Name: large-scale gene knockdown in c. elegans using dsrna feeding libraries to generate robust loss-of-function phenotypes
Uploaded: 2013-09-25T19:00:00
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この作品は、健康MH097163の国立研究所からの資金によって支えられている。いくつかの株は、研究基盤プログラムのNIHのオフィス（P40-OD010440）によって資金を供給されるCGC、提供された。

注意：このプロトコルは、組織型の種々様々な生物学的プロセスに必要な遺伝子を同定するために使用することができる。画面の中の必要な品質対照として、動物は、標的組織におけるRNAi効果を実証するために、制御dsRNAを発現する細菌摂食の両方に正および負である。 他の公開給餌プロトコルは、50μg/ mlのアンピシリンまたは25μg/ mlのカルベニシリン8月10?...

<ol>
	<li>Mello, C. C., Conte, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Revealing+the+world+of+RNA+interference.">Revealing the world of RNA interference.</a> Nature. 431 (7006), 338-342 (2004).</li><li>Fire, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Potent+and+specific+genetic+interference+by+double-stranded+RNA+in+Caenorhabditis+elegans.">Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans.</a> Nature. 391 (6669), 806-811 (1998).</li><li>Tabara, H., Grishok, A., Mello, C. 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Sci. 106, 2283-2288 (2009).</li><li>Kamath, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systematic+functional+analysis+of+the+Caenorhabditis+elegans+genome+using+RNAi.">Systematic functional analysis of the Caenorhabditis elegans genome using RNAi.</a> Nature. 421 (6920), 231-237 (2003).</li><li>Rual, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toward+improving+Caenorhabditis+elegans+phenome+mapping+with+an+ORFeome-based+RNAi+library.">Toward improving Caenorhabditis elegans phenome mapping with an ORFeome-based RNAi library.</a> Genome Res. 14, 2162-2168 (2004).</li><li>Simmer, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+RNAi+of+C.+elegans+using+the+hypersensitive+rrf-3+strain+reveals+novel+gene+functions.">Genome-wide RNAi of C. elegans using the hypersensitive rrf-3 strain reveals novel gene functions.</a> PLoS Biol. 1, 77-84 (2003).</li><li>Lee, S. 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M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=elegans+unc-4+gene+encodes+a+homeodomain+protein+that+determines+the+pattern+of+synaptic+input+to+specific+motor+neurons.">elegans unc-4 gene encodes a homeodomain protein that determines the pattern of synaptic input to specific motor neurons.</a> Nature. 355, 841-845 (1992).</li><li>White, J. G., Southgate, E., Thomson, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutations+in+the+Caenorhabditis+elegans+unc-4+gene+alter+the+synaptic+input+to+ventral+cord+motor+neurons.">Mutations in the Caenorhabditis elegans unc-4 gene alter the synaptic input to ventral cord motor neurons.</a> Nature. 355, 838-841 (1992).</li><li>Johnson, N. M., Behm, C. A., Trowell, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heritable+and+inducible+gene+knockdown+in+C.+elegans+using+Wormgate+and+the+ORFeome.">Heritable and inducible gene knockdown in C. elegans using Wormgate and the ORFeome.</a> Gene. 359, 26-34 (2005).</li><li>Wani, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=D1+dopamine+receptor+signaling+is+modulated+by+the+R7+RGS+protein+EAT-16+and+the+R7+binding+protein+RSBP-1+in+Caenoerhabditis+elegans+motor+neurons.">D1 dopamine receptor signaling is modulated by the R7 RGS protein EAT-16 and the R7 binding protein RSBP-1 in Caenoerhabditis elegans motor neurons.</a> PLoS One. 7 (5), e37831 (2012).</li><li>Beifuss, K. K., Gumienny, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNAi+screening+to+identify+postembryonic+phenotypes+in+C.+elegans.">RNAi screening to identify postembryonic phenotypes in C. elegans.</a> J. Vis. Exp. (60), e3442 (2012).</li></ol>

我々はC.大規模スクリーニングを行うために、市販のdsRNAを送りライブラリを使用してプロトコルを記載した虫 。我々は、ライブラリを複製し、それを効果的に使用するようにすべての手順を説明します。我々は、このアプローチは、動物の異なる組織における異なる生物学的過程に関与する遺伝子を同定することができることを実証している。我々はここで説明した表現型が?...

