Name: a guided materials screening approach for developing quantitative sol-gel derived protein microarrays
Uploaded: 2013-08-26T12:00:00
Duration: 10 min 44 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Guided Materials Screening Approach for Developing Quantitative Sol-gel Derived Protein Microarrays at JoVE.com

Författarna tackar Maria Monton, Julie Lebert, Jessamyn Little, Xin Ge och Laura Lautens för hjälp i utvecklingen av protein microarrays. Författarna tackar också för naturvetenskaplig och teknisk forskning Council of Canada (NSERC) för att finansiera detta arbete. Författarna tackar också Canada Foundation for Innovation och Ontario Innovation Trust för att stödja detta arbete. JDB innehar Kanada forskning ordförande i Bioanalytiska kemi och Biointerfaces.

<ol>
	<li>Schena, M. M., Shalon, D. D., Davis, R. W. R., Brown, P. O. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+monitoring+of+gene+expression+patterns+with+a+complementary+DNA+microarray.">Quantitative monitoring of gene expression patterns with a complementary DNA microarray.</a> Science (New York, N.Y.). 270 (5235), 467-470 (1995).</li><li>MacBeath, G., Schreiber, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Printing+proteins+as+microarrays+for+high-throughput+function+determination.">Printing proteins as microarrays for high-throughput function determination.</a> Science (New York, N.Y.). 289 (5485), 1760-1763 (2000).</li><li>Zhu, H. H., Bilgin, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+analysis+of+protein+activities+using+proteome+chips.">Global analysis of protein activities using proteome chips.</a> Science (New York, N.Y.). 293 (5537), 2101-2105 (2001).</li><li>Hook, A. L., Chang, C. -. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combinatorial+discovery+of+polymers+resistant+to+bacterial+attachment.">Combinatorial discovery of polymers resistant to bacterial attachment.</a> Nature Biotechnology. , (2012).</li><li>Monton, M. R. N., Lebert, J. M., Little, J. R. L., Nair, J. J., McNulty, J., Brennan, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Sol-Gel-Derived+Acetylcholinesterase+Microarray+for+Nanovolume+Small-Molecule+Screening.">A Sol-Gel-Derived Acetylcholinesterase Microarray for Nanovolume Small-Molecule Screening.</a> Analytical Chemistry. 82 (22), 9365-9373 (2010).</li><li>Cho, E. J., Tao, Z., Tehan, E. C., Bright, F. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multianalyte+pin-printed+biosensor+arrays+based+on+protein-doped+xerogels.">Multianalyte pin-printed biosensor arrays based on protein-doped xerogels.</a> Analytical Chemistry. 74 (24), 6177-6184 (2002).</li><li>Cho, E. J., Tao, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tools+to+Rapidly+Produce+and+Screen+Biodegradable+Polymer+and+Sol-Gel-Derived+Xerogel+Formulations.+Applied+Spectroscopy.">Tools to Rapidly Produce and Screen Biodegradable Polymer and Sol-Gel-Derived Xerogel Formulations. Applied Spectroscopy.</a> Society for Applied Spectroscopy. 56 (11), 1385-1389 (2002).</li><li>Ge, X., Lebert, J. M., Monton, M. R. N., Lautens, L. L., Brennan, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Materials+Screening+for+Sol-Gel-Derived+High-Density+Multi-Kinase+Microarrays.">Materials Screening for Sol-Gel-Derived High-Density Multi-Kinase Microarrays.</a> Chemistry of Materials. 23 (16), 3685-3691 (2011).