Name: steady-state, pre-steady-state, and single-turnover kinetic measurement for dna glycosylase activity
Uploaded: 2013-08-19T12:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Steady-state, Pre-steady-state, and Single-turnover Kinetic Measurement for DNA Glycosylase Activity at JoVE.com

Vi takker Dr. Julie K. Horton for kritisk lesing av manuskriptet og Dr. Rajendra Prasad for nyttige innspill og diskusjoner. Deler av denne forskningen ble opprinnelig publisert i The Journal of Biological Chemistry, Sassa A et. al., &quot;DNA sekvens Kontekst Effekter på glykosylase aktivitet of Human 8-Oxoguanine DNA glykosylase.&quot; J Biol Chem. 287, 36702-36710 (2012) 2. Dette arbeidet ble støttet, helt eller delvis, ved National Institutes of Health Research Project Grant Z01-ES050158 i egenutført Research Program, NIEHS.

En. Fremstilling av enzym og DNA Substrat <ol><li> Over-express OGG1 som en GST-fusion protein i E. coli, utnytte GST-tag for rensing, og deretter fjerne GST-tag ved spalting med HRV-3C protease (figur 1) 6. </li><li> Kjøp den kjemisk syntetiserte 5&#39;-6-karboksyfluorescein (6-FAM) merket oligonukleotid som inneholder en enkelt 8-oxoG rest og dens komplementære tråd umerket oligonukleotid. Den 34-mer oligonukleotider som inneholder en 8-oxoG ved posisjon 17 fra 5&#39;-enden. R...

