Name: micron-scale resolution optical tomography of entire mouse brains with confocal light sheet microscopy
Uploaded: 2013-10-08T19:30:00
Duration: 9 min 49 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Micron-scale Resolution Optical Tomography of Entire Mouse Brains with Confocal Light Sheet Microscopy at JoVE.com

Den forskning, der fører til disse resultater, har modtaget støtte fra Den Europæiske Union syvende rammeprogram (FP7/2007-2013) under aftaler om tilskud n. 228.334 og 241.526. Dette forskningsprojekt er også blevet støttet af Human Frontier Science Program forskningsbevilling (RGP0027/2009) og af det italienske ministerium for uddannelse, universiteter og forskning inden for rammerne af flagskibsprojekt Nanomax og italienske sundhedsministerium inden for rammerne af den &quot;Stamceller Indkaldelse af forslag.&quot; Denne forskning er blevet udført i forbindelse med de forskningsaktiviteter ICON fundament støttet af &quot;Ente Cassa di Risparmio di Firenze.&quot;

1.. Tissue Forberedelse og opbevaring <ol><li> Lave musehjerne gennem standard transcardial perfusion 13 med 20 ml 0,01 M phosphatbufret saltvand (PBS) efterfulgt af 100 ml paraformaldehyd 4% i 0,01 M PBS. Justér forsigtigt pH begge opløsninger til 7,6: lidt lavere værdier af pH kan slukke fluorescens EGFP. </li><li> Post-fix det udskårne hjerner natten over i paraformaldehyd 4% ved 4 ° C. </li><li> Skyl to gange (30 min hver) i 0,01 M PBS og butik i 0,01 M PBS ved 4 ° C. </li></ol> 2. Dehydrering og Clearing Bemærk: protokollen for dehydrering og rydde følger nøje beskrevet af Becker et al 10. <ol><li> For at fjerne peroxider fra dehydrering opløsningsmiddel (tetrahydrofuran, THF), som i høj grad af dæmpning XFP fluorescens, filter THF med grundlæggende aktiveret aluminiumoxid (aktivitet klasse Brockman I omkring 250 g / L THF) under anvendelse af en chromaTO kolonne. Undgå revner i den kolonne, som ville reducere peroxid fjernelse. </li><li> Tilføj stabilisator (butyleret hydroxytoluen, 250 mg / L) til den endelige opløsning, selvom THF allerede var stabiliseret før filtrering. Stabilizer er faktisk tilbageholdes af aluminiumoxid: THF uden stabilisator kan udvikle store mængder af peroxider og kan være eksplosive og farlige. </li><li> Dehydrere hele musehjerne i en gradueret serie af THF i rent vand: 50%, 70%, 80%, 90%, 96%, 100%, 1 time hver, derefter 100% natten over. Placer hætteglasset med prøven på en roterende hjul. For at undgå udsættelse for lys, pak hætteglas med aluminiumsfolie. </li><li> Foretage clearing opløsningsmiddel (dibenzylether, DBE) med aluminiumoxid (aktiveret grundlæggende, aktivitet klasse Brockman I omkring 250 g / L af DBE) under anvendelse af en filtertragt. </li><li> Fjern prøven i 100% DBE. Skift opløsningen efter 3 og 6 timer. </li></ol> 3. Specimen Montering <ol><li> Når hjernen ser gennemsigtige ved øjet (typisktisk 1 time efter den anden DBE ændring), montere den på tippet imaging plade på en af ​​følgende måder: </li><li><ol><li> Direkte montering - forsigtigt kaste prøven på en af spidserne (figur 3a). </li><li> Agarose skive - Plunge en skive lavet af 6% agarose gel på spidserne. Forsigtigt løse prøven på agarose disken med akryl lim (figur 3b). Vent ca 1 min til hærdning. </li><li> Agarose bæger - Plunge et bæger lavet af 3% agarose gel på spidserne. Anbring forsigtigt prøven på bunden af bægerglasset (figur 3c). </li></ol></li></ol> Note 1: Montering i agarose bæger bør foretrækkes, når det er vigtigt billedbehandling prøven i sin helhed, men agarosegelen omkring prøven giver anledning til yderligere lysspredning, som kunne være til skade for billedkvaliteten. Hvis en lille del af prøven kan udelukkes fra billedbehandling, er det bedre at montere specImen på agarose disk eller direkte på spidsen. Den førstnævnte metode er bedst egnet til at holde hjernen vandrette (udelukkelse fra billeddannelse en ventrale eller dorsale del af hjernen), sidstnævnte for at holde hjernen lodret (bortset fra billeddannelse en del af olfaktoriske pærer eller rygmarven). Note 2: agarosegelen bør forberedes i vand, derefter dehydreret med THF (50% og 100% 4 timer hver) og ryddet i DBE 100% i 4 timer, eller indtil det ser klart gennemsigtig. <ol start="3"><li> Efter montering af prøven efter en af ​​de tidligere metoder, placere imaging