Cの歴史的には、遺伝子スクリーニングエレガンスは、DNA内にランダム突然変異を作成するために、例えば、エチルメタンスルホネートなどの化学変異原で動物を処理することによって行われている。変異誘発された動物の子孫またはgrandprogenyは、その展示を希望する異常な表現型を分離している。表現型を引き起こす原因となる変異は、次いで、労働集約的なマッピング手順を介して、または変異型ワームの全ゲノムを配列決定することによって同定される。そこに、彼らは両方のゲイン関数のと機能喪失型の表現型を引き起こすことができるワームゲノム内の恒久的な損傷を作成するような化学的突然変異誘発画面を実行するには多くの利点がありますが、マッピング手順が遅く、高価である。 二本鎖RNA干渉（dsRNAi）の重要な生物学的過程に関与する遺伝子を同定するための代替手段を提供する。この方法では、内因性遺伝子のコード配列に一致するdsRNAはウォームに導入される。dsRNAはガイドが破壊1のためにそれらを標的化、マッチング内因性mRNAを見つけて結合するように機能する小さな（21〜22ヌクレオチド）RNAを生成するために、 生体内で処理される。この手順は、比較的迅速であるが、dsRNAがmRNAのではなく、DNAを標的とするため、唯一の還元の機能表現型は、このアプローチを使用して観察される。 動物へのdsRNAの導入は、dsRNAの3匹の動物を浸漬することにより、またはdsRNA 4を発現する動物の細菌を供給することにより、2のdsRNAの直接注射により達成することができる。これらの送達方法はそれぞれの動物のほとんどの細胞は、SID-1は、dsRNA 5のインポートが可能な膜貫通チャネルを表現するなどの全身のノックダウン効果を引き起こす。当初の時点で、個々の遺伝子の発現のいずれかをノックダウンする逆遺伝学的アプローチとして用い、2つの給電ライブラリーの開発は、現在、大規模な遺伝子スクリーニングを可能にする。市販のdsRNAはライブラリはBAが含まれているすべてのCの 55パーセント以上87パーセントのどちらかを表現cterialクローン虫の遺伝子6、7。 残念ながら、大規模なdsRNAi送り画面は、多くの場合、変数のノックダウン効率8月10日になる。 RNAiによるノックダウンの絶対レベルは容易に測定されていないが、大規模な画面で観察減少ノックダウン効率は、RNAiによる分解を免れる残留遺伝子特異的なmRNAによって引き起こされている必要があります。これは、順番に、これらの画面で動物に供給される細菌からのdsRNAのプラスミドの損失の直接の結果であってもよい。ノックダウン効果を給餌した動物11を制御するために比較した場合、（もしあれば）は、この考えを支持する、動物は、細菌の50％のみが標的遺伝子に対するdsRNAを発現する細菌の混合物を供給し、劇的に減少を示す。 Cのほとんどの遺伝子としてdsRNAi画面を実行するときに遺伝子ノックダウンの程度は重大な関心事になるエレガンス haplosufficientであり、したがって、遺伝子発現は少なくとも50％のtだけ小さくしなければならないO機能喪失は12を表現型の原因。 我々は、大規模なスクリーニングを行うために以前に公開された給餌プロトコルを使用し、他の8〜10によって報告された同一の変数ノックダウン効果を見出した。考えられる原因の検索では、画面内の動物に与えた細菌の60％近くは、dsRNAのプラスミドを失っていたことがわかった。当社は、飛躍的に低減または排除するプラスミドの損失を大幅ノックダウン効率を改善し、ライブラリの重複やスクリーニングプロトコルを開発した。このプロトコルは、C.大規模スクリーニングを実施するのに適しているエレガンスとは、市販のdsRNAライブラリーのどれかをスクリーニングするために使用することができる。このプロトコルを使用して、我々は、画面中、動物に供給された細菌の本質的に100％がdsRNAをコードするプラスミドを保持し、試験した全ての組織における機能の表現型の堅牢で高度に浸透損失を引き起こすことを発見。

