Name: large-scale gene knockdown in c. elegans using dsrna feeding libraries to generate robust loss-of-function phenotypes
Uploaded: 2013-09-25T19:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Large-scale Gene Knockdown in C. elegans Using dsRNA Feeding Libraries to Generate Robust Loss-of-function Phenotypes at JoVE.com

Detta arbete stöddes av medel från National Institutes of Health MH097163. Vissa stammar lämnades av CGC, som finansieras av NIH Office of Research Infrastructure Program (P40-OD010440).

Anmärkning: Detta protokoll kan användas för att identifiera gener som krävs för en mängd olika biologiska processer i en mängd olika vävnadstyper. Som en nödvändig kvalitetskontroll under skärmen, djuren utfodras både positiva och negativa kontroll dsRNA-uttryckande bakterier att visa RNAi effekter i den riktade vävnaden. Andra publicerade utfodringsprotokoll växa dsRNA-uttryckande bakterier i närvaro av antingen 50 ng / ml ampicillin eller 25 | ig / ml karbenicillin...

<ol>
	<li>Mello, C. C., Conte, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Revealing+the+world+of+RNA+interference.">Revealing the world of RNA interference.</a> Nature. 431 (7006), 338-342 (2004).</li><li>Fire, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Potent+and+specific+genetic+interference+by+double-stranded+RNA+in+Caenorhabditis+elegans.">Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans.</a> Nature. 391 (6669), 806-811 (1998).</li><li>Tabara, H., Grishok, A., Mello, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNAi+in+C.+elegans:+soaking+in+the+genome+sequence.">RNAi in C. elegans: soaking in the genome sequence.</a> Science. 282 (5388), 430-431 (1998).</li><li>Timmons, L., Fire, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specific+interference+by+ingested+dsRNA.">Specific interference by ingested dsRNA.</a> Nature. 395, 854 (1998).</li><li>Jose, A. M., Smith, J. J., Hunter, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Export+of+RNA+silencing+from+C.+elegans+tissues+does+not+require+the+RNA+channel+SID-1.">Export of RNA silencing from C. elegans tissues does not require the RNA channel SID-1.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. 106, 2283-2288 (2009).</li><li>Kamath, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systematic+functional+analysis+of+the+Caenorhabditis+elegans+genome+using+RNAi.">Systematic functional analysis of the Caenorhabditis elegans genome using RNAi.</a> Nature. 421 (6920), 231-237 (2003).</li><li>Rual, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toward+improving+Caenorhabditis+elegans+phenome+mapping+with+an+ORFeome-based+RNAi+library.">Toward improving Caenorhabditis elegans phenome mapping with an ORFeome-based RNAi library.</a> Genome Res. 14, 2162-2168 (2004).</li><li>Simmer, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+RNAi+of+C.+elegans+using+the+hypersensitive+rrf-3+strain+reveals+novel+gene+functions.">Genome-wide RNAi of C. elegans using the hypersensitive rrf-3 strain reveals novel gene functions.</a> PLoS Biol. 1, 77-84 (2003).</li><li>Lee, S. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+systematic+RNAi+screen+identifies+a+critical+role+for+mitochondria+in+C.+elegans+longevity.">A systematic RNAi screen identifies a critical role for mitochondria in C. elegans longevity.</a> Nat. Genet. 33 (1), 40-48 (2003).</li><li>Sieburth, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systematic+analysis+of+genes+required+for+synapse+structure+and+function.">Systematic analysis of genes required for synapse structure and function.</a> Nature. 436 (7050), 510-517 (2005).</li><li>Kamath, R. S., Martinez-Campos, M., Zipperlen, P., Fraser, A. G., Ahringer, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effectiveness+of+specific+RNA-mediated+interference+through+ingested+double-stranded+RNA+in+Caenorhabditis+elegans.">Effectiveness of specific RNA-mediated interference through ingested double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans.</a> Genome Biol. 2 (1), (2001).</li><li>Hodgkin, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Karyotype,+ploidy,+and+gene+dosage.">Karyotype, ploidy, and gene dosage.</a> WormBook. , 1-9 (2005).</li><li>Kennedy, S., Wang, D., Ruvkun, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+conserved+siRNA-degrading+RNase+negatively+regulates+RNA+interference+in+C.+elegans.">A conserved siRNA-degrading RNase negatively regulates RNA interference in C. elegans.</a> Nature. 427 (6975), 645-649 (2004).</li><li>Wang, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Somatic+misexpression+of+germline+P+granules+and+enhanced+RNA+interference+in+retinoblastoma+pathway+mutants.">Somatic misexpression of germline P granules and enhanced RNA interference in retinoblastoma pathway mutants.</a> Nature. 