plade inde i prøven kammer med en pincet. Fyld kammeret med clearing løsning. </li></ol> 4.. Tomografi Forberedelse <ol><li> Fjern slidsen at indsamle så meget fluorescens som muligt. </li><li> Oplys prøven med lav laser magt for at forhindre fotoblegning. </li><li> Flyt prøven i de tre retninger ved hjælp af softwaren drevet micropositioning system. Identificer for hver retning de minimale og maksimale koordinater, hvor prøven belyses og er inden for synsfeltet af kameraet (figur 4a). </li><li> Indsæt ovenstående koordinater som parametre for »Pre-tomografi &#39;underprogram. Angiv også afstanden mellem hosliggende stabler, der skal anvendes i tomografi, og præ-tomografi trin stikprøver i z-retningen. </li><li> Start pre-tomografi, der samler billederne i hver stak med z prøveudtagning angivet ved (4.4). </li></ol> Bemærk: De indsamlede billeder bruges af en software til at forberede et groft kort over prøven form og placering (4b figur), som gør det muligt at begrænse tomografi købet kun til den mængde faktisk besat af prøven, hvilket reducerer billedbehandling tid, og dermed fotoblegning. 5.. Tomografi Acquisition <ol><li> Flyt prøven uden lyspladen vha. micropositioning systemet. </li><li> Increase lasereffekt og stoppe bevægelsen af ​​alle systemer til scanning med henblik på at belyse kun en fast linje i midten af ​​synsfeltet. </li><li> Monter spalte og tilpasse den ved hjælp autofluorescensværdi signal fra clearing løsning. Du bør tydeligt se spalten linje i midten af ​​synsfeltet. </li><li> Genaktivere scanning system, reducere laser magt og flytte prøven inde lyset ark vha. micropositioning system. Bemærk at laser strøm, der bruges med spalten vil være højere end den, der anvendes, uden at det, idet de rumlige filter blokerer en ikke ubetydelig del af lys. </li><li> Juster amplitude og offset af scanning og de-systemer til scanning med kontrol software, indtil billederne ser klare og lyse. </li><li> Kør tomografi erhvervelse software, efter indstilling af passende z skridt til eksperimentet. Lydstyrken vil blive afbildet i mange parallelle, delvist overlappende stakke (figur 5A), og billederne vil blive gemt ien hierarkisk mappestruktur. </li></ol> 6.. Syning og Visualisering <ol><li> Gennemfør erhvervede volumen med syntetiske sorte billeder (dvs. billeder af samme type og dimensioner af de indsamlede dem-, men med nul intensitet) ved hjælp af en automatiseret software (figur 4c). Dette trin er obligatorisk for at sømmen software til at beskæftige sig med en komplet rumfang. </li><li> Launch Vaa3D software (frit downloades fra <a href="http://www.vaa3d.org/" target="_blank">http://www.vaa3d.org/</a> ) med plugins TeraStitcher og TeraManager installeret. </li><li> Indlæse TeraStitcher plugin. Vælg den mappe, der indeholder den filmede volumen, angiver de relative orienteringer af akserne (med hensyn til en reference højrehåndet koordinatsystem) og voxel størrelse. </li><li> Lancere den første del af sømmen. Softwaren vil beregne den relative forskydning mellem par af stakke, og finde en samlet optimal placement for alle stablerne sammen (figur 5b). </li><li> Vælg for at gemme den syet volumen i single-opløsning eller i multi-opløsning format. Sidstnævnte giver mulighed for multi-opløsning visualisering med TeraManager plugin. I begge tilfælde, hvis den højere opløsning billede er større end et par gigabytes, også vælge multi-stack spare modalitet og angive størrelsen af ​​de enkelte substacks. Dette vil gøre det muligt for en effektiv adgang til de lagrede data. </li><li> Start den anden del af sømmen. Softwaren vil fusionere de justerede stakke, og gemme dem i enten single-eller multi-stak mode (figur 5c og 5d). Ved afslutningen lukke TeraStitcher plugin. </li><li> Indlæse TeraManager plugin. Vælg mappen med den multi-stablet multi-opløsning volumen, og angive voxelstørrelse og økser orienteringer. Lydstyrken vil blive indlæst på minimum opløsning. </li><li> Hvis du vil zoome til en højere opløsning, skal du vælge et vartegn ved hjælp af højre-klik modality af Vaa3D, og ​​zoom ind ved hjælp af musen rulle. Alternativt kan du direkte vælge ROI for at zoome ind med et højreklik eller angive koordinaterne for mængden af ​​interesse. </li><li> Hvis du vil zoome tilbage til lavere opløsning, skal du blot bruge musen rulle. </li></ol>