</li><li>Rupcich, N., Green, J. R. A., Brennan, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanovolume+Kinase+Inhibition+Assay+Using+a+Sol-Gel-Derived+Multicomponent+Microarray.">Nanovolume Kinase Inhibition Assay Using a Sol-Gel-Derived Multicomponent Microarray.</a> Analytical Chemistry. 77 (24), 8013-8019 (2005).</li><li>Rupcich, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coupled+enzyme+reaction+microarrays+based+on+pin-printing+of+sol-gel+derived+biomaterials.">Coupled enzyme reaction microarrays based on pin-printing of sol-gel derived biomaterials.</a> Analytica Chimica Acta. 500 (1-2), 3-12 (2003).</li><li>MacBeath, G. G., Schreiber, S. L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Printing+proteins+as+microarrays+for+high-throughput+function+determination.">Printing proteins as microarrays for high-throughput function determination.</a> Science (New York, N.Y.). 289 (5485), 1760-1763 (2000).</li><li>Stillman, B. A. B., Tonkinson, J. L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FAST+slides:+a+novel+surface+for+microarrays.">FAST slides: a novel surface for microarrays.</a> BioTechniques. 29 (3), 630-635 (2000).</li><li>Rupcich, N., Goldstein, A., Brennan, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+sol-gel+formulations+and+surface+treatments+for+the+development+of+pin-printed+protein+microarrays.">Optimization of sol-gel formulations and surface treatments for the development of pin-printed protein microarrays.</a> Chemistry of Materials. 15 (9), 1803-1811 (2003).</li><li>Gill, I., Ballesteros, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Encapsulation+of+biologicals+within+silicate,+siloxane,+and+hybrid+sol-gel+polymers:+An+efficient+and+generic+approach.">Encapsulation of biologicals within silicate, siloxane, and hybrid sol-gel polymers: An efficient and generic approach.</a> Journal of the American Chemical Society. 120 (34), 8587-8598 (1998).</li><li>Brook, M. A., Chen, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteins+entrapped+in+silica+monoliths+prepared+from+glyceroxysilanes.">Proteins entrapped in silica monoliths prepared from glyceroxysilanes.</a> Journal of Sol-gel Science and Technology. 31 (1), 343-348 (2004).</li><li>Brook, M. A., Chen, Y., Guo, K., Zhang, Z., Brennan, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sugar-modified+silanes:+precursors+for+silica+monoliths.">Sugar-modified silanes: precursors for silica monoliths.</a> Journal of Materials Chemistry. 14 (9), 1469 (2004).</li><li>Zhang, J., Chung, T., Oldenburg, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Simple+Statistical+Parameter+for+Use+in+Evaluation+and+Validation+of+High+Throughput+Screening+Assays.">A Simple Statistical Parameter for Use in Evaluation and Validation of High Throughput Screening Assays.</a> Journal of Biomolecular Screening. 4 (2), 67-73 (1999).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Next+generation+of+protein+microarray+support+materials:+Evaluation+for+protein+and+antibody+microarray+applications.">Next generation of protein microarray support materials: Evaluation for protein and antibody microarray applications.</a> Journal of Chromatography A. , 1-8 (2013).</li><li>Bhatia, R. B., Brinker, C. J., Gupta, A. K., Singh, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aqueous+Sol-Gel+Process+for+Protein+Encapsulation.">Aqueous Sol-Gel Process for Protein Encapsulation.</a> Chemistry of Materials. 12 (8), 2434-2441 (2000).</li></ol>