436 (7050), 593-597 (2005).</li><li>Lackner, M. R., Nurrish, S. J., Kaplan, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Facilitation+of+synaptic+transmission+by+EGL-30+Gqalpha+and+EGL-8+PLCbeta:+DAG+binding+to+UNC-13+is+required+to+stimulate+acetylcholine+release.">Facilitation of synaptic transmission by EGL-30 Gqalpha and EGL-8 PLCbeta: DAG binding to UNC-13 is required to stimulate acetylcholine release.</a> Neuron. 24 (2), 335-346 (1999).</li><li>Bastiani, C. A., Gharib, S., Simon, M. I., Sternberg, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caenorhabditis+elegans+Galphaq+regulates+egg-laying+behavior+via+a+PLCbeta-independent+and+serotonin-dependent+signaling+pathway+and+likely+functions+both+in+the+nervous+system+and+in+muscle.">Caenorhabditis elegans Galphaq regulates egg-laying behavior via a PLCbeta-independent and serotonin-dependent signaling pathway and likely functions both in the nervous system and in muscle.</a> Genetics. 165 (4), 1805-1822 (2003).</li><li>Lickteig, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+neurotransmitter+vesicles+by+the+homeodomain+protein+UNC-4+and+its+transcriptional+corepressor+UNC-37/groucho+in+Caenorhabditis+elegans+cholinergic+motor+neurons.">Regulation of neurotransmitter vesicles by the homeodomain protein UNC-4 and its transcriptional corepressor UNC-37/groucho in Caenorhabditis elegans cholinergic motor neurons.</a> J. Neurosci. 21 (6), 2001-2014 (2001).</li><li>Terami, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genomic+organization,+expression,+and+analysis+of+the+troponin+C+gene+pat-10+of+Caenorhabditis+elegans.">Genomic organization, expression, and analysis of the troponin C gene pat-10 of Caenorhabditis elegans.</a> J Cell Biol. 146 (1), 193-202 (1999).</li><li>Novelli, J., Page, A. P., Hodgkin, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+C+terminus+of+collagen+SQT-3+has+complex+and+essential+functions+in+nematode+collagen+assembly.">The C terminus of collagen SQT-3 has complex and essential functions in nematode collagen assembly.</a> Genetics. 172 (4), 2253-2267 (2006).</li><li>Brundage, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutations+in+a+C.+elegans+Gqalpha+gene+disrupt+movement,+egg+laying,+and+viability.">Mutations in a C. elegans Gqalpha gene disrupt movement, egg laying, and viability.</a> Neuron. 16 (5), 999-1009 (1996).</li><li>G&#246;nczy, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+genomic+analysis+of+cell+division+in+C.+elegans+using+RNAi+of+genes+on+chromosome+III.">Functional genomic analysis of cell division in C. elegans using RNAi of genes on chromosome III.</a> Nature. 408 (6810), 331-336 (2000).</li><li>Miller, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=elegans+unc-4+gene+encodes+a+homeodomain+protein+that+determines+the+pattern+of+synaptic+input+to+specific+motor+neurons.">elegans unc-4 gene encodes a homeodomain protein that determines the pattern of synaptic input to specific motor neurons.</a> Nature. 355, 841-845 (1992).</li><li>White, J. G., Southgate, E., Thomson, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutations+in+the+Caenorhabditis+elegans+unc-4+gene+alter+the+synaptic+input+to+ventral+cord+motor+neurons.">Mutations in the Caenorhabditis elegans unc-4 gene alter the synaptic input to ventral cord motor neurons.</a> Nature. 355, 838-841 (1992).</li><li>Johnson, N. M., Behm, C. A., Trowell, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heritable+and+inducible+gene+knockdown+in+C.+elegans+using+Wormgate+and+the+ORFeome.">Heritable and inducible gene knockdown in C. elegans using Wormgate and the ORFeome.</a> Gene. 359, 26-34 (2005).</li><li>Wani, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=D1+dopamine+receptor+signaling+is+modulated+by+the+R7+RGS+protein+EAT-16+and+the+R7+binding+protein+RSBP-1+in+Caenoerhabditis+elegans+motor+neurons.">D1 dopamine receptor signaling is modulated by the R7 RGS protein EAT-16 and the R7 binding protein RSBP-1 in Caenoerhabditis elegans motor neurons.</a> PLoS One. 7 (5), e37831 (2012).</li><li>Beifuss, K. K., Gumienny, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNAi+screening+to+identify+postembryonic+phenotypes+in+C.+elegans.">RNAi screening to identify postembryonic phenotypes in C. elegans.</a> J. Vis. Exp. (60), e3442 (2012).</li></ol>

Vi har beskrivit ett protokoll som använder en kommersiellt tillgänglig dsRNA utfodring bibliotek för att utföra storskaliga skärmar i C. elegans. Vi erbjuder alla instruktioner att duplicera biblioteket och att använda den på ett effektivt sätt. Vi visar att detta tillvägagångssätt kan identifiera gener som är involverade i olika biologiska processer i olika vävnader hos djuret. Medan de fenotyper som vi beskriver här är lätt att observera (Unc, Egl och Dpy), kan detta protokoll anpassas för a...

