Name: intraductal injection for localized drug delivery to the mouse mammary gland
Uploaded: 2013-10-04T23:30:00
Duration: 6 min 39 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Intraductal Injection for Localized Drug Delivery to the Mouse Mammary Gland at JoVE.com

Forfatterne vil gerne takke Michael Goldberg for at forberede stabiliseret siRNA løsning og Heather Tobin for hendes hjælp med dyrene. Denne undersøgelse blev finansieret af DOD Innovator Award W81XWH-08-1 til 0659 til DEI. Den postdoc uddannelse af SK blev støttet af Susan G Komen Foundation (KG101329). Forfatterne vil gerne takke Kristin Johnson til forberedelse af den skematiske.

1.. Fremstilling af injektionsopløsning <ol><li> Forbered 0,2% Evans blåt farvestof i phosphatbufret saltvand (PBS) eller en anden vandig opløsning af interesse. Denne vital farvestof er nyttig til at vurdere succes intraductal injektioner og anbefales som en visualisering hjælp, når de udvikler ekspertise inden for teknik. </li></ol> Den nødvendige mængde vil afhænge af antallet og placeringen af ​​kirtler, der skal injiceres. Alle 10 mælkekirtler hunmus kan injiceres, men på grund af den mindre størrelse kirtel er kirtel par 1 og 5 indsprøjtes typisk med 10 ml af opløsningen. Alle andre brystkirtler par injiceres med 20 ul. Disse mængder er tilstrækkelig til at fylde hele duktalt træet. 2. Præoperativ forberedelse <ol><li> Optag kropsvægt hver mus. Som med alle prækliniske undersøgelser, bør animalske vægte blive overvåget regelmæssigt (to gange om ugen eller mere) for at vurdere potentielle toksicitet. </li><li> Bedøve mOuse hjælp af en isofluran kammer og anvende eye smøremiddel. Under proceduren mus vil fortsat blive bedøvet ved hjælp af inhalation koncentration 2-4% isofluran i oxygen via en næse kegle. Overvåge forsigtigt musen for ændringer i respirationsfrekvens, justere niveauet for isofluran i overensstemmelse hermed. </li><li> Injicer meloxicam (5-10 mg / kg) subkutant forud for proceduren som analgesi. </li><li> Påfør en over-the-counter hårfjerning creme til brystvorten området. Vent 5 minutter og forsigtigt fjerne løse hår med en bomulds-spids applikator med en cirkulær bevægelse. Tag cremen med fugtige papirservietter fugtet med varmt vand. Barbering kan ikke anbefales på grund af risikoen for at beskadige brystvorterne. </li><li> Fastgør musen under Stereoskopet ved forsigtigt at tape ned ekstremiteterne. </li><li> Clean injektionssteder med alkoholkompresser. </li></ol> 3. Intraductal injektion <ol><li> Find passende brystvorter til at blive injiceret under Stereoskopet. Brug fine mikro-dissekere tweeZers at fjerne eventuelle døde hud, der dækker brystvorten åbning. </li><li> Load 10-20 ul injektion opløsning i en 50 ul sprøjte med en 33 G metal hub nål påsat. Undertiden efter injektion, kan små mængder (1 gl eller derunder) sive ud af sutten efter trækker nålen ud. Derfor anbefales det, at injicere 11 eller 21 pi henholdsvis at redegøre for det potentielle tab. </li><li> Hold brystvorten forsigtigt med de fine pincet og løft det lidt for at placere den til injektion. Det er ikke nødvendigt at skære brystvorten. </li><li> Injicer opløsningen langsomt for at minimere potentielle skade ved hurtigt at flytte væske inden for de duktale lumen. Injektionen bør hastigheden på cirka 40 ul / min. </li></ol> 4.. Postoperativ pleje <ol><li> Overhold injektionsstedet. Der bør ikke være nogen tegn på traumer til brystvorten region eller omgivende væv. Hævelse i området omkring brystvorten sandsynligvis indikerer en yverfedt pad injektion rather end en vellykket intraductal injektion. </li><li> Fjern dyret fra næsekeglen og flytte til et separat bur til nyttiggørelse. Placer bur under en varmelampe for at forhindre hypotermi og hjælpe i bedring. Mus er opstaldet enkeltvis, og vil blive fulgt nøje, indtil de genvinder bevidstheden og mobilitet. </li></ol> 5.. Analyse af mælkekirtelvævet <ol><li> Ved afslutningen af undersøgelsen, mus aflivet ved cervikal dislokation efter CO 2-komprimeret gas i en isolation kammer. Mælkekirtler er udskåret og kan anvendes til hele mount fremstilling 11, histologi eller RNA og protein isolation. </li></ol>