<ol>
	<li>Lichtman, J. W., Denk, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+big+and+the+small:+challenges+of+imaging+the+brain's+circuits.">The big and the small: challenges of imaging the brain's circuits.</a> Science. 334, 618-623 (2011).</li><li>Mayerich, D., Abbott, L., McCormick, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Knife-edge+scanning+microscopy+for+imaging+and+reconstruction+of+three-dimensional+anatomical+structures+of+the+mouse+brain.">Knife-edge scanning microscopy for imaging and reconstruction of three-dimensional anatomical structures of the mouse brain.</a> J. Microsc. 231, 134-143 (2008).</li><li>Li, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Micro-optical+sectioning+tomography+to+obtain+a+high-resolution+atlas+of+the+mouse+brain.">Micro-optical sectioning tomography to obtain a high-resolution atlas of the mouse brain.</a> Science. 330, 1404-1408 (2010).</li><li>Gong, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Continuously+tracing+brain-wide+long-distance+axonal+projections+in+mice+at+a+one-micron+voxel+resolution.">Continuously tracing brain-wide long-distance axonal projections in mice at a one-micron voxel resolution.</a> Neuroimage. 74, 87-98 (2013).</li><li>Ragan, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serial+two-photon+tomography+for+automated+ex+vivo+mouse+brain+imaging.">Serial two-photon tomography for automated ex vivo mouse brain imaging.</a> Nat. Methods. 9, 255-258 (2012).</li><li>Keller, P. J., Dodt, H. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light+sheet+microscopy+of+living+or+cleared+specimens.">Light sheet microscopy of living or cleared specimens.</a> Curr. Opin. Neurobiol. 22, 138-143 (2012).</li><li>Erturk, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+imaging+of+solvent-cleared+organs+using+3DISCO.">Three-dimensional imaging of solvent-cleared organs using 3DISCO.</a> Nat. Protoc. 7, 1983-1995 (2012).</li><li>Dodt, H. U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultramicroscopy:+three-dimensional+visualization+of+neuronal+networks+in+the+whole+mouse+brain.">Ultramicroscopy: three-dimensional visualization of neuronal networks in the whole mouse brain.</a> Nat. Methods. 4, 331-336 (2007).</li><li>Silvestri, L., Bria, A., Sacconi, L., Iannello, G., Pavone, F. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Confocal+light+sheet+microscopy:+micron-scale+neuroanatomy+of+the+entire+mouse+brain.">Confocal light sheet microscopy: micron-scale neuroanatomy of the entire mouse brain.</a> Opt. Express. 20, 20582-20598 (2012).</li><li>Becker, K., Jahrling, N., Saghafi, S., Weiler, R., Dodt, H. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+clearing+and+dehydration+of+GFP+expressing+mouse+brains.">Chemical clearing and dehydration of GFP expressing mouse brains.</a> PLoS One. 7, e33916 (2012).</li><li>Bria, A., Iannello, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TeraStitcher+-+A+Tool+for+Fast+Automatic+3D-Stitching+of+Teravoxel-Sized+Microscopy+Images.">TeraStitcher - A Tool for Fast Automatic 3D-Stitching of Teravoxel-Sized Microscopy Images.</a> BMC Bioinformatics. 13, 316 (2012).</li><li>Peng, H., Ruan, Z., Long, F., Simpson, J. H., Myers, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=V3D+enables+real-time+3D+visualization+and+quantitative+analysis+of+large-scale+biological+image+data+sets.">V3D enables real-time 3D visualization and quantitative analysis of large-scale biological image data sets.</a> Nat. Biotechnol. 28, 348-353 (2010).</li><li>Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole+animal+perfusion+fixation+for+rodents.">Whole animal perfusion fixation for rodents.</a> J. Vis. Exp. (65), e3564 (2012).</li><li>Hama, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scale:+a+chemical+approach+for+fluorescence+imaging+and+reconstruction+of+transparent+mouse+brain.">Scale: a chemical approach for fluorescence imaging and reconstruction of transparent mouse brain.</a> Nat. Neurosci. 14, 1481-1488 (2011).</li><li>Booth, M. J., Neil, M. A. A., Wilson, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aberration+correction+for+confocal+imaging+in+refractive-index-mismatched+media.">Aberration correction for confocal imaging in refractive-index-mismatched media.</a> J. Microsc. 192, 90-98 (1998).</li><li>Huisken, J., Swoger, J., Del Bene, F., Wittbrodt, J., Stelzer, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+sectioning+deep+inside+live+embryos+by+selective+plane+illumination+microscopy.">Optical sectioning deep inside live embryos by selective plane illumination microscopy.</a> Science. 305, 1007-1009 (2004).</li><li>Keller, P. J., Schmidt, A. D., Wittbrodt, J., Stelzer, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconstruction+of+zebrafish+early+embryonic+development+by+scanned+light+sheet+microscopy.">Reconstruction of zebrafish early embryonic development by scanned light sheet microscopy.</a> Science. 322, 1065-1069 (2008).</li><li>Jahrling, N., Becker, K., Schonbauer, C., Schnorrer, F., Dodt, H. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+reconstruction+and+segmentation+of+intact+Drosophila+by+ultramicroscopy.">Three-dimensional reconstruction and segmentation of intact Drosophila by ultramicroscopy.</a> Front Syst. Neurosci. 4, 1 (2010).</li></ol>