Historiskt, genetiska skärmar i C. elegans har utförts genom att behandla djur med en kemisk mutagen såsom etylmetansulfonat för att skapa slumpmässiga mutationer i DNA. Progeny eller grandprogeny av muterade djur isoleras sedan som uppvisar en önskad onormal fenotyp. Mutationen som förorsakat fenotypen sedan identifieras genom en arbetsintensiv kartläggning förfarande eller genom sekvensering av mutant mask hela arvsmassa. Det finns många fördelar med att utföra sådana kemiska mutagenes skärmar eftersom de skapar permanenta skador inom masken genomet som kan resultera i både vinst-av-funktion och förlust-av-funktion fenotyper, men kartläggningen förfarandet är långsamt och dyrt. Dubbel-RNA interferens (dsRNAi) ger ett alternativt sätt för att identifiera gener som är involverade i viktiga biologiska processer. I denna metod är dsRNA matcha den kodande sekvensen av en endogen gen införes i masken.Den dsRNA bearbetas in vivo för att generera små (21-22 nukleotider) RNA som fungerar som guider för att hitta och binda matchande endogena mRNA, rikta dem till destruktion 1. Detta förfarande är relativt snabb, men eftersom dsRNA riktar mRNA istället för DNA, är endast minskning-av-funktion fenotyper observerats med hjälp av denna metod. Införande av dsRNA i ett djur kan åstadkommas genom direkt injektion av dsRNA 2, genom att blötlägga djur i dsRNA 3, eller genom att mata djur bakterier som uttrycker dsRNA 4. Var och en av dessa administreringsmetoder orsaka systemknockdown effekter eftersom de flesta celler i djuret uttrycka SID-1, en ​​transmembrankanal som medger import dsRNA 5. Ursprungligen användes som en omvänd genetik tillvägagångssätt att knockdown uttrycket av enskilda gener en i taget, tillåter utveckling av två bibliotek utfodring nu storskaliga genetiska skärmar. De kommersiellt tillgängliga dsRNA bibliotek innehåller bacterial kloner som representerar antingen 55% eller 87% av alla C. elegans gener 6, 7. Tyvärr, storskaliga dsRNAi utfodring skärmar ofta resultera i variabla knockdown effektivitet 8-10. Medan den absoluta nivån på knockdown av RNAi inte är lätt att mäta, måste den minskade knockdown effektivitet observerats i storskaliga skärmar orsakas av kvarvarande genspecifika mRNA som undgår nedbrytning av RNAi. Detta, i sin tur, skulle kunna vara en direkt följd av dsRNA plasmidförlust från bakterier ges till djur i dessa skärmar. Stöd denna idé, djur utfodras blandningar av bakterier, i vilken endast 50% av de bakterier som uttrycker dsRNAs mot en målinriktad gen, show dramatiskt reduceras (om några) knockdown effekter jämfört med kontroll utfodrade djur 11. Omfattningen av genen knockdown blir en viktig fråga när du utför dsRNAi skärmar som de flesta gener i C. elegans är haplosufficient och därmed genuttryck måste minskas med minst 50% to orsaka förlust-av-funktion fenotyper 12. Vi har använt tidigare publicerade utfodring protokoll för att utföra storskaliga skärmar och fann samma variabla knockdown som rapporterats av andra 8-10. I ett sökande efter möjliga orsaker, fann vi att nästan 60% av de bakterier som ges till djur i skärmen hade förlorat dsRNA plasmiden. Vi har utvecklat ett bibliotek dubbelarbete och screeningprotokoll som dramatiskt minskar eller eliminerar plasmidförlust och kraftigt förbättrar knockdown effektivitet. Detta protokoll är lämpligt för att utföra storskaliga skärmar i C. elegans och kan användas för att screena antingen en av de kommersiellt tillgängliga dsRNA bibliotek. Med hjälp av detta protokoll, finner vi att i huvudsak 100% av de bakterier som ges till djur under skärmen behåller dsRNA-kodande plasmiden och orsaka robust och mycket penetrerande förlorad funktion fenotyper i alla vävnader som undersökts.