<ol>
	<li>Porello, S. L., Leyes, A. E., David, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-turnover+and+pre-steady-state+kinetics+of+the+reaction+of+the+adenine+glycosylase+MutY+with+mismatch-containing+DNA+substrates.">Single-turnover and pre-steady-state kinetics of the reaction of the adenine glycosylase MutY with mismatch-containing DNA substrates.</a> Biochemistry. 37, 14756-14764 (1998).</li><li>Sassa, A., Beard, W. A., Prasad, R., Wilson, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+sequence+context+effects+on+the+glycosylase+activity+of+human+8-oxoguanine+DNA+glycosylase.">DNA sequence context effects on the glycosylase activity of human 8-oxoguanine DNA glycosylase.</a> The Journal of Biological Chemistry. 287, 36702-36710 (2012).</li><li>Wong, I., Lundquist, A. J., Bernards, A. S., Mosbaugh, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Presteady-state+analysis+of+a+single+catalytic+turnover+by+Escherichia+coli+uracil-DNA+glycosylase+reveals+a+"pinch-pull-push"+mechanism.">Presteady-state analysis of a single catalytic turnover by Escherichia coli uracil-DNA glycosylase reveals a "pinch-pull-push" mechanism.</a> The Journal of Biological Chemistry. 277, 19424-19432 (1074).</li><li>Johnson, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+transient-state+kinetics.">Advances in transient-state kinetics.</a> Current Opinion in Biotechnology. 9, 87-89 (1998).</li><li>Johnson, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+kinetic+analysis+of+mechanochemical+adenosinetriphosphatases.">Rapid kinetic analysis of mechanochemical adenosinetriphosphatases.</a> Methods in Enzymology. 134, 677-705 (1986).</li><li>Kovtun, I. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=OGG1+initiates+age-dependent+CAG+trinucleotide+expansion+in+somatic+cells.">OGG1 initiates age-dependent CAG trinucleotide expansion in somatic cells.</a> Nature. 447, 447-452 (2007).</li><li>Hill, J. W., Hazra, T. K., Izumi, T., Mitra, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stimulation+of+human+8-oxoguanine-DNA+glycosylase+by+AP-endonuclease:+potential+coordination+of+the+initial+steps+in+base+excision+repair.">Stimulation of human 8-oxoguanine-DNA glycosylase by AP-endonuclease: potential coordination of the initial steps in base excision repair.</a> Nucleic Acids Research. 29, 430-438 (2001).</li><li>Zharkov, D. O., Rosenquist, T. A., Gerchman, S. E., Grollman, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Substrate+specificity+and+reaction+mechanism+of+murine+8-oxoguanine-DNA+glycosylase.">Substrate specificity and reaction mechanism of murine 8-oxoguanine-DNA glycosylase.</a> The Journal of Biological Chemistry. 275, 28607-28617 (2000).</li><li>Waters, T. R., Swann, P. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinetics+of+the+action+of+thymine+DNA+glycosylase.">Kinetics of the action of thymine DNA glycosylase.</a> The Journal of Biological Chemistry. 273, 20007-20014 (1998).</li><li>Nilsen, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Excision+of+deaminated+cytosine+from+the+vertebrate+genome:+role+of+the+SMUG1+uracil-DNA+glycosylase.">Excision of deaminated cytosine from the vertebrate genome: role of the SMUG1 uracil-DNA glycosylase.</a> The EMBO Journal. 20, 4278-4286 (2001).</li><li>Gill, S. C., von Hippel, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calculation+of+protein+extinction+coefficients+from+amino+acid+sequence+data.">Calculation of protein extinction coefficients from amino acid sequence data.</a> Analytical Biochemistry. 182, 319-326 (1989).</li><li>Van de Berg, ., Beard, B. J., A, W., Wilson, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+structure+and+aspartate+276+influence+nucleotide+binding+to+human+DNA+polymerase+beta.+Implication+for+the+identity+of+the+rate-limiting+conformational+change.">DNA structure and aspartate 276 influence nucleotide binding to human DNA polymerase beta. Implication for the identity of the rate-limiting conformational change.</a> The Journal of Biological Chemistry. 276, 3408-3416 (2001).</li><li>Krishnamurthy, N., Haraguchi, K., Greenberg, M. M., David, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+removal+of+formamidopyrimidines+by+8-oxoguanine+glycosylases.">Efficient removal of formamidopyrimidines by 8-oxoguanine glycosylases.</a> Biochemistry. 47, 1043-1050 (2008).