Forfatterne erklærer, at de ikke har nogen konkurrerende finansielle interesser.

CLSM kombineret med kemisk clearing udgør et kraftfuldt værktøj til at studere neuroanatomi af hele musehjerner mærket med fluorescerende prober, enten proteiner eller syntetiske farvestoffer. Da det udsendte lys udenfor brændplanet er blokeret af en fysisk rumlig filter, høj kontrast imaging er også muligt i tykke prøver, og samtidig opretholde den høje frame rates typiske for lys ark arkitektur. Det vigtigste spørgsmål at beskæftige sig med, når du bruger de beskrevne metoder er maksimering af kontrasten. I virkeligheden er den tilgængelige signal reduceres både ved kemiske og optiske faktorer. Fra kemisk synspunkt, kan clearing procedurer baseret på organisk opløsningsmiddel slukke emission fra fluorescerende proteiner og andre fluorescerende farvestoffer 7. Filtrering af opløsningsmiddel for at fjerne peroxider, som beskrevet af Becker et al. 10 tillader at opretholde en høj grad af fluorescens også opløsningsmidler blokerede væv. Udgived vandbaserede clearing metoder 14 ikke reducerer fluorescens effektivitet, men resulterer i dårligere gennemsigtighed, når der beskæftiger sig med hele murine hjerner, i det mindste med lineære optiske teknikker. På den anden side, i det øjeblik der er ingen kommercielle mål med lang arbejdsafstand korrigeret for højt brydningsindeks (n ≈ 1,56) clearing løsninger, der anvendes. Således brydningsindeks misforhold mellem det medium, hvori prøven er nedsænket og udformningen enkelte mål giver anledning til stærke sfæriske aberrationer. Ud over at reducere opløsningen af ​​mikroskopet, sådanne afvigelser resultere i et fald på billedet intensitet og kontrast, da lyset er spredt på et større område. Mulige løsninger til dette problem omfatter anvendelse af adaptiv optik 15 og / eller statiske asfæriske korrektorer. Enhver forbedring i billedets kontrast og intensitet let påvirker også billedbehandling hastighed, idet en kortere ikan vælges gration gang per billede. I øjeblikket CLSM kan tillade en imaging hastighed på omkring 10 6 um 3 / sek, med et kamera eksponeringstid på 100 msec 9. Ved denne hastighed det tager fra 1-3 dage til billedet en hel mus hjerne, afhængig af prøvens størrelse. Selvom ingen betydelig nedbrydning i billedkvaliteten er observeret gennem så lang imaging session, hovedsagelig på grund af den iboende lav fotoblegning af lys plade belysning 6, den lange tid, der kræves til billedet en enkelt mus hjerne i praksis kan reducere anvendeligheden af CLSM. En 10-fold stigning i systemets effektivitet, kombineret med anvendelse af en high-speed kamera til påvisning, ville reducere afbildningstiden til flere timer, hvilket giver en rutinemæssig brug af den beskrevne protokol. På trods af alle de ovennævnte begrænsninger, CLSM billedbehandling koblet til kemisk rensning af væv tilladelser til at rekonstruere hele musehjerner med micron-skala opløsning på mindre end etuge. Andre optiske metoder til hele hjernescanning råd højere opløsning end CLSM, men på bekostning af længere forberedelse og / eller billedbehandling tid 2-4, eller af en sparsom z prøveudtagning 5.. De er beskrevet i denne artikel, metoder kan anvendes i kombination med forskellige strategier for fluorescerende mærkning: transgene dyr, der udtrykker fluorescerende proteiner i udvalgte neuronale delmængder, viral transfektion, intraparenchymal farvestof indsprøjtning etc. I praksis alle farvningsprocedurer strategier forud dyreofringer er kompatible med CLSM . Faktisk har post mortem fluorescerende mærkning af hele musehjerner ikke påvist indtil nu, alligevel, hvis en sådan form for farvning ville være muligt i den nærmeste fremtid, antallet af prøver, der kan rekonstrueres med CLSM vil blive meget større, potentielt herunder menneskers hjernevæv. Afslutningsvis konfokal plade lys mikroskopi anvendes i kombination med tissagsøge clearing og multi-opløsning data management kan give forskere til at rekonstruere og analysere makroskopiske prøver med opløsning i micron skala, med de teknologiske indsats, der er godt på hånden af ​​de fleste laboratorier. Potentielle anvendelser af CLSM er naturligvis ikke begrænset til neurovidenskab, men spænder over alle de forskningsområder, hvor lys ark mikroskopi allerede er brugt, som embryogenese 16,17 og anatomi af små dyr 18.

