigma-Alderich</td>
			<td>482595</td>
			<td>50% (w/w) solution in water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carboxyethylsilanetriol (Si-COOH)</td>
			<td>Gelest, Inc.</td>
			<td>SIC2263.0</td>
			<td>25% in water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-(3-triethoxysilylpropyl) gluconamide(GLS)</td>
			<td>Gelest, Inc.</td>
			<td>SIT8189.0</td>
			<td>50% in ethanol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>bis[(3-methyldimethoxysilyl)propyl]polypropylene oxide (MDSPPO)</td>
			<td>Gelest, Inc.</td>
			<td>SIB1660.0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methyltrimethoxysilane (MTMS)</td>
			<td>Gelest, Inc.</td>
			<td>SIM6560.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bis(triethoxysiyly)ethane (Bis-TEOS)</td>
			<td>Gelest, Inc.</td>
			<td>SIB1817.0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3-Aminopropyltriethoxysilane (APTES)</td>
			<td>Gelest, Inc.</td>
			<td>SIA0610.0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Sigma-Alderich</td>
			<td>49767</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Sorbitol</td>
			<td>Sigma-Alderich</td>
			<td>240850</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-(+)-Trehalose dihydrate</td>
			<td>Sigma-Alderich</td>
			<td>T9531</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma-Alderich</td>
			<td>X-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N&#949;-Acetyl-L-lysine</td>
			<td>Sigma-Alderich</td>
			<td>A4021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris(hydroxymethyl)aminomethane</td>
			<td>Sigma-Alderich</td>
			<td>154563</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma-Alderich</td>
			<td>H3375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydroxide, 1.0 N</td>
			<td>LabChem Inc.</td>
			<td>LC24350-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric Acid, 1.0 N/0.1 N</td>
			<td>LabChem Inc.</td>
			<td>LC15300-2/LC152220-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride</td>
			<td>Sigma-Alderich</td>
			<td>M8266</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diglycerolsilane (DGS)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Prepared in laboratory</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium silicate solution</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>SS338-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dowex 50WX8-100 ion exchance resin</td>
			<td>Sigma-Alderich</td>
			<td>217492</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetylthiocholine iodide</td>
			<td>Sigma-Alderich</td>
			<td>1480</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetylcholinesterase from Electrophorus electricus (electric eel)</td>
			<td>Sigma-Alderich</td>
			<td>C2888</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BODIPY FL L-Cystine</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>B-20340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pro-Q Diamond Phosphoprotein/Phosphopeptide Microarray Stain Kit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>P33706</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adenosine 5&#39;triphosphate disodium salt (ATP) solution</td>
			<td>Sigma-Alderich</td>
			<td>A6559</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MAP Kinase 2 (MAPK2)</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>454850</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>p38&#945;/SAPK2a (T106M), active</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>14-687M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epidermal growth factor (EGFR)</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td></td>
			<td>Donated by Millipore</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycogen synthase kinase 3&#946; (GSK-3&#946;)</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>14-306</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Myelin basic protein (MBP)</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td></td>
			<td>Substrate for MAPK2 and p38&#945;, Donated by Millipore</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GSM</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>12-533</td>
			<td>Substrate for GSK-3&#946;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-glu-tyr polypeptide p(E4Y)</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>12-440</td>
			<td>Substrate for EGFR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stealth pin</td>
			<td>ArrayIt</td>
			<td>SMP3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stealth pin</td>
			<td>ArrayIt</td>
			<td>SMP7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amine coated slides</td>
			<td>ArrayIt</td>
			<td>SMM2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aldehyde coated slides</td>
			<td>ArrayIt</td>
			<td>SMA2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Exposy coated slides</td>
			<td>ArrayIt</td>
			<td>SME2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly(methylmethacrylate) (PMMA) coated slides</td>
			<td>Exakt Technologies Inc.</td>
			<td>41500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.2-&#956;m syringe filter</td>
			<td>PALL Life Sciences</td>
			<td>4612</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Virtek Contact Printer</td>
			<td>BioRad</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Novaray Fluorescence Slide Imager</td>
			<td>Alpha Innotech Corporation</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Desktop microarray centrifuge</td>
			<td>ArrayIt</td>
			<td>MHC110V</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MilliQ Synthesis A10</td>
			<td>Millipore</td>
			<td></td>
			<td>Used to filter all water required for experiments</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a guided materials screening approach for developing quantitative sol-gel derived protein microarrays