Vi har inget att lämna ut.

Den metod som beskrivs här valdes som den mest lämpade för att identifiera skrivbara sol-gel erhållet material med en kontakt skrivare, som producerar en tid-och kostnadseffektivt förfarande för att snabbt identifiera optimala material utan att screena ett stort antal material. Av totalt ~ 20.000 potentiella material, var det möjligt att identifiera ~ 200 material som var lämpliga för utskrift på grundval av gelningstiden ensam. Detta minskade signifikant antalet material som behövs för att vara förberedd för senare utskrift prövningar. Dessa utskrivbara material sedan tryckt på 4 glidytor för totalt 768 material-slide kombinationer. I genomsnitt kan 50 platser / replikat av ett material tryckas i ~ 3 min, inklusive provladdning, spot nedfall och pin rengöring. Av de 155 ämnen, eller ungefär 20%, tillåten för utskrift det maximala antalet punkter per lösning upptag och producerade reproducerbara spot storlekar. Det bör noteras att av de 4 slide ytor testas, tryckt material bättre i ordning: amin&gt; epoxy&gt; aldehyd&gt; PMMA, PMMA glider inte producera användbara matriser för något material. Detta var troligen hänföras till polariteten hos ytbeläggningen. Jämföra ovannämnda glidytorna, var den mer polära amin och epoxi bättre lämpade för de vattenhaltiga soler jämfört med PMMA diabilder. Dessutom, av de testade ytor, amin belagda bilderna ger en potentiell positivt laddad yta för den avsatta anjoniska sol till förbindelsen. Vi misstänker, nanopartiklar kiseldioxiden vid gränsytan mellan objektglaset och solen interagera längs ytan. Både epoxi och aldehyden ytor glider saknar samma initiala laddningen-baserad interaktion. För att säkerställa optimal plats nedfall är det starkt rekommenderat att använda pre-belagda diabilder från en leverantör som Arrayit. In-house beläggning producerar inkonsekventa ytor som leder till dålig reproducerbarhet fläck 13 och i vissa fall kan leda till kvantifiering probblem. 18 Av lika stor vikt, temperatur och luftfuktighet påverkar &quot;tryckbarhet&quot; av materialen. Även om detaljerade studier av effekterna relaterade till temperatur utfördes, var utskrifter alltid utföras vid rumstemperatur (23 ± 3 ° C). Fuktighet (större än 80%) har också kontrolleras inom tryckets kammaren för att förhindra oregelbunden form nedfall på grund av små nedfall volymer (0,7-2,3 nl) och indunstning. Medan materialet skärmen styrdes mot att identifiera optimala sol-gel erhållet material speciellt för tryckning av magen och kinaser, en liten uppsättning av material identifierades som arbetade för båda typerna av proteiner. I själva verket var de båda materialen som identifierades för kinas microarray tillverkning baserad på SS + PVA + glycerol, och båda materialen identifierades även inom de 26 material valda för AChE mikromatriser. Dessa &quot;optimala&quot; material kan erbjuda en generisk utgångspunkt för att utveckla ytterligare protein-dopade sol-gel baserad mikroarray och små skärmar centrerade kring dessa kompositioner kan identifiera ännu bättre material för microarray tillverkning. En andra punkt att notera är vikten av det använda enzymet. I fallet med AChE (en ganska robust enzym), behöll 26 (eller ca 40%) av de ursprungliga 66 material som identifieras som analys-kompatibel aktiviteten av innesluten värker. Men för de mer känsliga kinaser, var endast 2 av de 69 assay-kompatibla kompositioner, eller ungefär 3% av de material, kunna behålla aktiviteten hos alla kinaser. Medan tillräckligt många olika enzymer inte har studerats för att göra entydiga uttalanden, verkar det som optimerande array tillverkning med relativt instabila enzymer kan leda till identifiering av material som kan innesluta en mängd olika proteiner för att tillåta mutliplexed microarray tillverkning. Oberoende av det valda proteinet, var den främsta cut-off faktor för identifiering utskrivbara material behovet av en långmaterial gelbildningstider gånger (&gt; 2,5 h). När man utvecklar SS baserade sol-gel-material, är det mycket viktigt att säkerställa att, efter jonbyte och filtrering, är solen vid ca pH 4. Soler med ett lägre initialt pH kan resultera i material med ett lägre-än-neutralt pH, vilket kan påverka enzymaktiviteten. 19 justering av mängden av Dowex (jonbytarharts) till SS kan förändra det slutliga pH hos solen. När en ny sats av hartset framställs förhållandet harts till SS måste anpassas så att de ger soler vid ca pH 4 enligt förfarandet i avsnitt 2 i protokollet. Likaså är framställningen av kristallina DGS ofta en källa till fel i samband med materialbrott vid användning DGS soler för biomolekylen infångning. Även om det inte redovisas här i detalj, måste stor försiktighet iakttas under syntesen av kristallina DGS, i synnerhet behovet av att undvika förekomsten av vatten under syntesen, vilket kan producera polyglycerated kiseldioxidtes snarare än monomera DGS. Också, på grund av den hygroskopiska naturen av DGS, måste den kristallina provet som skall förvarades med torkmedel och användas inom 6 månader efter syntes. Kristallina DGS äldre än 6 månader får inte lösas upp helt (på grund av partiellt kondenserat polyglyceryl silikatmaterial) även med sonikering i en sur miljö. Ofullständig DGS upplösning ger soler med okända och okontrollerbara kiseldioxidinnehåll och därmed mindre robust material. En viktig punkt att notera med kontakt utskrift är kvaliteten på stiften. Skadade eller felaktig hantering stift (figur 9) kommer aldrig att ge reproducerbara arrayer oberoende av det material som skrivs ut. Det rekommenderas att kontrollera pin kvalitet med hjälp av en dissektion mikroskop för att se trasiga eller igensatta stift inte används. Noggrann hantering säkerställer lång livslängd för stiften. Fri rörelse av stiftet är också viktigt. I de fall där fukten är fångad i skrivarhuvudet mellan huvudet och tappen, tappeninte sittplats korrekt och därmed inte gör ordentlig kontakt med ytan, vilket resulterar i en brist på avsättning av material. Sammanfattningsvis har vi en detaljerad, flerfassilanordning strategi för utvecklingen av high-density protein dopade pin-tryckta mikromatriser. Screeningen omfattar optimering av materialegenskaper (gelningstid och tryckbarhet) för att tillåta tryckning av material, följt av mer fokuserade screening för att identifiera material som är kompatibla med en given analys och kunna behålla enzymaktivitet. Denna guidade material screening metod kan tillämpas på ytterligare microarray format för att minska tid och kostnader förknippade med att producera effektiva hög densitet mikromatriser.