Sammenlignet med vores forståelse af molekylære og cellulære mekanismer underliggende hjernefunktion, vores viden om fine neuroanatomi ser stadig i sin vorden 1. Faktisk mangler vi stadig omfattende kort over placeringen af ​​neuronal somata eller langtrækkende fremskrivninger hele hjernen. Faktisk er mange teknologiske indsats afsat til rekonstruere musehjernen med mikroskopisk opløsning. Optiske metoder baseret på seriel sektionering af harpiks-embedded prøver, som knivsæg skanningsmikroskopi (KESM) 2, Micro-Optical Sektionsinddeling Tomography (MEST) 3 og fluorescens-MOST (fMOST) 4, kan give sub-micron tredimensionel opløsning billeddannelse af hele musehjerner. Men den samlede nødvendige tid til forberedelse og billeddannelse af en enkelt prøve er i størrelsesordenen flere uger, hvilket begrænser den praktiske anvendelse af sådanne metoder. En anden teknik er baseret på seriel sektionering (men uden harpiks indlejring), Serial ToPhoton tomografi (STP) 5, giver høj tredimensionale opløsning billeddannelse. Imidlertid er denne teknik blevet påvist i hele musehjerner kun med en meget sparsom sampling, indsamling 1 sektion hver 50 um 5, og til vores viden STP ikke har produceret endnu en fuld prøvetagning rekonstruktion af en murin hjerne. En banebrydende optisk metode til at rekonstruere hele eksemplarer i tre dimensioner ved høj hastighed er lys ark mikroskopi 6. I denne optiske ordning prøven belyses med en tynd plade af lys og fluorescensemissionen opsamles langs en akse vinkelret på belysningen flyet. På denne måde kun i fokus fluorophores er glade, og det er muligt at opnå optisk sektionering i bredt felt konfiguration, der garanterer høje frame rates. Når koblet til clearing protokoller baseret på udskiftningen af vand med et brydningsindeks matchende flydende 7 har plade lys mikroskopi blevet anvendt påmakroskopiske prøver, som hele musehjerner 8. Men eksemplar-induceret lysspredning, som påvirker selv ryddet prøver nedbryder lyspladen fører til excitation af out-of-fokus fluoroforer som tilføjer en samlet sløring på de tilkøbte billeder. For selektivt at indsamle kun i fokus fotoner, vi for nylig koblede lys plade belysning til en konfokal afsløring ordning 9. I konfokal lys ark mikroskopi (CLSM), er ude af fokus og spredte fotoner afvist af et lineært geografisk filter (slids) forud for detektion (Figur 1). For at opnå konfokal drift i lyset ark arkitektur, er belysningen fremstillet ved hjælp af en scanning linje, og en de-scanning system detekteringsbanen skaber et statisk billede af excitation skannelinieadressedata ved placeringen af ​​spalten. En tredje scanning system rekonstruerer et todimensionalt billede på kameraets sensor. CLSM giver en 100% kontrast forbedring i ryddet mushjerner med hensyn til konventionel lys ark mikroskopi, og samtidig opretholde en 10 Hz frame rate. Med CLSM er det muligt at rekonstruere hele musehjerner med opløsning på 2 um i XY og 9 um i Z, og med tilstrækkelig kontrast til at skelne enkelt fluorescens-mærkede neuroner. I denne artikel beskriver vi den eksperimentelle rørledning til at rekonstruere en mus hjerne med CLSM. Hjerner Aldehydethere fast mus er dehydreret i en gradueret serie af peroxid-fri tetrahydrofuran og derefter godkendt i peroxid-fri dibenzylether (figur 2), efter den protokol, der er udviklet af 10 ryddet eksemplar Becker et al. Er derefter omhyggeligt monteret på en tippet plade og anbragt i det billeddannende kammer i et skræddersyet konfokal lys plade mikroskop. Prøven kan monteres direkte ved kaster det på en spids af pladen (figur 3a), alternativt kan limes på en disk af blokerede agarosegel (figur3b) eller anbragt i hulrummet af et bæger fremstillet af blokerede agarosegel (figur 3c). En optisk tomografi af hele hjernen derefter udføres som mange parallelle hosliggende stabler er erhvervet til at dække hele det volumen hjernen (figur 4). En præ-tomografi stikprøver, som producerer et groft kort over prøven placering og form, garanterer, at billeddiagnostik udføres kun i den mængde besat af prøven. Tomografi stakke efterfølgende syet sammen med custom-made software og gemmes i en multi-opløsning hierarkisk ordning 11.. Musehjerner sidste ende kan udforskes med prototypal multi-opløsning Google Maps-lignende visualisering software. Begge disse software-instrumenter er integreret som plugins i open source-platform Vaa3D 12. Vi endelig viser repræsentative billeder af musehjerner at demonstrere mulighederne for den beskrevne eksperimentelle rørledning i at studere fine murine neuroanatomy.