Microarrays нашли применение в развитии высокой пропускной способностью для анализа новых материалов и открытие малых молекул приводит препарата. Здесь мы описываем управляемый подход скрининга для идентификации материала золь-гель на основе материалов, которые пригодны для получения трехмерных микрочипов белка. Подход сначала идентифицирует материалов, которые могут быть напечатаны в виде микрочипов, сужает количество материалов путем определения тех, которые совместимы с данным ферментативного анализа, а затем в камень на оптимальных материалов на основе удержания максимальной активности фермента. Этот подход применяется для разработки микрочипов подходит для двух различных анализах фермент, один использованием ацетилхолинэстеразы, а другой с помощью набора из четырех ключевых киназ, участвующих в рак. В каждом случае можно было производить микрочипы, которые могут использоваться для количественного малые молекулы скрининга и производства зависит от дозы кривые ингибитор реакции. Важно отметить, что способность экранировать многие матриалов подготовил информацию об виды материалов, которые лучше всего подходят как производства микрочипов и сохранения активности ферментов. Материалы данные дают представление основных требований материала, необходимого для пошива оптимальный высокой плотности полученных золь-гель микрочипов.

Путем выполнения управляемый анализ фактора материала экрана, мы смогли минимизировать число испытанных материалов от ~ 20000 до нескольких сотен, что было гелеобразования раз подходит для печати. Применяя строгие руководства требующими времени материал гелеобразованием 2,5 часа или больше, материалы, способные засорить печати булавками или производят невоспроизводимой массивы никогда не были напечатаны. Материалы для печати определены иметь достаточные (&gt; 2,5 ч) гелеобразованием раз были напечатаны на 4 различных функционализированным поверхности предметного стекла. Для того, чтобы считать &quot;печати&quot;, то максимальное количество пятен на поглощение объем штифт был для печати (SMP3 = 200). Места были также оценены для точечной морфологии чтобы убедиться в отсутствии трещин или нежелательных фазового разделения не произошло используя простой микроскопии по методу светлого, как показано на рисунке 2. Начиная с этой стадии выявленных материалов для печати, микрочипы были произведены с АХЭ икиназ включены в буферном водном компоненте. Материалы, которые были совместимы с процедура анализа (в том числе потенциал наложения и промывки или окрашивания шагов) были определены путем наблюдения удержание пятна микрочипов (без трещин, потерю пятна или необычные флуоресценции образцов) и положительного контроля (ПК) для отрицательного контроля (NC ) соотношение больше 1, наблюдаемые через изображения. Поскольку это было примерно на 50% материалов, большее ПК / NC соотношении 3 была использована для определения оптимальных материалов с сохранением активности белка. С помощью этого метода, 26 полученных золь-гель материалов, содержащих АХЭ и 2 материалов, содержащих киназы удовлетворены&gt; 3 ПК / NC критериев. Рисунках 3 и 4 отображают графический разбивка 5 управляемый материал экрана шаги для идентификации оптимальных АХЭ и киназы микрочипы, соответственно. Анализы также могут быть подтверждены путем генерации нот Z &#39;17. </sup&gt; Это было сделано с использованием материалов, которые привели к высоким PC / NC соотношении. Рисунке 5 показана участок Z &#39;путем сравнения сигнала, генерируемого 200 мест, 100 шт и 100 НК после надпечатке индикаторный краситель и подложки на АХЭ массива. AChE и киназы массивов привело к соответствующей оценки Z &#39;от 0,60 до 0,67, что указывает на отличную анализа. Тем не менее, следует отметить, что перед анализом проверки на массив фермент, краситель, субстрата и кофакторов концентрации должны быть оптимизированы путем надпечатки диапазон концентраций каждого компонента и подбора концентрации, которая привела к высоким сигнала, как описано подробно в другом месте 5. Для проверки анализов, количественные данные ингибирование были получены с использованием известных и новых ингибиторов ацетилхолинэстеразы, с результатами, выполнены в двух экземплярах и использовать для получения дубликата участки (фиг.6А) и Кривые ингибирования (фиг. 6В и 6С). &lt;сильная ролики&gt; были впервые напечатаны смесями известны биологически активные низкомолекулярные ингибиторы затем с красителем и подложкой, а также контроля смеси, содержащие либо известными ингибиторами или без ингибитора были включены. Повторяющиеся участки были созданы для оценки активности ферментов, и любые смеси, в результате менее 25% активности фермента считались положительными для торможения. Индивидуальные соединения из таких смесей, затем тестировали в двух повторах для идентификации конкретного небольшую молекулу (ы), ответственных за ингибирование. После идентификации эти небольшие молекулы были использованы для получения количественных кривые ингибирования для определения значений IC50 и константы ингибирования. Похожие качественные результаты были получены с использованием мультикиназный массив с общим ингибитором киназы, стауроспорину. 