Name: steady-state, pre-steady-state, and single-turnover kinetic measurement for dna glycosylase activity
Uploaded: 2013-08-19T12:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Steady-state, Pre-steady-state, and Single-turnover Kinetic Measurement for DNA Glycosylase Activity at JoVE.com

Vi takker Dr. Julie K. Horton for kritisk læsning af manuskriptet og Dr. Rajendra Prasad for nyttige forslag og diskussioner. Dele af denne forskning blev oprindeligt offentliggjort i The Journal of Biological Chemistry, Sassa A et. al., &quot;DNA-sekvens Context Virkninger på Glycosylasemedieret aktivitet for Human 8-Oxoguanine DNA-glycosylase.&quot; J Biol Chem. 287, 36.702-36.710 (2012) 2.. Dette arbejde blev støttet helt eller delvist af National Institutes of Health Research Project Grant Z01-ES050158 i Intramural Research Program, NIEHS.

1.. Fremstilling af enzym og DNA Substrat <ol><li> Overudtrykker OGG1 som et GST-fusionsprotein i E. coli udnytte GST-tag for rensning, og fjern derefter GST-tag ved spaltning med HRV-3C protease (figur 1) 6. </li><li> Købe kemisk syntetiseret 5&#39;-6-carboxyfluorescein (6-FAM) mærket oligonucleotid indeholdende en enkelt 8 oxoG rest og dens komplementære umærket oligonukleotidstreng. De 34-mer oligonucleotider indeholder en 8-oxoG ved position 17 fra 5&#39;-enden. Renses diss...