<table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td>Name of Reagent/Material</td>
 <td>Company</td>
 <td>Catalog Number</td>
 <td>Comments</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Phosphate Buffered Saline Tablets</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>P4417_100TAB</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Paraformaldehyde</td>
 <td>Agar Scientific</td>
 <td>R1018</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Peroxide-free Tetrahydrofuran</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>186562</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Aluminum oxide activated, basic, Brockmann I</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>199443</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Dibenzyl ether</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>108014</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Butylated hydroxytoluene</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>W218405 </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Agarose Type III-A, High EEO</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>A9793</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Acrylic glue</td>
 <td>Bostik</td>
 <td>D2498</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Vaa3D software</td>
 <td>open source</td>
 <td></td>
 <td>freely downloadable from <a href="http://www.vaa3d.org/" target="_blank">http://www.vaa3d.org/</a> </td>
 </tr>
 </tbody>
</table>

micron-scale resolution optical tomography of entire mouse brains with confocal light sheet microscopy

Forstå arkitektur pattedyrs hjerne ved encellede opløsning er et af de centrale spørgsmål i neurovidenskab. Men kortlægning neuronal soma og fremskrivninger hele hjernen er stadig en udfordring for billedbehandling og datastyring teknologier. Faktisk behøver, makroskopiske mængder, der skal rekonstrueres med høj opløsning og kontrast i en rimelig frist, der producerer datasæt i terabyte rækkevidde. Vi har for nylig påvist en optisk metode (konfokal plade lys mikroskopi, CLSM) mulighed for at opnå micron rekonstruktion af hele musehjerner mærket med forstærket grønt fluorescerende protein (EGFP). Ved at kombinere lys plade belysning og konfokal afsløring, CLSM giver dyb billeddannelse inde makroskopiske ryddet prøver med høj kontrast og hastighed. Her beskriver vi den komplette eksperimentelle rørledning til at opnå omfattende og menneskeligt læsbare billeder af hele musehjerner mærket med fluorescerende proteiner. Den clearing og montering pROCEDURER beskrives sammen med de trin for at udføre en optisk tomografi på hele dens volumen ved at erhverve mange parallelle tilstødende stakke. Vi viste brugen af ​​open source-custom-made software værktøjer, der gør syning af de mange stakke og multi-opløsning data navigation. Endelig har vi vist nogle eksempler på brainmaps: cerebellum fra en L7-GFP transgene mus, hvor alle Purkinjeceller selektivt mærket, og hele hjernen fra en Thy1-GFP-M mus, kendetegnet ved en vilkårlig sparsom neuronal mærkning.