<ol>
	<li>Dooley, W. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ductal+lavage+for+detection+of+cellular+atypia+in+women+at+high+risk+for+breast+cancer.">Ductal lavage for detection of cellular atypia in women at high risk for breast cancer.</a> J Natl Cancer Inst. 93, 1624-1632 (2001).</li><li>Jacobs, L., Sukumar, S., Stearns, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intraductal+therapy+for+the+prevention+of+breast+cancer.">Intraductal therapy for the prevention of breast cancer.</a> Curr Opin Investig Drugs. 11, 646-652 (2011).</li><li>King, B. L., Love, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+intraductal+approach+to+the+breast:+raison+d'etre.">The intraductal approach to the breast: raison d'etre.</a> Breast Cancer Res. 8, 206 (2006).</li><li>Murata, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ductal+access+for+prevention+and+therapy+of+mammary+tumors.">Ductal access for prevention and therapy of mammary tumors.</a> Cancer Res. 66, 638-645 (2006).</li><li>Stearns, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preclinical+and+clinical+evaluation+of+intraductally+administered+agents+in+early+breast+cancer.">Preclinical and clinical evaluation of intraductally administered agents in early breast cancer.</a> Sci Transl Med. 3, 106ra108 (2011).</li><li>Flanagan, M., Love, S., Hwang, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Status+of+Intraductal+Therapy+for+Ductal+Carcinoma+in+Situ.">Status of Intraductal Therapy for Ductal Carcinoma in Situ.</a> Curr Breast Cancer Rep. 2, 75-82 (2010).</li><li>Nguyen, D. -. A., Beeman, N., Lewis, M., Schaack, J., Neville, M. C., Ip, M. M., Asch, B. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Methods in mammary gland biology and breast cancer research. , 259-270 (2000).</li><li>Behbod, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+intraductal+human-in-mouse+transplantation+model+mimics+the+subtypes+of+ductal+carcinoma+in+situ.">An intraductal human-in-mouse transplantation model mimics the subtypes of ductal carcinoma in situ.</a> Breast Cancer Res. 11, R66 (2009).</li><li>Bu, W., Xin, L., Toneff, M., Li, L., Li, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lentivirus+vectors+for+stably+introducing+genes+into+mammary+epithelial+cells+in+vivo.">Lentivirus vectors for stably introducing genes into mammary epithelial cells in vivo.</a> J Mammary Gland Biol Neoplasia. 14, 401-404 (2009).</li><li>Reddy, J. P., Li, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+RCAS-TVA+system+for+introduction+of+oncogenes+into+selected+somatic+mammary+epithelial+cells+in+vivo.">The RCAS-TVA system for introduction of oncogenes into selected somatic mammary epithelial cells in vivo.</a> J Mammary Gland Biol Neoplasia. 14, 405-409 (2009).</li><li>Plante, I., Stewart, M. K., Laird, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+mammary+gland+development+and+function+in+mouse+models.">Evaluation of mammary gland development and function in mouse models.</a> J. Vis. Exp. , e2828 (2011).</li></ol>

Forfatterne har ingen finansielle oplysninger.