7A и 7B Рис показать микрочипов изображение и показывают, что интенсивность сигналов после надпечатке и окрашивание мультикиназныймассива как ожидалось для отрицательного контроля (- ATP), положительный контроль (+ АТФ) и известным ингибитором (+ АТФ + чел). Чтобы продемонстрировать возможность получения количественных данных ингибирования от микрочипов, зависит от концентрации анализе ингибирования было сделано для одной киназы. Как показано на фигурах 8А и 8В, интенсивность сигнала уменьшается с увеличением концентрации ингибитора, и ответ следующим ожидаемым зависимое от концентрации ингибирование кривая для p38α/MBP киназы / субстрат системы. <img alt="Рисунок 1" src="/files/ftp_upload/50689/50689fig1.jpg" /> Рисунок 1. Общая схема для ориентированного подхода скрининга материалов. Каждый блок представляет собой шаг на экране в последовательном порядке. Числа в левой представляют общее количество материалов, подготовленных для анализа. Использование время гелеобразования более 2,5 ч (материалов с гелеобразования раз меньше, чем 2,5 ч арэлектронной указано аута), количество материалов, которые проходили каждый этап и переносится во время материала экрана обозначаются числа справа. * Представляет материалов с менее чем оптимальное разделение фаз. <img alt="Рисунок 2" src="/files/ftp_upload/50689/50689fig2.jpg" /> Рисунок 2. Оптические изображения, показывающие различные режимы разрушения материалов в печатных шаг части экрана. Образ &quot;хорошего&quot; материала (второй ряд, третья колонка) также показана для сравнения. Печатается с разрешения из работы 8, 2013 Copyright Американского химического общества. <img alt="Рисунок 3" src="/files/ftp_upload/50689/50689fig3.jpg" /> Рисунок 3. Подход направлен материал скрининга для идентификации оптимальных материалов для изготовления золь-гель-полученный АХЭ микрочипов. Печатается с химической завивкойission от опорного 5, 2013 Copyright Американского химического общества. <img alt="Рисунок 4" src="/files/ftp_upload/50689/50689fig4.jpg" /> Рисунок 4. Направлены материалы скрининга подход для идентификации оптимальных материалов для изготовления золь-гель-производных микрочипов киназы. Печатается с разрешения из работы 8, 2013 Copyright Американского химического общества. <img alt="Рисунок 5" src="/files/ftp_upload/50689/50689fig5.jpg" /> Рисунок 5. (А) раздел АХЭ микрочипов показывает HC (ярко-зеленый) и LC (светло-зеленый) пятна (черно-зеленый палитры была применена как для псевдоцвете ясность изложения); (B) в увеличенном виде коробочной области, чтобы выделить место морфологии и выравнивание;. и (С) участок Z &#39;Сплошные линии указывают среднее значение<html> повторяет, тогда как пунктирные линии соответствуют 3SD. Печатается с разрешения из ссылки 5, 2013 Copyright Американского химического общества. <img alt="Рисунок 6" src="/files/ftp_upload/50689/50689fig6.jpg" /> Рисунок 6. (A) Дубликат участок для на массив скрининг синтетических аналогов Amaryllidaceae алкалоиды; (B) IC 50 участков идентифицированных потенциальных ингибиторов отмечены как соединения 1 и (C), соединение 2 с ошибками представляющий одно стандартное отклонение от среднего от 25 репликации. представитель пятна показаны для иллюстрации различий в сигнал, пропорциональный концентрации ингибитора. Печатается с разрешения из ссылки 5, 2013 Copyright Американского химического общества. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/50689/50689fig6large.jpg" target="_blank">Нажмите здесь, чтобы увеличить рисунок</a> . НТ &quot;FO: держать-together.within-страницы =&quot; всегда &quot;&gt; <img alt="Рисунок 7" src="/files/ftp_upload/50689/50689fig7.jpg" /> Рисунок 7. На массива анализа четырех киназ использованием 1.4SS/1.0PVA для захвата и печатают на аминным производным слайдов. (A) изображение участка микрочипов, в котором пятна с киназами совместно захваченного с их соответствующими подложки напечатаны с буфером (NC, верхний ряд), или растворы, содержащие АТФ (ПК, средний ряд) или АТФ + стауроспорину (нижний ряд). (B) Гистограммы сравнения интенсивности сигналов между ингибирует реакцию и раскованно, после вычитания фона сигналов и погрешности представляют одно стандартное отклонение от среднего от 25 повторяет. Печатается с разрешения из работы 8, 2013 Copyright Американского химического общества. <img alt="Рисунок 8" src="/files/ftp_upload/50689/50689fig8.jpg" /> Рисунок 8. Inhibiti. на анализ на p38a/MBP микрочипов (A) Разделы микрочипов показывает представитель пятна overspotted с различными концентрациями стауроспорину, как указано (изображения получены с помощью одного сканирования одного и того же слайдов; составное изображение показан для ясности). (B) IC 50 кривой, полученной из анализируемых изображений массиве. Интенсивности, полученных при 100 мМ вычитали из всех изображений, а все остальные интенсивности нормализовали путем установки интенсивности, полученных при 10 нМ до значения 100% активности. Печатается с разрешения из работы 8, 2013 Copyright Американского химического общества. <img alt="Рисунок 9" src="/files/ftp_upload/50689/50689fig9.jpg" /> Рисунок 9. Изображения микроскопических контактный стелс используется для контактного штыря печати показывая различные недостатки: (A) забита, (B) согнуты.