<table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>Reagent/Material</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>96-well Falcon flat bottom plate </td>
 <td>Fisher Scientific</td>
 <td>353072</td>
 <td>sterile</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>adhesive foil</td>
 <td>USA Scientific</td>
 <td>2923-0100</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Nunc omniplate</td>
 <td>Fisher Scientific</td>
 <td>267060</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>2.0 ml deep 96-well polypropylene Masterblock</td>
 <td>USA Scientific</td>
 <td>5678-0285</td>
 <td>autoclavable</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Lids for deep well plates</td>
 <td>USA Scientific</td>
 <td>5665-6101</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>50 ml combitips</td>
 <td>USA Scientific</td>
 <td>4796-5000</td>
 <td>individually wrapped</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Reservoir</td>
 <td>USA Scientific</td>
 <td>2977-8500</td>
 <td>autoclavable</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>12-well plates</td>
 <td>USA Scientific</td>
 <td>CC7682-7512</td>
 <td>individually wrapped</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>dsRNA feeding library</td>
 <td>OpenBiosystems</td>
 <td>RCE1181</td>
 <td>store -80 &deg;C</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Ampicillin</td>
 <td>Fisher Scientific</td>
 <td>BP1760-5</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Tetracycline</td>
 <td>Fisher Scientific</td>
 <td>BP912-100</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Carbenicillin</td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>allow 2-4 weeks for delivery <a href="http://www.biochemicaldirect.com" target="_blank">www.biochemicaldirect.com</a></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Bacteriolgical Agar Ultrapure grade A </td>
 <td>Affymetrix</td>
 <td>10906</td>
 <td>for worm plates</td>
 </tr>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>Equipment</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Brayer roller</td>
 <td>USA Scientific</td>
 <td>9127-2940</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Boekel 96-pin replicator</td>
 <td>Fisher Scientific</td>
 <td>05-450-9</td>
 <td>autoclavable</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>microshaker</td>
 <td>Thomas Scientific</td>
 <td>1231A93</td>
 <td>3 mm orbit</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>12 channel multichannel pipet (0.5-10 &mu;l)</td>
 <td>USA Scientific</td>
 <td>7112-0510</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>12 channel multichannel pipet (30-300 &mu;l)</td>
 <td>USA Scientific</td>
 <td>7112-3300</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Repeater Plus manual pipettor</td>
 <td>USA Scientific</td>
 <td>4026-0201</td>
 <td></td>
 </tr>
 </tbody>
 </table>

large-scale gene knockdown in c. elegans using dsrna feeding libraries to generate robust loss-of-function phenotypes

dsRNAを発現するワーム細菌を供給することにより、RNA干渉は、C.での遺伝子機能を評価するための有用なツールであった虫 。少数の遺伝子がノックダウンの標的とされるときにこの戦略はうまく機能するが、大規模な給電スクリーンはそれらの有用性を制限する、可変ノックダウン効率を示している。我々は、以前に公表されたRNAiノックダウンプロトコルを解体させ、ノックダウンの主な原因は、動物に与え細菌からのdsRNAをコードするプラスミドの喪失に起因し得ることを見出した。これらの観​​察に基づいて、我々は非常に効率的な、ハイスループットノックダウンを達成するために、プラスミド損失を低減または排除するのdsRNA給餌プロトコルを開発した。我々は、このプロトコルはCのダウン、堅牢で再現性のあるノックを生成することを実証ニューロンを含む複数の組織タイプで遺伝子を、 線虫 、および大規模なスクリーニングにおいて効率的なノックダウンを可能にする。このプロトコルは、市販のdsRNA送りを使用していますライブラリとライブラリを複製したdsRNAの画面を実行するために必要なすべての手順を説明します。プロトコルは任意の高度な機器の使用を必要としないので、任意C.によって行うことができるラボエレガンス 。

P0ノックダウン表現型は、細菌を表現するdsRNA動物の飼育、2〜3日後に表示されるようになります。いくつかの初期の表現型は、幼虫の逮捕と致死性が含まれており、すべての給紙のウエル2〜3％で観察されるべきである。これらの同じ表現型はまた、F1世代の動物で観察されるであろう。孵化に失敗し、F1の卵の存在は、他の一般的なF1の表現型であり、一緒に、これらの3表現型は、F1の画面?...

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Large-scale Gene Knockdown in C. elegans Using dsRNA Feeding Libraries to Generate Robust Loss-of-function Phenotypes

dsRNAは、Cで供給しながら、 エレガンスは、大規模な送り画面の現在のプロトコルは、可変ノックダウン効率をもたらす遺伝子機能を評価するための強力なツールである。我々は、遺伝子発現の非常に有効かつ再現性のノックダウンをもたらす大規模なRNAi送り画面を実行するための改良されたプロトコルを記載している。

大規模な遺伝子ノックダウン中<em&gt; C.虫</em&gt;堅牢な機能喪失表現型を生成するためのdsRNA摂食ライブラリの使用

RNA interference by feeding worms bacteria expressing dsRNAs has been a useful tool to assess gene function in C. elegans. While this strategy works well ...

Research

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Biology

Large-scale Gene Knockdown in C. elegans Using dsRNA Feeding Libraries to Generate Robust Loss-of-function Phenotypes

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