Microarrays har vunnit popularitet inom det vetenskapliga samfundet som en metod för att öka analys genomströmning. Eftersom utvecklingen av microarrayteknologi att bedöma genuttryck 1 i mitten av 1990-talet, har mikromatriser funnit användning i utvecklingen av high-throughput analyser för att identifiera protein-protein och protein-interaktionen mellan små molekyler, samt att finna nya material med unika egenskaper. 2-5 På senare tid har mikromatriser utvecklats vari specifika material används för att immobilisera funktionella proteiner, som producerar ett tredimensionellt microarray element i vilka proteiner är infångade, vilket möjliggör enkel mätning av enzymatisk aktivitet och hämning på microarray själv användning av en lämplig fluorescens analys som är kopplad till substrat omsättningen. 5-10 Viktigt kan sådana mikromatriser utformas för att inkludera alla nödvändiga komponenter för att screena prover och kontroller tillsammans i en mycket parallellt mode. 5,8 &lt;/ P&gt; Tidiga exempel på protein microarrays typiskt framställdes med användning av standardmetoder för proteinimmobilisering på fasta bärare, såsom kovalent bindning, 11 affinitet fånga 3 och fysikalisk adsorption. 12 Även om dessa metoder för bio-immobilisering möjliggöra ökad provkoncentration och påskyndade reaktionskinetik som krävs för assay miniatyrisering, de var lida nackdelar. I allmänhet, alla orsaka en minskning av infödda biomolekyler funktionalitet grund kemisk modifiering av ytan, hindrad tillgång till aktiva platser, eller felaktig orientering på grund av icke-specifik immobilisering. Således, alla metoder resulterar i lägre analyskänslighet trots en ökning av biomolekyler nedfall, ett svar som sannolikt uppstår på grund av behovet att artificiellt binda biomolekyler till en yta. En framväxande tillvägagångssätt för produktion av funktionella biomolekyl mikromatriser är genom stift-tryckning av protein-dopadkiseldioxidsoler på fasta bärare, som är typiskt antingen funktionaliserade glasskivor eller individuella brunnar i mikrobrunnplattor plattor. Sol-gel-processen i sig äger rum i en vattenhaltig miljö vid rumstemperatur, och det är det flytande förstadiet som är tryckt och sedan geler att fånga biomolekyler inom 3D-matrisen, vilket möjliggör hög proteinhalt lastning 13 samt inneslutning av multipla komponenter inom samma microarray elementet. 13,14 skräddarsy den härledda sol-gel-materialet kan ske genom noggrant urval av olika kiseldioxid prekursorer, samt genom att förändra den vattenbaserade komponenten genom användning av olika buffertar (pH, jonstyrka), och införandet av olika tillsatser (polymerer, små molekyler) för att uppnå ett optimalt material, beror den specifika karaktär som på biomolekyler som är anhållna. 10 En potentiell begränsning i samband med utvecklingen av sol-gel härledda protein microarrays via pin-utskrift ärbehovet av att identifiera sol-gel kompositmaterial som kan skrivas utan gel i stiftet eller visar oönskade egenskaper (reproducerbara plats storlekar, sprickor, dålig vidhäftning, oförenlighet med analyskomponenter, dålig protein aktivitet) en gång tryckt på en yta. 5 Samtidig optimering av alla dessa parametrar utesluter ett tillvägagångssätt vari material kan utformas de novo, eller undersökta långsamt på ett seriellt sätt. Å andra sidan, är slumpmässig screening av många tusen eller tiotusentals material varken tids-eller kostnadseffektivt. I den här artikeln beskriver vi en riktad screening som möjliggör snabb identifiering av lämpliga material för produktion av protein microarrays utan att behöva slumpmässigt screena ett stort antal material. Med hjälp av en guidad tillvägagångssätt används material lämpliga för microarray utskrift först identifierades, följt av en serie av småskaliga skärmar för att identifiera optimal sol-gel-härlett materialal kombinationer som kan skrivas reproducerbart, utan att spricka och är kompatibel med en given analys. Slutligen är optimala material identifieras baserat på retention av enzymaktivitet och prestanda i en final småmolekylär screeningsanalysen. På detta sätt kan optimala material identifieras från många tusen kandidater med hjälp av endast några hundra analysstegen. Vi visar detta tillvägagångssätt för tillverkning av både hög densitet acetylkolinesteras och mikroarrayer multikinashämmare och användningen av sådana mikroarrayer för småmolekylära screening.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Reagent/Material</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly(vinyl alcohol) (PVA)</td>
			<td>Sigma-Alderich</td>
			<td>360627</td>
			<td>80% hydrolozyed, Mw 600</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyethylene glycol 600 (PEG)</td>
			<td>Sigma-Alderich</td>
			<td>87333</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyethylenimine (PEI)</td>
			<td>Sigma-Alderich</td>
			<td>482595</td>
			<td>50% (w/w) solution in water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carboxyethylsilanetriol (Si-COOH)</td>
			<td>Gelest, Inc.</td>
			<td>SIC2263.0</td>
			<td>25% in water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-(3-triethoxysilylpropyl) gluconamide(GLS)</td>
			<td>Gelest, Inc.</td>
			<td>SIT8189.0</td>
			<td>50% in ethanol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>bis[(3-methyldimethoxysilyl)propyl]polypropylene oxide (MDSPPO)</td>