<table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>Reagent/Material</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>96-well Falcon flat bottom plate </td>
 <td>Fisher Scientific</td>
 <td>353072</td>
 <td>sterile</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>adhesive foil</td>
 <td>USA Scientific</td>
 <td>2923-0100</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Nunc omniplate</td>
 <td>Fisher Scientific</td>
 <td>267060</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>2.0 ml deep 96-well polypropylene Masterblock</td>
 <td>USA Scientific</td>
 <td>5678-0285</td>
 <td>autoclavable</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Lids for deep well plates</td>
 <td>USA Scientific</td>
 <td>5665-6101</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>50 ml combitips</td>
 <td>USA Scientific</td>
 <td>4796-5000</td>
 <td>individually wrapped</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Reservoir</td>
 <td>USA Scientific</td>
 <td>2977-8500</td>
 <td>autoclavable</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>12-well plates</td>
 <td>USA Scientific</td>
 <td>CC7682-7512</td>
 <td>individually wrapped</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>dsRNA feeding library</td>
 <td>OpenBiosystems</td>
 <td>RCE1181</td>
 <td>store -80 &deg;C</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Ampicillin</td>
 <td>Fisher Scientific</td>
 <td>BP1760-5</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Tetracycline</td>
 <td>Fisher Scientific</td>
 <td>BP912-100</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Carbenicillin</td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>allow 2-4 weeks for delivery <a href="http://www.biochemicaldirect.com" target="_blank">www.biochemicaldirect.com</a></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Bacteriolgical Agar Ultrapure grade A </td>
 <td>Affymetrix</td>
 <td>10906</td>
 <td>for worm plates</td>
 </tr>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>Equipment</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Brayer roller</td>
 <td>USA Scientific</td>
 <td>9127-2940</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Boekel 96-pin replicator</td>
 <td>Fisher Scientific</td>
 <td>05-450-9</td>
 <td>autoclavable</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>microshaker</td>
 <td>Thomas Scientific</td>
 <td>1231A93</td>
 <td>3 mm orbit</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>12 channel multichannel pipet (0.5-10 &mu;l)</td>
 <td>USA Scientific</td>
 <td>7112-0510</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>12 channel multichannel pipet (30-300 &mu;l)</td>
 <td>USA Scientific</td>
 <td>7112-3300</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Repeater Plus manual pipettor</td>
 <td>USA Scientific</td>
 <td>4026-0201</td>
 <td></td>
 </tr>
 </tbody>
 </table>

large-scale gene knockdown in c. elegans using dsrna feeding libraries to generate robust loss-of-function phenotypes

RNA-interferens genom att mata maskar bakterier som uttrycker dsRNAs har varit ett användbart verktyg för att bedöma geners funktion i C. elegans. Även denna strategi fungerar bra när ett litet antal gener är riktade för knockdown, storskaliga utfodring skärmar visar variabla knockdown effektivitet, vilket begränsar deras användbarhet. Vi har ratas tidigare publicerade RNAi knockdown-protokoll och fann att den primära källan för det reducerade knockdown kan tillskrivas förlusten av dsRNA-kodande plasmider från bakterierna ges till djuren. Baserat på dessa observationer, har vi utvecklat en dsRNA utfodring protokoll som kraftigt reducerar eller eliminerar plasmidförlust att uppnå effektiv, hög genomströmning knockdown. Vi visar att detta protokoll kommer att producera robust, reproducerbar knock ned av C. elegans gener i olika vävnadstyper, inklusive nervceller, och kommer att möjliggöra effektiv knockdown i storskaliga skärmar. Detta protokoll använder en kommersiellt tillgänglig dsRNA utfodringbibliotek och beskriver alla steg som behövs för att duplicera biblioteket och utföra dsRNA skärmar. Protokollet kräver inte användning av någon avancerad utrustning, och kan därför utföras av alla C. elegans labb.

P0 knockdown fenotyper kommer att börja visas efter 2-3 dagars mata djuren dsRNA uttrycka bakterier. Några tidiga fenotyper omfattar larv gripande och dödlighet och bör observeras i 2-3% av alla utfodring brunnar. Samma fenotyper kommer också att observeras i F1 generationen djuren. Förekomsten av F1 ägg som inte kläcks är en annan vanlig F1-fenotyp, och tillsammans kommer dessa tre fenotyper observeras i nästan 10% av alla brunnar i F1-skärmar. Vi använde det protokoll som beskr...