Den beskrevne protokol kan anvendes til at rekonstruere med mikron-skala opløsning enten hele musehjerner eller udskårne dele, uden behovet for fysisk skæring. Som et repræsentativt resultat, i figur 6 hele lillehjernen en L7-GFP mus (postnatal dag 10) er vist. I dette dyr alle Purkinje neuroner er mærket med EGFP. Hvis vi ind i, kan typisk lamellar struktur cerebellar cortex ses (figur 7). Yderligere zoome ind tillader tydeligt skelne hver Purkinje celle soma (figur 8). Den beskrevne protokol kan således anvendes til at screene neuronal rumlige organisation i forskellige nervesystemets udvikling studier. Som et andet repræsentativt resultat, vi præsenterer billederne fra den unsectioned hjerne af en voksen Thy1-GFP-M mus. I denne transgene dyr EGFP udtrykkes i en tilfældig sparsom neuronal delmængde. Den højre halvdel af hjernen er vist ved i figur 9. Som vizoome ind længere og længere (fig. 10 og 11), neuronale processer bliver skelnes. Dette resultat viser, at den beskrevne protokol tillader micron-skala opløsning billeddannelse i hele voksen mus hjerner, åbner mulighed for at studere hel-hjerne anatomi ved cellulær opløsning i musemodeller af neurodegenerative sygdomme. <img alt="Figur 1" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/50696/50696fig1.jpg" /> Figur 1. Optisk ordning af konfokal plade lys mikroskopi (CLSM). (A) ovenfra af apparatet viser excitation vej. Laser emission fra en 488 nm diode-pumpet solid state (DPSS) laser, efter udvidelse og collimation af en første teleskop, kommer ind i et akustisk-optisk afstemmelige filter (AOTF), som regulerer stråle intensitet. Derefter en anden teleskop yderligere udvider strålen. En galvo spejl lodret (langs y) scanner være<html> am, som er fokuseret af en linse inde prøvekammer. (b) sideværts afbildning af apparatet, der viser påvisning vej. Light indsamlet af målet afsløring er vertikalt descanned af en galvo spejl og fokuseret af en linse, der producerer en fast billede af den bevægelige excitation linje. Ved positionen af ​​den faste billede en lineær rumligt filter (spalte) er anbragt. Efter spalten, en galvo spejl, som placeres inde i en 4f linsesystem rekonstruerer en 2-dimensionelle billede på chippen af ​​en CCD-enhed elektron-multiplicere (EM-CCD). En fluorescens båndpasfilter fjerne alle excitation falsk lys før detektion. Repræsentative stråler af excitation, afsløring og båndpas filtreret afsløring lys er afbildet af blå, lys blå og grønne stråler, hhv. De brændvidder på alle objektiver, der faktisk anvendes i mikroskopet er angivet. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/50696/50696fig1large.jpg" target="_blank">Klik her for at se større figur</a> . jove_content &quot;fo: keep-together.within-side =&quot; altid &quot;&gt; <img alt="Figur 2" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/50696/50696fig2.jpg" /> Figur 2. Model clearing. Formaldehyd-fikserede musehjerner, som er lagret i PBS 0,1 M ved 4 ° C (a) er dehydreret i en gradueret serie af tetrahydrofuran (THF, b) og derefter blokerede i 100% dibenzylether (DBE c). Dehydreringstrinnet forårsager også nogle væv svind. <img alt="Figur 3" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/50696/50696fig3.jpg" /> Figur 3.. Specimen montage for CLSM billeddannelse. Den ryddet hjerne kan være direkte kastet den tippes monteringsplade (a), limet på en ryddet agarose disk (b), eller indsættes i en ryddet agarose bæger (c). Figur 4.. Tomografi erhvervelsen. De præ-tomografi rutineprøver et parallelepipedum, der indeholder hjernen (a) til at definere antallet og længden af parallelle tilstødende stakke nødvendige for at billedet hele prøven (b). Efter tomografi, er sorte billeder, der dannes for at fuldføre den virtuelle erhvervet volumen til et parallelepipedum (c). <img alt="Figur 5" fo:content-width="4in" src="/files/ftp_upload/50696/50696fig5.jpg" /> Figur 5. Volume stikninger. De indsamlede billedstakke delvist overlapper mellem hinanden (a), så deres præcise tilpasning til TeraStitcher plugin (b). Plugin derefter fletter de justerede stakke i enten en enkelt stablet (c) eller multi-stacked (d) multi-opløsning repræsentation. <img alt="Figur 6" fo:conteint-width="5in" src="/files/ftp_upload/50696/50696fig6.jpg" /> Figur 6. Hele lillehjernen af en P10 L7-GFP mus, hvor alle Purkinje neuroner er mærket med EGFP. Scale bar, 1 mm. <img alt="Figur 7" fo:content-width="4in" src="/files/ftp_upload/50696/50696fig7.jpg" /> Figur 7. Zoom-in af en del af lillehjernen vist i figur 6, som viser den typiske lamelagtig struktur cerebellar cortex. Scale bar, 500 pm. <img alt="Figur 8" fo:content-width="4in" src="/files/ftp_upload/50696/50696fig8.jpg" /> Figur 8. Yderligere zoom-in af en del af lillehjernen er vist i fig. 6. Purkinje celler soma klart kan skelnered. Scale bar, 200 pm. <img alt="Figur 9" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/50696/50696fig9.jpg" /> Figur 9. Højre halvdel af hjernen fra en voksen Thy1-GFP-M mus, kendetegnet ved en sparsom uspecifik neuronal EGFP mærkning. Målestok, 1 mm. <img alt="Figur 10" fo:content-width="4in" src="/files/ftp_upload/50696/50696fig10.jpg" /> Figur 10. Zoome ind på en del af den halve hjernen vist i figur 9, der viser en del af hippocampus og cortex. Scale bar, 200 pm. <img alt="Figur 11" fo:content-width="4in" src="/files/ftp_upload/50696/50696fig11.jpg" /> Figur 11. Yderligere zoom-in af en del af den halve hjerne vist i figur 9.. Adskillige neurites i cortex klart kan skelnes. Målestokken50 um.