			<td>Gelest, Inc.</td>
			<td>SIB1660.0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methyltrimethoxysilane (MTMS)</td>
			<td>Gelest, Inc.</td>
			<td>SIM6560.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bis(triethoxysiyly)ethane (Bis-TEOS)</td>
			<td>Gelest, Inc.</td>
			<td>SIB1817.0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3-Aminopropyltriethoxysilane (APTES)</td>
			<td>Gelest, Inc.</td>
			<td>SIA0610.0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Sigma-Alderich</td>
			<td>49767</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Sorbitol</td>
			<td>Sigma-Alderich</td>
			<td>240850</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-(+)-Trehalose dihydrate</td>
			<td>Sigma-Alderich</td>
			<td>T9531</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma-Alderich</td>
			<td>X-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N&#949;-Acetyl-L-lysine</td>
			<td>Sigma-Alderich</td>
			<td>A4021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris(hydroxymethyl)aminomethane</td>
			<td>Sigma-Alderich</td>
			<td>154563</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma-Alderich</td>
			<td>H3375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydroxide, 1.0 N</td>
			<td>LabChem Inc.</td>
			<td>LC24350-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric Acid, 1.0 N/0.1 N</td>
			<td>LabChem Inc.</td>
			<td>LC15300-2/LC152220-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride</td>
			<td>Sigma-Alderich</td>
			<td>M8266</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diglycerolsilane (DGS)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Prepared in laboratory</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium silicate solution</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>SS338-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dowex 50WX8-100 ion exchance resin</td>
			<td>Sigma-Alderich</td>
			<td>217492</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetylthiocholine iodide</td>
			<td>Sigma-Alderich</td>
			<td>1480</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetylcholinesterase from Electrophorus electricus (electric eel)</td>
			<td>Sigma-Alderich</td>
			<td>C2888</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BODIPY FL L-Cystine</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>B-20340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pro-Q Diamond Phosphoprotein/Phosphopeptide Microarray Stain Kit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>P33706</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adenosine 5&#39;triphosphate disodium salt (ATP) solution</td>
			<td>Sigma-Alderich</td>
			<td>A6559</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MAP Kinase 2 (MAPK2)</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>454850</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>p38&#945;/SAPK2a (T106M), active</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>14-687M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epidermal growth factor (EGFR)</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td></td>
			<td>Donated by Millipore</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycogen synthase kinase 3&#946; (GSK-3&#946;)</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>14-306</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Myelin basic protein (MBP)</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td></td>
			<td>Substrate for MAPK2 and p38&#945;, Donated by Millipore</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GSM</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>12-533</td>
			<td>Substrate for GSK-3&#946;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-glu-tyr polypeptide p(E4Y)</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>12-440</td>
			<td>Substrate for EGFR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stealth pin</td>
			<td>ArrayIt</td>
			<td>SMP3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stealth pin</td>
			<td>ArrayIt</td>
			<td>SMP7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amine coated slides</td>
			<td>ArrayIt</td>
			<td>SMM2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aldehyde coated slides</td>
			<td>ArrayIt</td>
			<td>SMA2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Exposy coated slides</td>
			<td>ArrayIt</td>
			<td>SME2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly(methylmethacrylate) (PMMA) coated slides</td>
			<td>Exakt Technologies Inc.</td>
			<td>41500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.2-&#956;m syringe filter</td>
			<td>PALL Life Sciences</td>
			<td>4612</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Virtek Contact Printer</td>
			<td>BioRad</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Novaray Fluorescence Slide Imager</td>
			<td>Alpha Innotech Corporation</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Desktop microarray centrifuge</td>
			<td>ArrayIt</td>
			<td>MHC110V</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MilliQ Synthesis A10</td>
			<td>Millipore</td>
			<td></td>
			<td>Used to filter all water required for experiments</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a guided materials screening approach for developing quantitative sol-gel derived protein microarrays

