Name: micron-scale resolution optical tomography of entire mouse brains with confocal light sheet microscopy
Uploaded: 2013-10-08T19:30:00
Duration: 9 min 49 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Micron-scale Resolution Optical Tomography of Entire Mouse Brains with Confocal Light Sheet Microscopy at JoVE.com

Den forskning som fører til disse resultatene har fått støtte fra EU sjuende rammeprogram (FP7/2007-2013) etter tilskuddsavtaler n. 228334 og 241526. Dette forskningsprosjektet har vært også støttet av Human Frontier Science Program forskningsstipend (RGP0027/2009), og etter det italienske departementet for utdanning, universitet og forskning innenfor rammen av flaggskip-prosjektet Nanomax og av den italienske helsedepartementet i rammen av &quot;Stem Cells Utlysning&quot;. Denne forskningen er utført i rammen av forskningsvirksomhet av ICON stiftelse som støttes av &quot;Ente Cassa di risparmio di Firenze&quot;.

En. Vevpreparerina og lagring <ol><li> Fikse musehjerne ved standard transcardial perfusjon 13 med 20 ml 0,01 M fosfat-bufret saltløsning (PBS) løsning, etterfulgt av 100 ml av 4% paraformaldehyd i 0,01 M PBS. Justeres forsiktig pH på begge løsningene til 7,6: litt lavere verdier av pH kan slukke fluorescensen av EGFP. </li><li> Post-fikse skåret hjerner over natten i 4% paraformaldehyd ved 4 ° C. </li><li> Skyll to ganger (30 min hver) i 0,01 M PBS og oppbevar i 0,01 M PBS ved 4 ° C. </li></ol> 2. Dehydrering og Clearing Merk: protokollen for dehydrering og clearing følger tett det som er beskrevet av Becker et al 10. <ol><li> For å fjerne peroksyder fra dehydrering løsningsmiddel (tetrahydrofuran, THF), noe som sterkt slukke XFP fluorescens, THF filter med grunnleggende aktivert aluminium-oksyd (aktivitet grade Brockman I, omtrent 250 g / L i THF) ved hjelp av en kromaTO kolonne. Unngå sprekkdannelser i kolonnen, noe som ville redusere peroksyd fjerning. </li><li> Stabilisator (butylert hydroksytoluen, 250 mg / l) til den endelige løsning, selv om THF ble allerede stabilisert før filtrering. Stabilisator er faktisk beholdt av aluminiumoksid: THF uten stabilisator kan utvikle store mengder peroksider og kan være eksplosiv og farlig. </li><li> Dehydrer hele musehjerne i en gradert serie av THF i rent vann: 50%, 70%, 80%, 90%, 96%, 100%, 1 time hver, deretter 100% over natten. Plasser hetteglasset med prøven på et roterende hjul. For å unngå lyseksponering, pakk hetteglassene med aluminiumsfolie. </li><li> Filtrer ryddeløsningsmiddel (dibenzyl-eter, DBE) med aluminiumoksid (aktivert basis, aktivitet grade Brockman I, omtrent 250 g / L av DBE) ved hjelp av en filtreringstrakten. </li><li> Tømme prøven i 100% DBE. Endring oppløsningen etter 3 og 6 timer. </li></ol> Tre. Prøvemonterings <ol><li> Når hjernen ser gjennomsiktig ved øyet (typitisk en time etter den andre DBE endre), monter den på tipped bildebehandling plate med en av følgende metoder: </li><li><ol><li> Direkte montering - forsiktig stupe prøven på en av spissene (fig. 3a). </li><li> Agarose plate - Plunge en plate laget av 6% agarosegel på tips. Forsiktig løse prøven på agarose-plate med akryl-lim (figur 3b). Vent ca 1 min for herding. </li><li> Agarose beger - Plunge et beger laget av tre% agarosegel på tips. Forsiktig plassere prøven i bunnen av begerglasset (figur 3c). </li></ol></li></ol> Note 1: Montering i agarose begerglass bør foretrekkes når det er viktig å avbilde prøven i sin helhet, men det agarosegel