Watch this Scientific Journal Video about Micron-scale Resolution Optical Tomography of Entire Mouse Brains with Confocal Light Sheet Microscopy at JoVE.com

Micron-scale Resolution Optical Tomography of Entire Mouse Brains with Confocal Light Sheet Microscopy

I denne artikel beskriver vi den fulde eksperimentelle procedure at rekonstruere, med høj opløsning, den fine hjerne anatomi fluorescensmærkede mus hjerner. Den beskrevne protokol omfatter forberedelse og clearing prøve, prøve montering for billedbehandling, data post-behandling og multi-skala visualisering.

Micron-skala Opløsning Optical Tomography af hele Mouse Brains med konfokal Light Sheet Microscopy

Understanding the architecture of mammalian  brain at single-cell resolution is one of the key issues of neuroscience.  However, mapping neuronal soma and ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Optical Recording of Suprathreshold Neural Activity with Single-cell and Single-spike Resolution

Optisk registrering af suprathreshold neurale aktivitet med enkelt-celle-og single-spike opløsning

Signaling of information in the vertebrate central nervous system is often carried by populations of neurons rather than individual neurons. Also ...

Optical Coherence Tomography: Imaging Mouse Retinal Ganglion Cells In Vivo

Optical Coherence Tomography: Imaging Mouse Retinal Ganglion Cells In Vivo

Optisk kohærens tomografi: Imaging mus Retinal Ganglion celler In Vivo

Structural changes in the retina are common manifestations of ophthalmic diseases. Optical coherence tomography (OCT) enables their identification in ...

Visualization of Motor Axon Navigation and Quantification of Axon Arborization In Mouse Embryos Using Light Sheet Fluorescence Microscopy

Visualisering af Motor Axon Navigation og kvantificering af Axon Arborization i mus embryoner ved hjælp af lys ark Fluorescens mikroskopi

Spinal motor neurons (MNs) extend their axons to communicate with their innervating targets, thereby controlling movement and complex tasks in ...

Retinal Vascular Reactivity as Assessed by Optical Coherence Tomography Angiography

Retinal vaskulær reaktivitet som vurderet af optisk kohærens Tomografi Angiografi

The vascular supply to the retina has been shown to dynamically adapt through vasoconstriction and vasodilation to accommodate the metabolic demands of ...

Free-floating Immunostaining of Mouse Brains

Fritflydende immunstaining af musehjerner

Immunohistochemical staining of mouse brains is a routine technique commonly used in neuroscience to investigate central mechanisms underlying the ...

Characterization of Neuromuscular Junctions in Mice by Combined Confocal and Super-Resolution Microscopy

Karakterisering af neuromuskulære kryds i mus ved kombineret konfokal og superopløsningsmikroskopi

Neuromuscular junctions (NMJs) are highly specialized synapses between lower motor neurons and skeletal muscle fibers that play an essential role in the ...

Registration of Calcium Transients in Mouse Neuromuscular Junction with High Temporal Resolution using Confocal Microscopy

Registrering af calciumtransienter i musens neuromuskulære krydsning med høj tidsmæssig opløsning ved hjælp af konfokal mikroskopi

Estimation of the presynaptic calcium level is a key task in studying synaptic transmission since calcium entry into the presynaptic cell triggers a ...

Coherent Anti-Stokes Raman Spectroscopy (CARS) Application for Imaging Myelination in Brain Slices

Coherent Anti-Stokes Raman Spectroscopy CARS Application for Imaging Myelination in Brain Slices

Sammenhængende Anti-Stokes Raman Spectroscopy (CARS) ansøgning om billeddannelse myelinering i hjerneskiver

Coherent anti-Stokes Raman spectroscopy (CARS) is a technique classically employed by chemists and physicists to produce a coherent signal of signature ...

Whole-Brain Single-Cell Imaging and Analysis of Intact Neonatal Mouse Brains Using MRI, Tissue Clearing, and Light-Sheet Microscopy

Helhjerne enkeltcellebilleddannelse og analyse af intakte neonatale musehjerner ved hjælp af MR, vævsrensning og lysarkmikroskopi

Tissue clearing followed by light-sheet microscopy (LSFM) enables cellular-resolution imaging of intact brain structure, allowing quantitative analysis of ...

Imaging the Aging Cochlea with Light-Sheet Fluorescence Microscopy

Billeddannelse af den aldrende cochlea med lysarkfluorescensmikroskopi

Deafness is the most common sensory impairment, affecting approximately 5% or 430 million people worldwide as per the World Health Organization1. Aging or ...