Microarrays har funnit användning i utvecklingen av high-throughput analyser för nya material och upptäckt av små-molekyldrogkandidater leads. Häri beskriver vi en guidad tillvägagångssätt material screening för att identifiera sol-gel-baserade material som är lämpliga för framställning av tredimensionella protein microarrays. Tillvägagångssättet identifierar först material som kan skrivas som microarrays, smalnar ner antalet material genom att identifiera de som är kompatibla med en viss enzymanalys, och sedan hones i den optimala material baserade på bibehållande av maximal enzymaktivitet. Detta tillämpas för att utveckla microarrays lämpliga för två olika enzymanalyser, en som använder acetylkolinesteras och den andra med en uppsättning av fyra viktiga kinaser är involverade i cancer. I varje fall var det möjligt att tillverka mikroarrayer som kan användas för kvantitativa små molekyler screeninganalyser och produktion av dosberoende kurvor hämmare svar. Viktigt är, förmågan att screena många matematerial produceras information om de typer av material som är bäst lämpade för både microarray produktion och bevarande av enzymaktivitet. De material data ger insikt i grundläggande materiella krav som är nödvändiga för att skräddarsy optimala, high-density sol-gel härledda mikromatriser.

Genom att utföra en guidad faktoranalys för materialet skärmen, kunde vi minimera antalet material som testats från ~ 20.000 till några hundra som hade gelbildningstider gånger lämpar sig för utskrift. Genom att tillämpa en strikt riktlinje kräver tid material gelning av 2,5 h eller högre, var material som kan täppa till tryckerier stift eller producera reproducerbara arrayer aldrig ut. De utskrivbara material som identifierats ha tillräckliga (&gt; 2,5 h) gelbildningstider gånger trycktes på 4 olika funktionaliserade ytor glasskiva. För att betraktas som &quot;tryckbart&quot;, hade det maximala antalet fläckar per upptag volym av tappen som skall tryckas (SMP3 = 200). Ställen bedömdes också för spot morfologi att säkerställa att ingen sprickbildning eller oönskad fasseparation hade inträffat med hjälp av enkla brightfield mikroskopi såsom visas i figur 2. Från detta skede av identifierade utskrivbara material, var mikromatriser produceras med magen ochkinaser införlivas i den buffrade vattenhaltiga komponenten. Material som var förenliga med analysförfarandet (inklusive eventuella övertryck och tvättning eller färgning steg) identifierades genom att observera kvarhållande av microarray fläckar (ingen sprickbildning, förlust av fläckar eller ovanliga fluorescens mönster) och en positiv kontroll (PC) till negativ kontroll (NC ) kvot större än 1 som observeras genom bilden. Eftersom detta var ungefär 50% av materialet, en större PC / NC-förhållande av 3 användes för att definiera optimala material med bibehållen proteinaktivitet. Genom denna metod, 26 sol-gel-härledda material innehållande magen och två material innehållande kinaser uppfyllde&gt; 3 PC / NC kriterier. Figur 3 och Figur 4 visar en grafisk uppdelning av de fem guidade steg materiella skärmen för identifiering av optimal magen och kinas microarrays, respektive. Analyserna kan också utvärderas genom generering av en Z &#39;poäng. 17 </sup&gt; Detta gjordes med hjälp av det material som gav högst PC / NC-förhållande. Visar Z &#39;plot erhålls genom att jämföra den signal som genereras från 200 fläckar, 100 PC och 100 NC efter övertryckning av indikator-färgämnet och substratet på AChE array Figur 5. Värken och arrayer kinas resulterade i respektive Z-poäng på 0,60 och 0,67, vilket tyder på en utmärkt analys. Emellertid bör det noteras att före analys validering, hade på-array enzym, färgämne, substrat och kofaktör koncentrationer kan optimeras genom övertryckning ett intervall av koncentrationer av varje komponent och välja den koncentration som producerade den högsta signalen, såsom beskrivs i detalj på annat ställe . fem Att validera analyserna, var kvantitativa inhiberingsdata erhållits med kända och okända AChE-inhibitorer, med resultat som utförs i två exemplar och används för att producera dubbla tomter (Figur 6A) och kurvor inhibering (figur 6B och 6C). &lt;strong&gt; Spots först överexponeras med blandningar av kända biologiskt aktiva små molekylinhibitors sedan med färg och substrat, och kontroll blandningar innehållande antingen kända hämmare eller ingen inhibitor ingick. Duplicate tomter genererades att bedöma enzymaktivitet, och eventuella blandningar som ger mindre än 25% enzymaktivitet betraktades som positiva med avseende på inhibering. Individuella föreningar från sådana blandningar testades sedan i duplikat för att identifiera de specifika liten molekyl (er) som ansvarar för inhibering. När detta har skett, är dessa små molekyler användes för att generera kvantitativa hämningskurvor för att bestämma IC50-värden och konstanter hämning. Liknande kvalitativa resultat erhölls med användning av multikinashämmare array med en gemensam