</li><li>Leipold, M. D., Muller, J. G., Burrows, C. J., David, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Removal+of+hydantoin+products+of+8-oxoguanine+oxidation+by+the+Escherichia+coli+DNA+repair+enzyme,+FPG.">Removal of hydantoin products of 8-oxoguanine oxidation by the Escherichia coli DNA repair enzyme, FPG.</a> Biochemistry. 39, 14984-14992 (2000).</li><li>Zhao, X., Krishnamurthy, N., Burrows, C. J., David, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutation+versus+repair:+NEIL1+removal+of+hydantoin+lesions+in+single-stranded,+bulge,+bubble,+and+duplex+DNA+contexts.">Mutation versus repair: NEIL1 removal of hydantoin lesions in single-stranded, bulge, bubble, and duplex DNA contexts.</a> Biochemistry. 49, 1658-1666 (2010).</li><li>Leipold, M. D., Workman, H., Muller, J. G., Burrows, C. J., David, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recognition+and+removal+of+oxidized+guanines+in+duplex+DNA+by+the+base+excision+repair+enzymes+hOGG1,+yOGG1,+and+yOGG2.">Recognition and removal of oxidized guanines in duplex DNA by the base excision repair enzymes hOGG1, yOGG1, and yOGG2.</a> Biochemistry. 42, 11373-11381 (2003).</li><li>Robey-Bond, S. M., Barrantes-Reynolds, R., Bond, J. P., Wallace, S. S., Bandaru, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clostridium+acetobutylicum+8-oxoguanine+DNA+glycosylase+(Ogg)+differs+from+eukaryotic+Oggs+with+respect+to+opposite+base+discrimination.">Clostridium acetobutylicum 8-oxoguanine DNA glycosylase (Ogg) differs from eukaryotic Oggs with respect to opposite base discrimination.</a> Biochemistry. 47, 7626-7636 (2008).</li><li>Jarem, D. A., Wilson, N. R., Delaney, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure-dependent+DNA+damage+and+repair+in+a+trinucleotide+repeat+sequence.">Structure-dependent DNA damage and repair in a trinucleotide repeat sequence.</a> Biochemistry. 48, 6655-6663 (2009).</li><li>Livingston, A. L., Kundu, S., Henderson Pozzi, M., Anderson, W. D., David, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insight+into+the+roles+of+tyrosine+82+and+glycine+253+in+the+Escherichia+coli+adenine+glycosylase+MutY.">Insight into the roles of tyrosine 82 and glycine 253 in the Escherichia coli adenine glycosylase MutY.</a> Biochemistry. 44, 14179-14190 (2005).</li><li>Kundu, S., Brinkmeyer, M. K., Livingston, A. L., David, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adenine+removal+activity+and+bacterial+complementation+with+the+human+MutY+homologue+(MUTYH)+and+Y165C,+G382D,+P391L+and+Q324R+variants+associated+with+colorectal+cancer.">Adenine removal activity and bacterial complementation with the human MutY homologue (MUTYH) and Y165C, G382D, P391L and Q324R variants associated with colorectal cancer.</a> DNA Repair. 8, 1400-1410 (2009).</li><li>Zharkov, D. O., Rosenquist, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inactivation+of+mammalian+8-oxoguanine-DNA+glycosylase+by+cadmium(II):+implications+for+cadmium+genotoxicity.">Inactivation of mammalian 8-oxoguanine-DNA glycosylase by cadmium(II): implications for cadmium genotoxicity.</a> DNA Repair. 1, 661-670 (2002).</li><li>Jarem, D. A., Wilson, N. R., Schermerhorn, K. M., Delaney, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Incidence+and+persistence+of+8-oxo-7,8-dihydroguanine+within+a+hairpin+intermediate+exacerbates+a+toxic+oxidation+cycle+associated+with+trinucleotide+repeat+expansion.">Incidence and persistence of 8-oxo-7,8-dihydroguanine within a hairpin intermediate exacerbates a toxic oxidation cycle associated with trinucleotide repeat expansion.</a> DNA Repair. 10, 887-896 (2011).</li><li>Mokkapati, S. K., Wiederhold, L., Hazra, T. K., Mitra, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stimulation+of+DNA+glycosylase+activity+of+OGG1+by+NEIL1:+functional+collaboration+between+two+human+DNA+glycosylases.">Stimulation of DNA glycosylase activity of OGG1 by NEIL1: functional collaboration between two human DNA glycosylases.</a> Biochemistry. 43, 11596-11604 (2004).</li><li>Sidorenko, V. S., Nevinsky, G. A., Zharkov, D. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanism+of+interaction+between+human+8-oxoguanine-DNA+glycosylase+and+AP+endonuclease.">Mechanism of interaction between human 8-oxoguanine-DNA glycosylase and AP endonuclease.</a> DNA Repair. 6, 317-328 (2007).</li></ol>