Watch this Scientific Journal Video about A Guided Materials Screening Approach for Developing Quantitative Sol-gel Derived Protein Microarrays at JoVE.com

A Guided Materials Screening Approach for Developing Quantitative Sol-gel Derived Protein Microarrays

Ориентированного подхода отбора материала для разработки полученных золь-гель белка легированных микрочипов использованием новых пин-печать способ изготовления описан. Эта методика продемонстрирована путем разработки ацетилхолинэстеразы и мультикиназный микрочипов, которые используются для экономически эффективного малые молекулы скрининга.

Guided Скрининг Материалы подхода к разработке количественных полученных золь-гель Microarrays Белки

Microarrays have found use in the development of high-throughput assays for new materials and discovery of small-molecule drug leads. Herein we describe a ...

Research

JoVE Journal

Chemistry

Seeded Synthesis of CdSe/CdS Rod and Tetrapod Nanocrystals

We demonstrate a method for the synthesis of multicomponent nanostructures consisting of CdS and CdSe with rod and tetrapod morphologies. A seeded ...

Covalent Binding of BMP-2 on Surfaces Using a Self-assembled Monolayer Approach

Ковалентного связывания БМП-2 на поверхностях Использование самоорганизующихся монослоя подход

Bone morphogenetic protein 2 (BMP-2) is a growth factor embedded in the extracellular matrix of bone tissue. BMP-2 acts as trigger of mesenchymal cell ...

Synthesis and Purification of Iodoaziridines Involving Quantitative Selection of the Optimal Stationary Phase for Chromatography

Синтез и очистка Iodoaziridines Вовлечение Количественный Выбор оптимального стационарной фазы для хроматографии

The highly diastereoselective preparation of cis-N-Ts-iodoaziridines through reaction of diiodomethyllithium with N-Ts aldimines is described. ...

Supercritical Nitrogen Processing for the Purification of Reactive Porous Materials

Обработка сверхкритической азота для очистки реактивных пористых материалов

Supercritical fluid extraction and drying methods are well established in numerous applications for the synthesis and processing of porous materials. ...

Glycan Node Analysis: A Bottom-up Approach to Glycomics

Glycan Узел Анализ: снизу вверх подход к Glycomics

Synthesized in a non-template-driven process by enzymes called glycosyltransferases, glycans are key players in various significant intra- and ...

Microfluidic Pneumatic Cages: A Novel Approach for In-chip Crystal Trapping, Manipulation and Controlled Chemical Treatment

Микрожидком Пневматические Садки: Новый подход к В микросхеме Кристал Trapping, манипуляция и управляемому Химическая обработка

The precise localization and controlled chemical treatment of structures on a surface are significant challenges for common laboratory technologies. ...

Synthesis of a Water-soluble Metal&#8211;Organic Complex Array

Synthesis of a Water-soluble MetalÃƒÆ’Ã‚Â¢ÃƒÂ¢Ã¢â‚¬Å¡Ã‚Â¬ÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã…â€œOrganic Complex Array

Синтез растворимой в воде металлоорганические сложный комплекс

We demonstrate a method for the synthesis of a water-soluble multimetallic peptidic array containing a predetermined sequence of metal centers such as ...

Facet-to-facet Linking of Shape-anisotropic Colloidal Cadmium Chalcogenide Nanostructures

Аспект и аспект связывание фигуры анизотропное коллоидных кадмия халькогенида наноструктур

Here, we describe a protocol that allows for shape-anisotropic cadmium chalcogenide nanocrystals (NCs), such as nanorods (NRs) and tetrapods (TPs), to be ...

Chemical Synthesis of Porous Barium Titanate Thin Film and Thermal Stabilization of Ferroelectric Phase by Porosity-Induced Strain

Химический синтез пористых бария титаната тонкой пленки и тепловой стабилизации сегнетоэлектрических фазы, пористость индуцированной штамм

Barium titanate (BaTiO3, hereafter BT) is an established ferroelectric material first discovered in the 1940s and still widely used because of its ...

Technical Aspect of the Automated Synthesis and Real-Time Kinetic Evaluation of [11C]SNAP-7941

Technical Aspect of the Automated Synthesis and Real-Time Kinetic Evaluation of [11C]SNAP-7941

Технический аспект автоматизированного синтеза и кинетической оценки в реальном времениNo 11C'SNAP-7941

Positron emission tomography (PET) is an essential molecular imaging technique providing insights into pathways and using specific targeted radioligands ...