kinasinhibitor, staurosporin. Figur 7A och 7B visar microarray bilden och indikerar att signalintensiteterna efter övertryckning och färgning av multikinashämmarearray är som väntat för en negativ kontroll (- ATP), positiv kontroll (+ ATP) och känd hämmare (+ ATP + inv). Visa förmåga att erhålla kvantitativa inhiberingsdata från microarrays, var en koncentrationsberoende hämning analysen görs för en enda kinas. Såsom visas i figurerna 8A och 8B, minskar signalintensitet som ökar inhibitorkoncentration, och svaret följer det förväntade koncentrationsberoende hämning kurvan för p38α/MBP kinas / substrat-system. <img alt="Figur 1" src="/files/ftp_upload/50689/50689fig1.jpg" /> Figur 1. Allmänt schema för den guidade material screening. Varje block representerar ett steg av skärmen i sekventiell ordning. Siffrorna på vänster representerar det totala antalet material framställda för analys. Använda en gelningstid större än 2,5 tim (material med gelbildningstider gånger mindre än 2,5 timmar are indikeras av utslagning), är antalet material som passerade varje steg och överförs under den aktuella skärmen visas med numret till höger. * Representerar material med mindre än optimal fas separation. <img alt="Figur 2" src="/files/ftp_upload/50689/50689fig2.jpg" /> Figur 2. Optiska bilder som visar olika felsituationer material på tryckbarhet steg på skärmen. En bild av ett &quot;bra&quot; material (andra raden, tredje kolumnen) visas också som jämförelse. Omtryckt med tillåtelse från referens 8, copyright 2013 American Chemical Society. <img alt="Figur 3" src="/files/ftp_upload/50689/50689fig3.jpg" /> Figur 3. En riktad material screening för identifiering av optimala material för tillverkning av sol-gel-härledda AChE mikromatriser. Omtryckt med permissionen från referens 5, copyright 2013 American Chemical Society. <img alt="Figur 4" src="/files/ftp_upload/50689/50689fig4.jpg" /> Figur 4. En riktad material screening för identifiering av optimala material för att tillverka sol-gel-härledda kinas microarrays. Omtryckt med tillåtelse från referens 8, copyright 2013 American Chemical Society. <img alt="Figur 5" src="/files/ftp_upload/50689/50689fig5.jpg" /> Figur 5. (A) En del av AChE microarray visar HC (ljust grön) och LC (ljusgrön) fläckar (en svart-grön palett applicerades som pseudofärger för tydlighet presentation), (B) en förstorad bild av den inramade området för att markera plats morfologi och anpassningen;. och (C) en Z &#39;tomt Heldragna linjer indikerar medelvärdet av<html> replikat, medan streckade linjerna motsvarar 3SD. Omtryckt med tillåtelse från referens 5, copyright 2013 American Chemical Society. <img alt="Figur 6" src="/files/ftp_upload/50689/50689fig6.jpg" /> Figur 6. (A) Duplicera plot för på-array screening av syntetiska analoger av Amaryllidaceae alkaloider, (B) IC 50 tomter av identifierade potentiella inhibitorer markerade som föreningar 1 och (C) förening 2, med felstaplar representerar en standardavvikelse av medelvärdet från 25 replikat. Representativa fläckar visas för att illustrera skillnader i signal proportionell mot inhibitorkoncentrationer. Omtryckt med tillåtelse från referens 5, copyright 2013 American Chemical Society. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/50689/50689fig6large.jpg" target="_blank">Klicka här för att visa en större bild</a> . nt &quot;fo: keep-together.within-sida =&quot; alltid &quot;&gt; <img alt="Figur 7" src="/files/ftp_upload/50689/50689fig7.jpg" /> Figur 7. On-array-analys av fyra kinaser använder 1.4SS/1.0PVA för infångning och trycks på en amin-derivatiserade slide. (A) En bild av en del av microarray där fläckarna med kinaser co-inneslutna med sina respektive substrat övertryckas med buffert (NC, översta raden), eller lösningar innehållande ATP (PC, mellersta raden) eller ATP + staurosporine (nedersta raden). (B) Stapeldiagram jämför signalintensiteter mellan hämmade och ohämmade reaktioner, efter subtraktion av bakgrunden signaler och felstaplar representerar en standardavvikelse av medelvärdet från 25 replikat. Omtryckt med tillåtelse från referens 8, copyright 2013 American Chemical Society. <img alt="Figur 8" src="/files/ftp_upload/50689/50689fig8.jpg" /> Figur 8. Inhibiti. på analys på en p38a/MBP microarray (A) Delar av microarrays visar representativa fläckar overspotted med varierande koncentrationer av staurosporin, såsom anges (bilderna erhölls genom en scan av samma bild, sammansatt bild visas för tydlighetens skull). (B) IC 50 kurva som genereras från de analyserade array bilderna. Intensiteten erhölls vid 100 mM subtraherades från alla bilder; alla andra intensiteter normaliserades genom att ställa in intensiteten erhålls vid 10 nM till ett värde på 100% aktivitet. Omtryckt med tillåtelse från referens 8, copyright 2013 American Chemical Society. <img alt="Figur 9" src="/files/ftp_upload/50689/50689fig9.jpg" /> Figur 9. Bilder av mikroskopiska stealth stift används för kontaktstift-utskrift som visar olika brister: (A) igensatt, (B) böjd.