Den kinetiske metoder beskrevet her skissere metoder for å definere elementære kinetiske konstanter. Hvis en gang løpet av produkt formasjonen er bifasisk med den første enzymatisk omsetningen skjer raskt, og deretter et skritt etter kjemi er hastighetsbegrensende under påfølgende katalytiske turnovers. I tilfelle av OGG1, kan den første omsetning måles ved hjelp av høye konsentrasjoner av enzymet med enten begrensende (S &lt;E) eller høy (S&gt; E) DNA-konsentrasjoner. I det første tilfellet, blir reaksjonen ...

En aerobic miljø iler genomisk ustabilitet. En stor promutagenic DNA lesjon resulterende fra oksidativt stress er 7,8-dihydro-8-oxoguanine (8-oxoG). Dette skyldes det tvetydige kodende potensiale av 8-oxoG. Menneskelig 8-oxoguanine DNA glykosylase (OGG1) er ansvarlig for å initiere basen excision reparasjon av 8-oxoG. Den glykosylase aktivitet OGG1 excises 8-oxoG basen resulterer i produkt DNA med en apurinic hotellet (AP-site). En svak lyase aktivitet OGG1 kan incise AP-området i enkelte tilfeller. Kinetisk karakterisering av DNA glycosylases finner generelt at de viser bifasisk tid kurs. Etter en innledende rask fase av produktdannelse (dvs. burst), er en lineær steady-state fase observert 1-3. Denne atferden er et tegn på et trinn å følge kjemi (dvs. konformasjonsendringen eller produkt release) blir hastighetsbegrensende under den lineære delen av tiden selvfølgelig, mens burst fase, ofte referert til som den transiente fase, tilsvarer produkt-dannelse ved enzymet aktive setet under den første syklus av reaksjonen. Når produktet lanseres er hastighetsbegrensende under steady-state fasen, aktivitetsmålinger gi et kvalitativt mål på produktet DNA bindende affinitet, men gir ikke kinetisk informasjon om hendelser på enzymet aktive området (dvs. kjemi). Følgelig er metoder for å isolere og måle den eksponentielle pre-steady-state burst fase for å undersøke hendelser i løpet av første enzymatisk omsetning på enzymets aktive sete fire. Det er tre standard kinetiske metoder for å karakterisere den katalytiske oppførselen til OGG1, (1) steady-state, (2) pre-steady-state, og (3) single-omsetning. Disse tilnærmingene skiller seg fra hverandre ved at konsentrasjonen av enzymet i reaksjonsblandingen, og enzymet til substrat-forhold benyttes i hver fremgangsmåte. I en typisk steady-state tilnærming,noen ganger referert til som flere omsetning kinetikk, er lave konsentrasjoner av enzym som brukes for å følge produktdannelse. Underlaget konsentrasjonen overstiger sterkt enzymkonsentrasjon slik at flere enzymatiske turnovers ikke påvirke substrat konsentrasjon. I denne situasjonen bør tid kurs være lineær, og det er ofte vanskelig å skjelne om et utbrudd forekom under den første omsetningen på grunn av den lave enzymkonsentrasjon som brukes i denne fremgangsmåten, merk at briste amplitude tilsvarer den enzymkonsentrasjon. Dette kan overvinnes ved bruk av en høyere enzym-konsentrasjon og ekstrapolere det lineære tidsforløpet til null tid til å detektere hvorvidt den første enzymatiske omsetningen skjedde raskt. Den skjæringspunkt på ordinaten (y-akse) bør være proporsjonal med den enzymkonsentrasjon og er et mål på det enzym aktivt engasjert med substratet. Selv om denne tilnærmingen kan i prinsippet gi bevis for eksistensen av en burst fase, en forskjellige tilnærming er nødvendig for å måle kinetikkene burst fase. I mange tilfeller burst fasen er for rask til å måle ved manuell miksing og slukker teknikker. I denne situasjonen, nærmer pre-steady-state og single-omsetning kinetisk (dvs. forbigående kinetisk) krever ofte en rask blanding og herding instrument for å følge tidlige tidspunkter av en reaksjon fem. En på forhånd steady-state tilnærming høye konsentrasjoner av enzymet blir brukt, slik at en betydelig mengde av produktet er dannet under den første omsetning. Siden flere turnovers er fulgt for å observere katalytisk sykling (dvs. lineær fase som følger burst), er substratkonsentrasjon større enn enzymet konsentrasjon ([enzym] &lt;[substrat]). Å isolere hendelser på det aktive området av enzymet uten katalytisk sykling, er single-omsetning forholdene utnyttet. I dette tilfellet blir substratet mettet med enzym (E &gt;&gt; S), slik at alt av substratet vil delta in &#39;enkelt omsetning&#39; og vil typisk utvise en enkelt-eksponensiell tidsforløp. Som nevnt ovenfor for enzymer som viser en burst fase, produkt utgivelse (k off) begrenser ofte frekvensen av steady-state fasen av tiden kurset. Frekvensen av produkt utgivelse (v ss, kons. / Time) kan bestemmes fra skråningen av den lineære steady-state fasen. Det aktive enzym-konsentrasjon (E) er nødvendig for å omdanne frekvensen av produktet frigjøring til en iboende hastighetskonstanten hvor koff = v ss / [E]. Viktig er det at aktiv enzymkonsentrasjon vanligvis lavere enn den målte proteinkonsentrasjon på grunn av urenheter, inaktive enzymet, enzym ikke-produktivt bundet til substratet, og fremgangsmåten anvendt for å bestemme proteinkonsentrasjonen. Den aktive enzymkonsentrasjon kan bestemmes fra burst amplitude når produktet utgivelsen er treg. Dermed ekstrapolere en steady-state tidsforløpet tilnull tid gir et anslag på aktivt enzym som trengs for å beregne k off (produkt release) fra den observerte steady-state rate. For å måle kinetikkene til svermen, er en pre-steady-state tilnærming nødvendig å følge produktdannelse under den første omsetning som inntreffer før den lineære steady-state fase. De burst kinetikk følger dannelsen av enzymet-produkt mellomfag. Når reaksjonen blir initiert ved å blande enzymet med substratet, øker mengden av det enzym-produktet hurtig inntil reaksjonen har nådd en stabil tilstand fase. Ved katalyse er langt hurtigere enn produkt frigjøring, er amplituden av burst lik aktivt enzym og den observerte eksponensiell tilnærming til likevekt (kobs) tilsvarer frekvensen av kjemisk omdannelse av substrat til produkt, forutsatt at den omvendte hastighet på kjemi er ubetydelig. I noen tilfeller katalytisk cyklamre forstyrrer en pre-steady-state analyse, for eksempel når de størrelsene på prisene for kjemi og produkt utgivelse er ikke signifikant forskjellig. I dette tilfellet anvendelse av overskytende enzym i forhold til substratet forhindrer katalytisk sykling og grenser substrat bundet med enzymet til en enkelt omsetning. Følgelig kan det første trinn av kjemisk reaksjon isoleres og bestemmes nøyaktig som den første-ordens hastighetskonstant (kobs). Denne hastighetskonstanten bør være lik kobs bestemt fra den før-steady-state av fremgangsmåten som angitt ovenfor. Her beskriver hvordan disse kinetiske metoder kan brukes for å analysere aktiviteten av OGG1 glycosylase.