<ol>
	<li>Porello, S. L., Leyes, A. E., David, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-turnover+and+pre-steady-state+kinetics+of+the+reaction+of+the+adenine+glycosylase+MutY+with+mismatch-containing+DNA+substrates.">Single-turnover and pre-steady-state kinetics of the reaction of the adenine glycosylase MutY with mismatch-containing DNA substrates.</a> Biochemistry. 37, 14756-14764 (1998).</li><li>Sassa, A., Beard, W. A., Prasad, R., Wilson, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+sequence+context+effects+on+the+glycosylase+activity+of+human+8-oxoguanine+DNA+glycosylase.">DNA sequence context effects on the glycosylase activity of human 8-oxoguanine DNA glycosylase.</a> The Journal of Biological Chemistry. 287, 36702-36710 (2012).</li><li>Wong, I., Lundquist, A. J., Bernards, A. S., Mosbaugh, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Presteady-state+analysis+of+a+single+catalytic+turnover+by+Escherichia+coli+uracil-DNA+glycosylase+reveals+a+"pinch-pull-push"+mechanism.">Presteady-state analysis of a single catalytic turnover by Escherichia coli uracil-DNA glycosylase reveals a "pinch-pull-push" mechanism.</a> The Journal of Biological Chemistry. 277, 19424-19432 (1074).</li><li>Johnson, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+transient-state+kinetics.">Advances in transient-state kinetics.</a> Current Opinion in Biotechnology. 9, 87-89 (1998).</li><li>Johnson, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+kinetic+analysis+of+mechanochemical+adenosinetriphosphatases.">Rapid kinetic analysis of mechanochemical adenosinetriphosphatases.</a> Methods in Enzymology. 134, 677-705 (1986).</li><li>Kovtun, I. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=OGG1+initiates+age-dependent+CAG+trinucleotide+expansion+in+somatic+cells.">OGG1 initiates age-dependent CAG trinucleotide expansion in somatic cells.</a> Nature. 447, 447-452 (2007).</li><li>Hill, J. W., Hazra, T. K., Izumi, T., Mitra, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stimulation+of+human+8-oxoguanine-DNA+glycosylase+by+AP-endonuclease:+potential+coordination+of+the+initial+steps+in+base+excision+repair.">Stimulation of human 8-oxoguanine-DNA glycosylase by AP-endonuclease: potential coordination of the initial steps in base excision repair.</a> Nucleic Acids Research. 29, 430-438 (2001).</li><li>Zharkov, D. O., Rosenquist, T. A., Gerchman, S. E., Grollman, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Substrate+specificity+and+reaction+mechanism+of+murine+8-oxoguanine-DNA+glycosylase.">Substrate specificity and reaction mechanism of murine 8-oxoguanine-DNA glycosylase.</a> The Journal of Biological Chemistry. 275, 28607-28617 (2000).</li><li>Waters, T. R., Swann, P. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinetics+of+the+action+of+thymine+DNA+glycosylase.">Kinetics of the action of thymine DNA glycosylase.</a> The Journal of Biological Chemistry. 273, 20007-20014 (1998).</li><li>Nilsen, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Excision+of+deaminated+cytosine+from+the+vertebrate+genome:+role+of+the+SMUG1+uracil-DNA+glycosylase.">Excision of deaminated cytosine from the vertebrate genome: role of the SMUG1 uracil-DNA glycosylase.</a> The EMBO Journal. 20, 4278-4286 (2001).</li><li>Gill, S. C., von Hippel, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calculation+of+protein+extinction+coefficients+from+amino+acid+sequence+data.">Calculation of protein extinction coefficients from amino acid sequence data.</a> Analytical Biochemistry. 182, 319-326 (1989).</li><li>Van de Berg, ., Beard, B. J., A, W., Wilson, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+structure+and+aspartate+276+influence+nucleotide+binding+to+human+DNA+polymerase+beta.+Implication+for+the+identity+of+the+rate-limiting+conformational+change.">DNA structure and aspartate 276 influence nucleotide binding to human DNA polymerase beta. Implication for the identity of the rate-limiting conformational change.</a> The Journal of Biological Chemistry. 276, 3408-3416 (2001).</li><li>Krishnamurthy, N., Haraguchi, K., Greenberg, M. M., David, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+removal+of+formamidopyrimidines+by+8-oxoguanine+glycosylases.">Efficient removal of formamidopyrimidines by 8-oxoguanine glycosylases.</a> Biochemistry. 47, 1043-1050 (2008).