Transgene og knockout-mus er uvurderlige værktøjer til at studere in vivo rolle enkelte gener i brystkræft. Men det er dyrt og tidskrævende at generere disse dyr og genet knockdown er normalt allestedsnærværende som undertiden udelukker os fra at anerkende de konkrete virkninger af denne gen på mælkekirtler. Derfor vil en målrettet knockdown lindre spørgsmål af ikke-specifikke bivirkninger og toksicitet i andre organer. Den intraductal injektion af siRNA præsenteres her muliggør lokaliseret genet knockdown i muse brystkirtel. Det er en hurtig fremgangsmåde til en målrettet og lokaliserede drug delivery mælkekirtlen ikke begrænset til siRNA levering. Sådan en brystkirtel-specifik drug delivery undgår uspecifikke bivirkninger og toksicitet til andre organer og giver mulighed for undersøgelse af genændringer på bestemte tidspunkter i løbet af mælkekirtlen udvikling og brysttumor-dannelse. Der er ingen tegn på siRNA-partikler i ikke-injicerede kirtler, leveren eller andre organer med yderligere beviser for, at denne fremgangsmåde viser en foretrukken måde til lokaliseret gen knockdown i mælkekirtlen. Endvidere kan intraductal injektioner gentages ugentligt eller hver anden uge i løbet af flere måneder for at give mulighed for langsigtet overvågning af terapeutiske midler. Denne teknik åbner mulighed for analyse af intraductal levering af forskellige reagenser muse mamma-kanalerne. Fremskridt i lokaliseret levering i velkarakteriserede musemodeller bør fremskynde anvendelsen af ​​non-invasive, målrettede terapeutiske strategier hos mennesker.

Musen brystkirtel er sammensat af en kompleks ductal-alveolære træ, der konvergerer ind i en central kanal på brystvorten. I mus såvel som mennesker, de fleste af brysttumorer oprindelse i de epitelceller, der beklæder mælkekanalerne. Nuværende tilgængelige behandlinger omfatter intravenøs kemoterapi, strålebehandling, og kirurgi. Lokaliseret intraductal behandlinger er blevet udforsket 1-3 og giver betydelige fordele i form af reducerede toksicitet og bivirkninger. Fortsat en række udfordringer Men før disse kan anvendes mere bredt. Evnen til at udføre lignende procedurer i muse brystkirtel letter karakterisering af intraductal interventioner. Her præsenterer vi en ikke-invasiv metode til levering af reagenser direkte i musen brystkirtler kanalen. Intraductal levering af kemoterapeutiske midler i begge brystkræftpatienter og musemodeller er tidligere blevet vist at være yderst effektiv uden tegn påsystemisk toksicitet eller langvarig histopatologiske forandringer 3-6. Endvidere har tumorcelleinjektion og lentivirusvektor levering af onkogener tidligere blevet vist at være mulig via intraductal injektion 7-10. Ud over drug delivery, denne fremgangsmåde er nyttig til lokal undertrykkelse af mælkekirtler gener gennem intraductal injektion af siRNA. Injektion af små mængder af siRNA løsning er effektiv uden at ændre anatomi og fysiologi af mælkekirtlen. I vores laboratorium har vi for nyligt vist vellykket undertrykkelse af nøglemediator gener i transgene mus, som spontant udvikler brysttumorer resulterer i forebyggelse af tumorprogression (Brock et al. Upubliceret). Vi har været i stand til at gentage hver anden uge injektioner i samme brystvorter op til 7 gange i 2-ugers intervaller uden synlige vævsskader eller toksicitet. Intraductal injektioner kan være timet i en voksen mus til at løse udvikopmentally-specifikke begivenheder relevante for mælkekirtlerne udvikling under graviditet, amning, og involution eller at målrette senere stadier i løbet af tumor udvikling og progression. Virgin hunner så unge som 8 uger er blevet injiceret non-invasivt i vores laboratorium.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Name of Reagent/Material</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>isoflurane</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>2-4%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>meloxicam</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>5-10 mg/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Evans blue dye</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E2129-10G</td>
			<td>0.2% in PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>hair removing cream</td>
			<td>Veet</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Choose sensitive option</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>stereoscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>Stemi DV4</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>micro-dissecting tweezers</td>
			<td>Roboz</td>
			<td>rs-4976</td>
			<td>With a 0.10 x 0.06 mm tip made of dumostar</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hamilton syringe</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>7637-01</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>33-gauge needle</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>7803-05</td>
			<td>point style 4, 12 degree bevel (standard)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>siGLO cyclophilin B control siRNA</td>
			<td>Dharmacon</td>
			<td>D-001610-01-05</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