<table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>Reagent/Material</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>5'-6-FAM labeled oligonucleotides containing a single 8-oxoG</td>
 <td>Eurofins MWG Operon</td>
 <td></td>
 <td>5'-P32 radiolabeled oligonucleotides can be used as well. Polyacrylamide gel purification grade is recommended. </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Unlabeled oligonucleotides (complementary strand)</td>
 <td>Eurofins MWG Operon</td>
 <td></td>
 <td>Polyacrylamide gel purification grade is recommended. </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>1 ml BD Luer Lock disposable syringe</td>
 <td>BD Medical</td>
 <td>309628</td>
 <td>Lue Lock disposable syringe from other vendors can be used as well.</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>10 ml BD Luer Lock disposable syringe</td>
 <td>BE Medical</td>
 <td>309604</td>
 <td>Luer Lock disposable syringe from other vendors can be used as well.</td>
 </tr>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>Equipment</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Circulating water bath</td>
 <td>Any vender</td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>RQF-3 Rapid Quench-Flow Instrument</td>
 <td>KinTek Corporation</td>
 <td></td>
 <td>Rapid Quench-Flow Instrument from other vendors can be used as well.</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Typhoon Phosphorimager 8600</td>
 <td>GE Healthcare Life Sciences</td>
 <td></td>
 <td>Imager from other vendors can be used as well.</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>KaleidaGraph</td>
 <td>Synergy Software</td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 </tbody>
</table>

steady-state, pre-steady-state, and single-turnover kinetic measurement for dna glycosylase activity