</li><li>Leipold, M. D., Muller, J. G., Burrows, C. J., David, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Removal+of+hydantoin+products+of+8-oxoguanine+oxidation+by+the+Escherichia+coli+DNA+repair+enzyme,+FPG.">Removal of hydantoin products of 8-oxoguanine oxidation by the Escherichia coli DNA repair enzyme, FPG.</a> Biochemistry. 39, 14984-14992 (2000).</li><li>Zhao, X., Krishnamurthy, N., Burrows, C. J., David, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutation+versus+repair:+NEIL1+removal+of+hydantoin+lesions+in+single-stranded,+bulge,+bubble,+and+duplex+DNA+contexts.">Mutation versus repair: NEIL1 removal of hydantoin lesions in single-stranded, bulge, bubble, and duplex DNA contexts.</a> Biochemistry. 49, 1658-1666 (2010).</li><li>Leipold, M. D., Workman, H., Muller, J. G., Burrows, C. J., David, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recognition+and+removal+of+oxidized+guanines+in+duplex+DNA+by+the+base+excision+repair+enzymes+hOGG1,+yOGG1,+and+yOGG2.">Recognition and removal of oxidized guanines in duplex DNA by the base excision repair enzymes hOGG1, yOGG1, and yOGG2.</a> Biochemistry. 42, 11373-11381 (2003).</li><li>Robey-Bond, S. M., Barrantes-Reynolds, R., Bond, J. P., Wallace, S. S., Bandaru, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clostridium+acetobutylicum+8-oxoguanine+DNA+glycosylase+(Ogg)+differs+from+eukaryotic+Oggs+with+respect+to+opposite+base+discrimination.">Clostridium acetobutylicum 8-oxoguanine DNA glycosylase (Ogg) differs from eukaryotic Oggs with respect to opposite base discrimination.</a> Biochemistry. 47, 7626-7636 (2008).</li><li>Jarem, D. A., Wilson, N. R., Delaney, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure-dependent+DNA+damage+and+repair+in+a+trinucleotide+repeat+sequence.">Structure-dependent DNA damage and repair in a trinucleotide repeat sequence.</a> Biochemistry. 48, 6655-6663 (2009).</li><li>Livingston, A. L., Kundu, S., Henderson Pozzi, M., Anderson, W. D., David, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insight+into+the+roles+of+tyrosine+82+and+glycine+253+in+the+Escherichia+coli+adenine+glycosylase+MutY.">Insight into the roles of tyrosine 82 and glycine 253 in the Escherichia coli adenine glycosylase MutY.</a> Biochemistry. 44, 14179-14190 (2005).</li><li>Kundu, S., Brinkmeyer, M. K., Livingston, A. L., David, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adenine+removal+activity+and+bacterial+complementation+with+the+human+MutY+homologue+(MUTYH)+and+Y165C,+G382D,+P391L+and+Q324R+variants+associated+with+colorectal+cancer.">Adenine removal activity and bacterial complementation with the human MutY homologue (MUTYH) and Y165C, G382D, P391L and Q324R variants associated with colorectal cancer.</a> DNA Repair. 8, 1400-1410 (2009).</li><li>Zharkov, D. O., Rosenquist, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inactivation+of+mammalian+8-oxoguanine-DNA+glycosylase+by+cadmium(II):+implications+for+cadmium+genotoxicity.">Inactivation of mammalian 8-oxoguanine-DNA glycosylase by cadmium(II): implications for cadmium genotoxicity.</a> DNA Repair. 1, 661-670 (2002).</li><li>Jarem, D. A., Wilson, N. R., Schermerhorn, K. M., Delaney, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Incidence+and+persistence+of+8-oxo-7,8-dihydroguanine+within+a+hairpin+intermediate+exacerbates+a+toxic+oxidation+cycle+associated+with+trinucleotide+repeat+expansion.">Incidence and persistence of 8-oxo-7,8-dihydroguanine within a hairpin intermediate exacerbates a toxic oxidation cycle associated with trinucleotide repeat expansion.</a> DNA Repair. 10, 887-896 (2011).</li><li>Mokkapati, S. K., Wiederhold, L., Hazra, T. K., Mitra, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stimulation+of+DNA+glycosylase+activity+of+OGG1+by+NEIL1:+functional+collaboration+between+two+human+DNA+glycosylases.">Stimulation of DNA glycosylase activity of OGG1 by NEIL1: functional collaboration between two human DNA glycosylases.</a> Biochemistry. 43, 11596-11604 (2004).</li><li>Sidorenko, V. S., Nevinsky, G. A., Zharkov, D. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanism+of+interaction+between+human+8-oxoguanine-DNA+glycosylase+and+AP+endonuclease.">Mechanism of interaction between human 8-oxoguanine-DNA glycosylase and AP endonuclease.</a> DNA Repair. 6, 317-328 (2007).</li></ol>