Watch this Scientific Journal Video about A Guided Materials Screening Approach for Developing Quantitative Sol-gel Derived Protein Microarrays at JoVE.com

A Guided Materials Screening Approach for Developing Quantitative Sol-gel Derived Protein Microarrays

En guidad material screening metod för att utveckla sol-gel härledda protein dopade mikromatriser med en framväxande pin-utskrift tillverkningsmetod beskrivs. Denna metod demonstreras genom utveckling av acetylkolinesteras och multikinashämmare microarrays, som används för kostnadseffektiv små molekyler screening.

En guidad Materials Screening strategi för utvecklingen av kvantitativa Sol-gel protein från Microarrays

Microarrays have found use in the development of high-throughput assays for new materials and discovery of small-molecule drug leads. Herein we describe a ...

Research

JoVE Journal

Chemistry

Seeded Synthesis of CdSe/CdS Rod and Tetrapod Nanocrystals

Seeded Syntes av CdSe / CdS Rod och tetrapod nanokristaller

We demonstrate a method for the synthesis of multicomponent nanostructures consisting of CdS and CdSe with rod and tetrapod morphologies. A seeded ...

Covalent Binding of BMP-2 on Surfaces Using a Self-assembled Monolayer Approach

Kovalent Bindning av BMP-2 på ytorna med en själv monterade monolager Approach

Bone morphogenetic protein 2 (BMP-2) is a growth factor embedded in the extracellular matrix of bone tissue. BMP-2 acts as trigger of mesenchymal cell ...

Synthesis and Purification of Iodoaziridines Involving Quantitative Selection of the Optimal Stationary Phase for Chromatography

Syntes och rening av Iodoaziridines avseende kvantitativa valet av det optimala stationär fas för kromatografi

The highly diastereoselective preparation of cis-N-Ts-iodoaziridines through reaction of diiodomethyllithium with N-Ts aldimines is described. ...

Supercritical Nitrogen Processing for the Purification of Reactive Porous Materials

Superkritisk Kväve Behandling för rening av reaktiva porösa material

Supercritical fluid extraction and drying methods are well established in numerous applications for the synthesis and processing of porous materials. ...

Glycan Node Analysis: A Bottom-up Approach to Glycomics

Glykan Nod Analys: En nedifrån och upp till glycomics

Synthesized in a non-template-driven process by enzymes called glycosyltransferases, glycans are key players in various significant intra- and ...

Microfluidic Pneumatic Cages: A Novel Approach for In-chip Crystal Trapping, Manipulation and Controlled Chemical Treatment

Mikroflödes pneumatiska Burar: En ny metod för In-chip Crystal svällning, manipulation och kontrollerad kemisk behandling

The precise localization and controlled chemical treatment of structures on a surface are significant challenges for common laboratory technologies. ...

Synthesis of a Water-soluble Metal&#8211;Organic Complex Array

Synthesis of a Water-soluble MetalÃƒÆ’Ã‚Â¢ÃƒÂ¢Ã¢â‚¬Å¡Ã‚Â¬ÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã…â€œOrganic Complex Array

Syntes av en vattenlösligt metall-organiskt komplex Array

We demonstrate a method for the synthesis of a water-soluble multimetallic peptidic array containing a predetermined sequence of metal centers such as ...

Facet-to-facet Linking of Shape-anisotropic Colloidal Cadmium Chalcogenide Nanostructures

Fasett-till-fasett länkning av form-Anisotrop kolloidal kadmium Chalcogenide nanostrukturer

Here, we describe a protocol that allows for shape-anisotropic cadmium chalcogenide nanocrystals (NCs), such as nanorods (NRs) and tetrapods (TPs), to be ...

Chemical Synthesis of Porous Barium Titanate Thin Film and Thermal Stabilization of Ferroelectric Phase by Porosity-Induced Strain

Kemisk syntes av porösa Barium Titanate tunn Film och termisk stabilisering av ferroelektrisk fas av porositet-inducerad stam

Barium titanate (BaTiO3, hereafter BT) is an established ferroelectric material first discovered in the 1940s and still widely used because of its ...

Technical Aspect of the Automated Synthesis and Real-Time Kinetic Evaluation of [11C]SNAP-7941

Technical Aspect of the Automated Synthesis and Real-Time Kinetic Evaluation of [11C]SNAP-7941

Teknisk aspekt av den automatiserade syntesen och real tids kinetisk utvärdering av [11C] SNAP-7941

Positron emission tomography (PET) is an essential molecular imaging technique providing insights into pathways and using specific targeted radioligands ...