Humant 8-oxoguanine DNA-glykosylase (OGG1) excises den mutagene oksydativ DNA lesjon 8-okso-7 ,8-dihydroguanine (8-oxoG) fra DNA. Kinetisk karakterisering av OGG1 gjennomføres for å måle utbredelsen av 8-oxoG excision og produktet lanseres. Når OGG1 konsentrasjonen er lavere enn substrat DNA, tid kurs for produktdannelse er bifasisk, en hurtig eksponensiell fase (dvs. burst) av produktdannelse er etterfulgt av en lineær steady-state fase. Den første serie av produktdannelse tilsvarer konsentrasjonen av enzymet riktig festet på substratet, og den burst amplitude er avhengig av konsentrasjonen av enzymet. Den første orden hastighetskonstant av burst tilsvarer den iboende sats på 8-oxoG excision og tregere steady-state sats måler frekvensen av produktet lanseres (produkt DNA dissosiasjon hastighet konstant, k off). Her beskriver vi steady-state, pre-steady-state, og single-omsetningen tilnærminger for å isolere og måle specific trinn under OGG1 katalytisk sykling. En fluorescens-merkede lesjon-inneholdende oligonukleotid og renset OGG1 er brukt for å lette nøyaktige kinetiske målinger. Siden lave konsentrasjoner enzym blir brukt for å lage steady-state målinger, ved manuell blanding av reagenser og av reaksjonen kan bli utført for å fastslå den steady-state-verdien (koff). I tillegg indikerer ekstrapolering av steady-state sats til et punkt på ordinaten på null tid at et utbrudd av produktet dannelsen skjedde under den første omsetningen (dvs. y-aksen er positiv). Den første-ordens hastighetskonstant for den eksponentielle burst fase kan måles ved hjelp av et hurtig omrøring og avkjøling teknikk som undersøker mengden av produkt dannet ved korte tidsintervaller (&lt;1 sekund) før steady-state fase og svarer til frekvensen av 8 -oxoG excision (dvs. kjemi). Det kjemiske trinn kan også måles ved hjelp av en enkelt-omsetning tilnærming hvor katalytisk sykling erforebygges ved metting av substratet med enzymet DNA (E&gt; S). Disse tilnærmingene kan måle elementære hastighetskonstanter som påvirker effektiviteten av fjerning av en DNA-lesjon.

Steady-state kinetisk analyse ble utført ved å bruke 200 nM DNA-substrat og fire forskjellige konsentrasjoner av åpenbare OGG1 (15, 30, 45, og 60 nM) som bestemt ved en Bradford protein assay to. Tiden kurs av produktdannelse var passe til en lineær ligning for å bestemme med y-aksen, som var 2,2, 11, 15, og 26 nM, i forhold til hvert protein konsentrasjon (figur 2B). Y-avskjærer ble ytterligere plottet i forhold til hverandre faktiske proteinkonsentrasjon (figur 2C). F...

Watch this Scientific Journal Video about Steady-state, Pre-steady-state, and Single-turnover Kinetic Measurement for DNA Glycosylase Activity at JoVE.com

Steady-state, Pre-steady-state, and Single-turnover Kinetic Measurement for DNA Glycosylase Activity

Steady-state, Pre-steady-state, og Single-omsetningen Kinetic måling for DNA glykosylase aktivitet

Tid kurs for glykosylase aktiviteten til 8-oxoguanine DNA glykosylase er bifasisk stille et utbrudd av produktet dannelse og en lineær steady-state fasen. Utnytte slukke-flow teknikker, burst og steady-state priser kan måles, som tilsvarer eksisjon av 8-oxoguanine og utgivelsen av glykosylase fra produktet DNA, hhv.