De kinetiske fremgangsmåder beskrevet her skitsere metoder til at definere elementære kinetiske konstanter. Hvis et tidsforløb produkt dannelse er bifasisk med den første enzymatiske omsætning forekommer hurtigt, så et trin efter kemi er hastighedsbegrænsende under de efterfølgende katalytiske omsætning. I tilfælde af OGG1, kan den første omsætning, der måles ved hjælp af høje enzymkoncentrationer med enten begrænsning (S &lt;E) eller høj (S&gt; E) DNA-koncentrationer. I det første tilfælde er reaktio...

En aerob miljø iler genomisk ustabilitet. En stor promutagenic DNA læsion som følge af oxidativt stress er 7,8-dihydro-8-oxoguanine (8-oxoG). Dette skyldes den tvetydige kodning potentiale 8-oxoG. Humant 8-oxoguanine DNA glycosylase (OGG1) er ansvarlig for at iværksætte bunden excision reparation af 8-oxoG. Den glycosylase aktivitet OGG1 udskærer den 8-oxoG bund resulterer i produkt-DNA med et apurin stedet (AP-site). En svag lyaseaktivitet af OGG1 kan incise AP-stedet i nogle tilfælde. Kinetisk karakterisering af DNA glycosylaser generelt finder, at de udviser bifasisk tidsforløb. Efter en indledende hurtig fase af produktets dannelse (dvs. burst) er en lineær steady state fase observeret 1-3. Denne adfærd er tegn på et skridt efter kemi (dvs. konformationsændring eller produkt frigivelse) er hastighedsbegrænsende i den lineære del af tidsforløbet, hvorimod boretførste fase, der ofte omtales som den forbigående fase, svarer til produktdannelse på enzymet aktive sted under den første cyklus af reaktionen. Når produktet udgivelse er hastighedsbegrænsende under steady-state fase aktivitet målinger giver en kvalitativ måling af produktets DNA bindingsaffinitet, men giver ikke kinetisk oplysninger vedrørende begivenheder på enzymet aktive site (dvs. kemi). Derfor er metoder til at isolere og måle den eksponentielle præ-steady state burst fase er nødvendig for at undersøge begivenheder i den første enzymatiske omsætning på enzymets aktive site 4.. Der er tre standard kinetiske metoder til at karakterisere den katalytiske adfærd OGG1, (1) steady state (2) pre-steady-state, og (3) single-omsætning. Disse metoder adskiller sig fra hinanden ved koncentrationen af ​​enzymet i reaktionsblandingen, og enzymet og substrat anvendt i hver fremgangsmåde. I en typisk steady state fremgangsmåde,undertiden benævnt multiple omsætning kinetik, er lave koncentrationer af enzym, der anvendes til at følge produktet formation. Substratkoncentrationen langt overstiger enzymkoncentrationen således at multiple enzymatiske omsætning ikke væsentligt påvirker substratkoncentration. I denne situation bør tidsforløbet være lineær og det er ofte vanskeligt at skelne, om et udbrud fandt sted i første omsætning på grund af den lave enzymkoncentration anvendes i denne fremgangsmåde, bemærk at briste amplitude svarer til enzymkoncentration. Dette kan overvindes ved at anvende en højere enzymkoncentration og ekstrapolere den lineære tidsforløb til nul tid til at detektere, om den første enzymatiske omsætning forekom hurtigt. Skæringspunktet på ordinaten (y-aksen), bør være proportional med enzymets koncentration og tilvejebringer et mål for enzymet aktivt engageret med substrat. Selv om denne fremgangsmåde kan i princippet give bevis for eksistensen af ​​en burst fase en difderledes fremgangsmåde er påkrævet for at måle kinetikken af ​​burst fase. I mange tilfælde burst fase er for hurtig til at måle ved manuel blanding og standsning teknikker. I denne situation, nærmer præ-steady-state og enkelt omsætning kinetiske (dvs. forbigående kinetisk) kræver ofte en hurtig blanding og afkølende instrument til at følge tidlige tidspunkter af en reaktion 5.. I en præ-steady-state tilgang høje koncentrationer af enzym anvendes således, at en betydelig mængde af produktet dannes under den første omsætning. Da flere omsætninger følges at observere katalytisk cykling (dvs. den lineære fase, der følger burst), substratkoncentration er større end den enzymkoncentration ([enzym] &lt;[substrat]). At isolere begivenheder på det aktive site af enzymet uden katalysator cykling, er single-omsætning betingelser udnyttet. I dette tilfælde er substrat mættet med enzym (E &gt;&gt; S), således at alle underlaget vil deltage in det »indre omsætning« og vil typisk udvise en enkelt eksponentiel tidsforløb. Som bemærket ovenfor for enzymer, der udviser en burst fase produkt release (k off) ofte begrænser hastigheden af steady-state fase af tidsforløbet. Hastigheden af produktets frigivelse (v ss, koncentreret. / Tid) kan bestemmes ud fra hældningen af den lineære steady state fase. Den aktive enzym koncentration (E), der er nødvendig for at konvertere hastigheden af produktets frigivelse til en iboende hastighedskonstant hvor k off = v ss / [E]. Vigtigere er det, aktive enzymkoncentration er typisk lavere end den målte proteinkoncentration grund urenheder, inaktive enzym, enzym ikke-produktivt bundet til underlaget, og den anvendte metode til at bestemme proteinkoncentration. Den aktive enzym koncentration kan bestemmes ud fra burst amplitude, når produktet release er langsom. Således ekstrapolere en steady-state tidsforløb tiltiden nul giver et skøn over aktivt enzym nødvendige for at beregne koff (produkt frigivelse) fra den observerede steady-state hastighed. At måle kinetikken af ​​burst, en præ-steady-state tilgang er nødvendigt at følge produktet dannelse under den første omsætning, der finder sted før den lineære steady state fase. Burst kinetik følger dannelsen af ​​enzym-produkt mellemprodukt. Når reaktionen er initieret ved at blande enzym med substrat, mængden af ​​enzym-produkt stiger hurtigt indtil reaktionen når en steady state fase. Hvis katalyse er langt hurtigere end produkt udgivelse, amplituden af burst er lig med aktivt engageret enzym og den observerede eksponentielle tilgang til ligevægt (k obs) svarer til hastigheden af kemisk omdannelse af substrat til produkt, forudsat at den omvendte sats kemi er ubetydelig. I nogle tilfælde katalytisk cyklamre forstyrrer en pre-steady-state analyser, som når omfanget af satser for kemi og produkt udgivelse ikke er væsentligt anderledes. I dette tilfælde forhindrer anvendelse overskydende enzym i forhold til substrat katalytisk cykling og grænser substrat bundet med enzym til en enkelt omsætning. Følgelig kan den første kemiske reaktionstrin isoleres og nøjagtigt som den første ordens hastighedskonstant (k obs.). Denne hastighedskonstant bør svare til k obs. bestemt ud fra præ-steady-state ovenfor beskrevne fremgangsmåde. Her beskriver vi, hvordan disse kinetiske metoder kan anvendes til at analysere glycosylase aktivitet OGG1.