Watch this Scientific Journal Video about Large-scale Gene Knockdown in C. elegans Using dsRNA Feeding Libraries to Generate Robust Loss-of-function Phenotypes at JoVE.com

Large-scale Gene Knockdown in C. elegans Using dsRNA Feeding Libraries to Generate Robust Loss-of-function Phenotypes

Medan dsRNA utfodring i C. elegans är ett kraftfullt verktyg för att bedöma geners funktion, löpande protokoll för storskaliga utfodring skärmar resultera i variabla knockdown effektivitet. Vi beskriver ett förbättrat protokoll för att utföra storskaliga RNAi utfodring skärmar som resulterar i mycket effektiv och reproducerbar knockdown av genuttryck.

Storskalig Gene Knockdown i<em&gt; C. elegans</em&gt; Med hjälp av dsRNA Feeding bibliotek för att generera Robust förlust-av-funktion Fenotyper

RNA interference by feeding worms bacteria expressing dsRNAs has been a useful tool to assess gene function in C. elegans. While this strategy works well ...

Research

JoVE Journal

Biology

Large-scale Gene Knockdown in C. elegans Using dsRNA Feeding Libraries to Generate Robust Loss-of-function Phenotypes

Large-Scale Screens of Metagenomic Libraries

Storskaliga skärmar Metagenomic bibliotek

Metagenomic libraries archive large fragments of contiguous genomic sequences from microorganisms without requiring prior cultivation.  Generating a ...

Generation of Stable Transgenic C. elegans Using Microinjection

Generering av Stabil Transgena C. elegans Använda mikroinjektion

Transgenic Caenorhabditis elegans can be readily created via microinjection of a DNA plasmid solution into the gonad 1.  The plasmid DNA rearranges to ...

Using an Automated Cell Counter to Simplify Gene Expression Studies: siRNA Knockdown of IL-4 Dependent Gene Expression in Namalwa Cells

Hjälp av ett automatiserat celltalsräknare att förenkla Studier Gene Expression: siRNA Knockdown av IL-4 beroende genuttryck i Namalwa Cells

The use of siRNA mediated gene knockdown is continuing to be an important tool in studies of gene expression.  siRNA studies are being conducted not only ...

Large Scale Zebrafish-Based In vivo Small Molecule Screen

Large Scale Zebrafish-Based In vivo Small Molecule Screen

Large Scale Zebrafish-Based In vivo Småmolekylära skärm

Given their small embryo size, rapid development, transparency, fecundity, and numerous molecular, morphological and physiological similarities to ...

RNAi Screening to Identify Postembryonic Phenotypes in C. elegans

RNAi Screening to Identify Postembryonic Phenotypes in C. elegans

RNAi screening identifiera Postembryonic fenotyper i C. elegans</em

C. elegans has proven to be a valuable model system for the discovery and functional characterization of many genes and gene pathways1. More sophisticated ...

Using SecM Arrest Sequence as a Tool to Isolate Ribosome Bound Polypeptides

Använda SecM Arrest sekvens som ett verktyg för Isolera ribosom Bundna Polypeptider

Extensive research has provided ample evidences suggesting that protein folding in the cell is a co-translational process1-5. However, the exact pathway ...

Using RNA-mediated Interference Feeding Strategy to Screen for Genes Involved in Body Size Regulation in the Nematode C. elegans

Using RNA-mediated Interference Feeding Strategy to Screen for Genes Involved in Body Size Regulation in the Nematode C. elegans

Använda RNA-medierad strategi Interference Matning att screena för gener involverade i kroppsstorlek förordningen i rundmasken<em&gt; C. elegans</em

Double-strand RNA-mediated interference (RNAi) is an effective strategy to knock down target gene expression1-3. It has been applied to many model systems ...

C. elegans Chemotaxis Assay

C. elegans Chemotaxis Assay

C. elegans kemotaxianalys

Many organisms use chemotaxis to seek out food sources, avoid noxious substances, and find mates.  Caenorhabditis elegans has impressive chemotaxis ...

Antibody Staining in C. Elegans Using &quot;Freeze-Cracking&quot;

Antibody Staining in C. Elegans Using "Freeze-Cracking"

Antikropp färgning i<em&gt; C. Elegans</em&gt; Använda &quot;Freeze-Cracking&quot;

To stain C.  elegans with antibodies, the relatively impermeable cuticle must be  bypassed by chemical or mechanical methods.  "Freeze-cracking" is one ...

Methods to Assess Subcellular Compartments of Muscle in C. elegans

Methods to Assess Subcellular Compartments of Muscle in C. elegans

Metoder för att bedöma Subcellulära Fack för Muscle in<em&gt; C. elegans</em

Muscle is a dynamic tissue that responds to changes in nutrition, exercise, and disease state. The loss of muscle mass and function with disease and age ...