intraductal injection for localized drug delivery to the mouse mammary gland

Heri beskriver vi en protokol til at levere forskellige reagenser til muse brystkirtel via intraductal injektioner. Lokaliseret drug delivery og knock-down af gener indenfor brystepitel har været svært at opnå på grund af manglen på egnede målsøgningsmolekyler der er uafhængige af udviklingsstadier såsom graviditet og amning. Heri beskriver vi en teknik til lokaliseret levering af reagenser til mælkekirtlen på noget tidspunkt i voksenalderen via intraductal injektion i brystvorterne af mus. Injektionerne kan udføres på levende mus under anæstesi, og giver mulighed for en ikke-invasiv og lokaliserede drug delivery mælkekirtlen. Derudover kan injektioner gentages over flere måneder uden at beskadige brystvorten. Vital farvestoffer såsom Evans Blå er meget nyttigt at lære teknikken. Ved intraductal injektion af det blå farvestof, bliver hele duktalt træet synlige for øjet. Endvidere fluorescerende mærkede reagenser også mulighed forvisualisering og spredning i mælkekirtler. Denne teknik kan tilpasses til en række forskellige forbindelser, herunder siRNA, kemoterapeutiske midler og små molekyler.

Brystvorterne kan nemt lokaliseres ved hjælp af et stereomikroskop, når håret er fjernet i området omkring det (figur 1A). At beherske den injektionsteknik, anbefales det at injicere Evans blåt farvestof og overvåge integriteten af overdelen (figur 1B og C). Denne fremgangsmåde giver også mulighed for bestemmelse af passende mængder, der skal injiceres i hver kirtel som man visuelt kan vurdere, om farvestoffet når hele gangsystemet (figur 1C og 2A). Et billede af den injicerede Evans blue billede kan derefter sammenlignes for hele monteret brystkirtel, hvor hele duktalt træet er farvet med Carmine alun farvestof (figur 2B). Bemærk venligst, at robustheden af ​​denne injektion metode er meget afhængig af operatøren. For eksempel vil perforere kanalen resultere i en brystkirtel fedtpude injektion og injicere opløsningen for hurtigt kan beskadige duktale epitel CELls og provokere en inflammatorisk reaktion. Vellykket intraductal indsprøjtning muliggør lokaliseret drug delivery til mælkekirtlerne og reducerer uspecifikke bivirkninger ofte observeret andet. Et eksempel billede af en kirtel injiceret med fluorescens-mærkede siRNA rettet cyclophilin (en ikke-essentielt gen) er vist i figur 3.. <img alt="Figur 1" src="/files/ftp_upload/50692/50692fig1.jpg" /> Figur 1. En lyskebrok brystkirtel indsprøjtes gennem niplen med Evans-blåt farvestof. A) Udseende af brystvorten før injektion og B) efter injektion med 20 pi Evans blåt farvestof. Der observeres ingen hævelse eller vævsskade. C) Efter åbning huden, farvestoffet tillader visualisering af hele brystkirtler duktalt træet. <img alt="Figur 2" src="/files/ftp_upload/50692/50692fig2.jpg" /> Figur 2. Whole-mount analyse af Evans blåt iProjected kirtel. A) repræsentant billede af en dissekeret kirtel udskåret fra dyret, og spredt på et objektglas straks efter injektion. B) Whole mount farvning af samme kirtel med carmin farvestof efter fedt var blevet ryddet. Sammenligning med A) bekræfter, at den injicerede løsning fylder brystkirtler duktalt træet og kirtel er anatomisk intakt. <img alt="Figur 3" src="/files/ftp_upload/50692/50692fig3.jpg" /> Figur 3. Intraductal levering af fluorescerende siRNA. Repræsentant billede af frisk vævsprøve, fjernet 48 timer efter injektion.