<table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>Reagent/Material</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>5'-6-FAM labeled oligonucleotides containing a single 8-oxoG</td>
 <td>Eurofins MWG Operon</td>
 <td></td>
 <td>5'-P32 radiolabeled oligonucleotides can be used as well. Polyacrylamide gel purification grade is recommended. </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Unlabeled oligonucleotides (complementary strand)</td>
 <td>Eurofins MWG Operon</td>
 <td></td>
 <td>Polyacrylamide gel purification grade is recommended. </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>1 ml BD Luer Lock disposable syringe</td>
 <td>BD Medical</td>
 <td>309628</td>
 <td>Lue Lock disposable syringe from other vendors can be used as well.</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>10 ml BD Luer Lock disposable syringe</td>
 <td>BE Medical</td>
 <td>309604</td>
 <td>Luer Lock disposable syringe from other vendors can be used as well.</td>
 </tr>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>Equipment</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Circulating water bath</td>
 <td>Any vender</td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>RQF-3 Rapid Quench-Flow Instrument</td>
 <td>KinTek Corporation</td>
 <td></td>
 <td>Rapid Quench-Flow Instrument from other vendors can be used as well.</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Typhoon Phosphorimager 8600</td>
 <td>GE Healthcare Life Sciences</td>
 <td></td>
 <td>Imager from other vendors can be used as well.</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>KaleidaGraph</td>
 <td>Synergy Software</td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 </tbody>
</table>

steady-state, pre-steady-state, and single-turnover kinetic measurement for dna glycosylase activity

Human 8-oxoguanine DNA-glycosylase (OGG1) udskærer den mutagene oxidativ DNA læsion 8-oxo-7 ,8-dihydroguanine (8-oxoG) fra DNA. Kinetisk karakterisering af OGG1 foretages for at måle satserne for 8-oxoG excision og produktudvikling udgivelse. Når OGG1 koncentrationen er lavere end substrat-DNA, tidsforløb for produktdannelse er bifasisk, en hurtig eksponentiel fase (dvs. burst) produkt dannelse efterfølges af en lineær steady state fase. Den initielle afgivelse af produkt dannelse svarer til koncentrationen af ​​enzymet i korrekt indgreb på substratet, og burst amplitude afhænger af koncentrationen af ​​enzym. Den første ordens hastighedskonstant for burst svarer til den spontane frekvens af 8-oxoG udskæring og den langsommere steady-state rate måler hastigheden af produktets frigivelse (produkt-DNA dissociationshastighed konstanten k slukket). Her beskriver vi steady-state, præ-steady-state, og single-omsætningen tilgange til at isolere og måle specific trin under OGG1 katalytiske cykling. En fluorescerende mærkede læsion-holdigt oligonukleotid og oprensede OGG1 anvendes til at fremme nøjagtige kinetiske målinger. Da lave enzymkoncentrationer bruges til at lave steady-state målinger, manuel blanding af reagenser og standsning af reaktionen kan udføres for at fastslå steady-state rate (koff). Derudover ekstrapolation af steady-state sats til et punkt på ordinaten på nul tid indikerer, at et udbrud af produktets dannelse opstod under den første omsætning (dvs. y-aksen er positiv). Den første ordens hastighedskonstant af den eksponentielle burst fase kan måles ved hjælp af en hurtig blanding og afkølende teknik, der undersøger den mængde produkt, der dannes med korte tidsintervaller (&lt;1 sek), inden steady state fase og svarer til den sats på 8 -oxoG excision (dvs. kemi). Den kemiske trin kan også måles ved hjælp af en enkelt-omsætning tilgang, hvor katalytisk cykling erforebygges ved at mætte substrat DNA med enzym (E&gt; S). Disse metoder kan måle elementære hastighedskonstanter, der påvirker effektiviteten af ​​fjernelsen af ​​en DNA-læsion.

Steady-state kinetiske analyse blev udført ved anvendelse af 200 nM DNA substrat og fire forskellige tilsyneladende koncentrationer af OGG1 (15, 30, 45, og 60 nM), som bestemt ved en Bradford proteinassay 2. Tidsforløbene af produktdannelse blev tilpasset til en lineær ligning til at bestemme y-aksen, som var 2,2, 11, 15, og 26 nM, i forhold til hvert protein fusion (figur 2B). Y-skæringspunkter blev yderligere plottet i forhold til hinanden faktiske proteinkoncentration (figur 2C...