Human 8-oxoguanine DNA glycosylase (OGG1) excises the mutagenic oxidative DNA lesion 8-oxo-7,8-dihydroguanine (8-oxoG) from DNA. Kinetic characterization ...

Research

JoVE Journal

Chemistry

HPLC Measurement of the DNA Oxidation Biomarker, 8-oxo-7,8-dihydro-2&#8217;-deoxyguanosine, in Cultured Cells and Animal Tissues

HPLC Measurement of the DNA Oxidation Biomarker, 8-oxo-7,8-dihydro-2ÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã¢â€žÂ¢-deoxyguanosine, in Cultured Cells and Animal Tissues

HPLC Måling av DNA Oksidasjon Biomarker, 8-okso-7,8-dihydro-2&#39;-deoksyguanosin, i dyrkede celler og dyrevev

Oxidative stress is associated with many physiological and pathological processes, as well as xenobiotic metabolism, leading to the oxidation of ...

Preparation of Mica and Silicon Substrates for DNA Origami Analysis and Experimentation

Utarbeidelse av Mica og Silicon Underlag for DNA Origami analyse og eksperimentering

The designed nature and controlled, one-pot synthesis of DNA origami provides exciting opportunities in many fields, particularly nanoelectronics. Many of ...

Ethylene Polymerizations Using Parallel Pressure Reactors and a Kinetic Analysis of Chain Transfer Polymerization

Etylen Polymerisasjoner parallellTrykk reaktorer og et Kinetic Analysis of Chain Transfer Polymerisering

We demonstrate a method for high-throughput catalyst screening using a parallel pressure reactor starting from the initial synthesis of a nickel ...

Fabrication and Testing of Photonic Thermometers

Fabrikasjon og Testing av fotoniske termometre

In recent years, a push for developing novel silicon photonic devices for telecommunications has generated a vast knowledge base that is now being ...

Simultaneous Measurement of HDAC1 and HDAC6 Activity in HeLa Cells Using UHPLC-MS

Samtidig måling av HDAC1 og HDAC6 aktivitet i HeLa celler ved hjelp av UHPLC-MS

The search for new histone deacetylase (HDAC) inhibitors is of increasing interest in drug discovery. Isoform selectivity has been in the spotlight since ...

Disentangling High Strength Copolymer Aramid Fibers to Enable the Determination of Their Mechanical Properties

Disentangling høy styrke Copolymer Aramid fibre å aktivere fastsettelse av sine mekaniske egenskaper

Traditionally, soft body armor has been made from poly(p-phenylene terephthalamide) (PPTA) and ultra-high molecular weight polyethylene. However, to ...

Technical Aspect of the Automated Synthesis and Real-Time Kinetic Evaluation of [11C]SNAP-7941

Technical Aspect of the Automated Synthesis and Real-Time Kinetic Evaluation of [11C]SNAP-7941

Teknisk aspekt av automatisert syntese og Real-Time Kinetic evaluering av [11C] SNAP-7941

Positron emission tomography (PET) is an essential molecular imaging technique providing insights into pathways and using specific targeted radioligands ...

NMR-Based Activity Assays for Determining Compound Inhibition, IC50 Values, Artifactual Activity, and Whole-Cell Activity of Nucleoside Ribohydrolases

NMR-Based Activity Assays for Determining Compound Inhibition, IC50 Values, Artifactual Activity, and Whole-Cell Activity of Nucleoside Ribohydrolases

NMR-baserte aktivitet analyser for å bestemme sammensatte hemming, IC50 verdier, Artifactual aktivitet, og hele cellen aktivitet av nukleosid Ribohydrolases

NMR spectroscopy is often used for the identification and characterization of enzyme inhibitors in drug discovery, particularly in the context of fragment ...