Watch this Scientific Journal Video about Intraductal Injection for Localized Drug Delivery to the Mouse Mammary Gland at JoVE.com

Intraductal Injection for Localized Drug Delivery to the Mouse Mammary Gland

En protokol for non-invasiv intraductal levering af vandige reagenser til muse brystkirtel beskrevet. Metoden udnytter lokaliseret injektion i brystvorterne af mælkekirtlerne rettet brystkirtler kanaler specifikt. Denne teknik kan tilpasses til en række forskellige forbindelser, herunder siRNA, kemoterapeutiske midler og små molekyler.

Intraductal Injection til Lokaliseret Drug Delivery til Mouse mælkekirtlerne

Herein we describe a protocol to deliver various reagents to the mouse mammary gland via intraductal injections. Localized drug delivery and knock-down of ...

Research

JoVE Journal

Biology

Mouse Mammary Epithelial Cells form Mammospheres During Lactogenic Differentiation

A phenotypic measure commonly used to determine the degree of lactogenic differentiation in mouse mammary epithelial cell cultures is the formation of ...

Changes in Mammary Gland Morphology and Breast Cancer Risk in Rats

Studies in rodent models of breast cancer show that exposures to dietary/hormonal factors during the in utero and pubertal periods, when the mammary gland ...

Evaluation of Mammary Gland Development and Function in Mouse Models

The human mammary gland is composed of 15-20 lobes that secrete milk into a branching duct system opening at the nipple. Those lobes are themselves ...

Phosphopeptide Analysis of Rodent Epididymal Spermatozoa

Phosphopeptid Analyse af gnaver epididymale Spermatozoer

Spermatozoa are quite unique amongst cell types. Although produced in the testis, both nuclear gene transcription and translation are switched off once ...

Indirect Immunofluorescence on Frozen Sections of Mouse Mammary Gland

Indirekte Immunofluorescens på frosne snit af Mouse brystkirtel

Indirect immunofluorescence is used to detect and locate proteins of interest in a tissue. The protocol presented here describes a complete and simple ...

A Comparative Study of Drug Delivery Methods Targeted to the Mouse Inner Ear: Bullostomy Versus Transtympanic Injection

A Comparative Study of Drug Delivery Methods Targeted to the Mouse Inner Ear: Bullostomy Versus Transtympanic Injection

En sammenlignende undersøgelse af Drug Delivery Metoder Målrettede til Mouse indre øre: Bullostomy<em&gt; Versus</em&gt; Transtympanic Injection

We present two minimally invasive microsurgical techniques in rodents for specific drug delivery into the middle ear so that it may reach the inner ear. ...

Isolation of Intact, Whole Mouse Mammary Glands for Analysis of Extracellular Matrix Expression and Gland Morphology

Isolering af intakt, hele musen mælkekirtlerne for analyse af ekstracellulære Matrix udtryk og morfologi, kirtel

The goal of this procedure was to harvest the #4 abdominal mammary glands from female nulliparous mice in order to assess ECM expression and ductal ...

Partial Bile Duct Ligation in the Mouse: A Controlled Model of Localized Obstructive Cholestasis

Delvis galdegang ligatur i musen: et kontrolleret Model af lokaliserede obstruktiv kolestase

In rodents, complete bile duct ligation (cBDL) of the common bile duct is an established surgical technique for studying obstructive cholestasis and bile ...

Trans-inner Cell Mass Injection of Embryonic Stem Cells Leads to Higher Chimerism Rates

Trans-indre celle masse injektion af stamceller fra embryoner fører til højere kimærisme

In an effort to increase efficiency in the creation of genetically modified mice via ES Cell methodologies, we present an adaptation to the current ...

Laser-assisted Lentiviral Gene Delivery to Mouse Fertilized Eggs

Laser-assisteret Lentiviral gen levering til musen befrugtede æg

Lentiviruses are efficient vectors for gene delivery to mammalian cells. Following transduction, the lentiviral genome is stably incorporated into the ...