Watch this Scientific Journal Video about Steady-state, Pre-steady-state, and Single-turnover Kinetic Measurement for DNA Glycosylase Activity at JoVE.com

Steady-state, Pre-steady-state, and Single-turnover Kinetic Measurement for DNA Glycosylase Activity

Steady-state, Pre-steady-state, og Single-omsætningen Kinetic måling for DNA glycosylase Activity

Tidsforløb for glycosylase aktivitet af 8-oxoguanine DNA-glycosylase er bifasisk udviser en byge af produktdannelse og en lineær steady state fase. Ved hjælp quench-flow teknikker burst og steady state satser kan måles, der svarer til excision 8-oxoguanine og frigivelse af glycosylase fra produktet DNA, hhv.

Human 8-oxoguanine DNA glycosylase (OGG1) excises the mutagenic oxidative DNA lesion 8-oxo-7,8-dihydroguanine (8-oxoG) from DNA. Kinetic characterization ...

Research

JoVE Journal

Chemistry

HPLC Measurement of the DNA Oxidation Biomarker, 8-oxo-7,8-dihydro-2&#8217;-deoxyguanosine, in Cultured Cells and Animal Tissues

HPLC Measurement of the DNA Oxidation Biomarker, 8-oxo-7,8-dihydro-2ÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã¢â€žÂ¢-deoxyguanosine, in Cultured Cells and Animal Tissues

HPLC Måling af DNA Oxidation Biomarkør, 8-oxo-7,8-dihydro-2&#39;-deoxyguanosin i dyrkede celler og animalsk væv

Oxidative stress is associated with many physiological and pathological processes, as well as xenobiotic metabolism, leading to the oxidation of ...

Preparation of Mica and Silicon Substrates for DNA Origami Analysis and Experimentation

Udarbejdelse af Mica og Silicon Substrater for DNA Origami Analyse og eksperimenter

The designed nature and controlled, one-pot synthesis of DNA origami provides exciting opportunities in many fields, particularly nanoelectronics. Many of ...

Ethylene Polymerizations Using Parallel Pressure Reactors and a Kinetic Analysis of Chain Transfer Polymerization

Ethylen Polymeriseringer Brug Parallel Pressure reaktorer og en Kinetic Analyse af Chain Transfer Polymerisation

We demonstrate a method for high-throughput catalyst screening using a parallel pressure reactor starting from the initial synthesis of a nickel ...

Fabrication and Testing of Photonic Thermometers

Fabrikation og afprøvning af fotoniske termometre

In recent years, a push for developing novel silicon photonic devices for telecommunications has generated a vast knowledge base that is now being ...

Simultaneous Measurement of HDAC1 and HDAC6 Activity in HeLa Cells Using UHPLC-MS

Samtidig måling af HDAC1 og HDAC6 aktivitet i HeLa celler ved hjælp af UHPLC-MS

The search for new histone deacetylase (HDAC) inhibitors is of increasing interest in drug discovery. Isoform selectivity has been in the spotlight since ...

Disentangling High Strength Copolymer Aramid Fibers to Enable the Determination of Their Mechanical Properties

Udrede højstyrke Copolymer Aramid fibre til bestemmelse af mekaniske egenskaber

Traditionally, soft body armor has been made from poly(p-phenylene terephthalamide) (PPTA) and ultra-high molecular weight polyethylene. However, to ...

Technical Aspect of the Automated Synthesis and Real-Time Kinetic Evaluation of [11C]SNAP-7941

Technical Aspect of the Automated Synthesis and Real-Time Kinetic Evaluation of [11C]SNAP-7941

Tekniske aspekt af automatiseret syntese og real-time Kinetic evaluering af [11C] SNAP-7941

Positron emission tomography (PET) is an essential molecular imaging technique providing insights into pathways and using specific targeted radioligands ...

NMR-Based Activity Assays for Determining Compound Inhibition, IC50 Values, Artifactual Activity, and Whole-Cell Activity of Nucleoside Ribohydrolases

NMR-Based Activity Assays for Determining Compound Inhibition, IC50 Values, Artifactual Activity, and Whole-Cell Activity of Nucleoside Ribohydrolases

NMR-baserede Aktivitetsassays til bestemmelse af sammensatte hæmning, IC50 -værdier, artifaktuel aktivitet og helcelle aktivitet af Nukleosid-Ribohydrolaser

NMR spectroscopy is often used for the identification and characterization of enzyme inhibitors in drug discovery, particularly in the context of fragment ...