som omgir prøven gir opphav til ytterligere lysspredning, som kan være til skade for bildekvalitet. Hvis en liten del av prøven kan bli utelukket fra avbildning, er det bedre å montere specimen på agarose disk eller direkte på spissen. Den førstnevnte metode er best egnet for å holde hjernen horisontale (med unntak av å avbilde en ventral-eller rygg-delen av hjernen), idet sistnevnte for å holde hjernen vertikal (med unntak av å avbilde en del av duft lyspærer eller ryggmarg). Merknad 2: agarose gel bør utarbeides i vann, deretter dehydrert med THF (50% og 100% 4 hr hver) og ryddet i DBE 100% for 4 timer eller til det ser klart gjennomsiktig. <ol start="3"><li> Etter montering av prøven etter en av de tidligere metoder, plassere bildeplaten inne i prøvekammeret ved hjelp av pinsett. Fyll kammeret med clearing løsning. </li></ol> 4. Tomography Forberedelse <ol><li> Fjern sliss for å samle inn så mye fluorescens som mulig. </li><li> Belyse prøven med lav laser makt for å hindre fotobleking. </li><li> Flytt prøven i tre retninger ved hjelp av programvare-drevet micropositioning system. Identifiser for hver retning minimums-og maksimumskoordinater hvor prøven er tent og det er innenfor det synsfeltet til kameraet (figur 4a). </li><li> Sett oven koordinatene som parametere for &quot;Pre-tomografi &#39;subrutine. Spesifiser også avstanden mellom tilstøtende stabler som skal benyttes i tomografi, og pre-tomografi sampling trinn i z-retningen. </li><li> Start pre-tomografi, som samler bildene i hver stabel med z prøvetaking spesifisert ved (4.4). </li></ol> Merk: De innsamlede bilder brukes av en programvare for å forberede et provisorisk kart over prøven form og posisjon (figur 4b), som gjør det mulig å begrense tomografi oppkjøpet kun til volumet faktisk okkupert av prøven, redusere bilde tid og dermed fotobleking. 5. Tomography Acquisition <ol><li> Beveg prøven utsiden av lampen ved hjelp av arket micropositioning system. </li><li> Incg på laser-kraft og stoppe bevegelsen av alle skanning systemer, for å belyse bare en fast linje i sentrum av synsfeltet. </li><li> Monter slit og justere den ved hjelp autofluorescence signal fra clearingløsning. Bør tydelig se spalte linje i sentrum av synsfeltet. </li><li> Re-aktivere skannesystemet, redusere laser makt og flytte prøven inne lyset arket ved hjelp av micropositioning system. Legg merke til at lasereffekten brukes med slissen vil være høyere enn den som brukes uten at det, siden de romlige filteret blokkerer en ikke-neglisjerbar andel av lys. </li><li> Juster amplitude og offset av skanne og de-skanning systemer med styringsprogramvaren, før bildene ser klart og tydelig. </li><li> Kjør tomografi oppkjøpet programvaren, etter innstilling av riktig z skritt for eksperimentet. Volumet vil bli fotografert i mange parallelle, delvis overlappende stabler (figur 5a), og bildene vil bli lagret ien hierarkisk mappestruktur. </li></ol> 6. Søm og visualisering <ol><li> Fullfør ervervet volum med syntetiske sorte bilder (dvs. bilder av samme type og dimensjoner av de innsamlede seg-, men med null intensitet) ved hjelp av en automatisert programvare (Figur 4c). Dette trinnet er obligatorisk for at søm programvare for å håndtere en komplett kubikk volum. </li><li> Launch Vaa3D programvare (fritt nedlastbart fra <a href="http://www.vaa3d.org/" target="_blank">http://www.vaa3d.org/</a> ) med plugins TeraStitcher og TeraManager installert. </li><li> Laste TeraStitcher plugin. Velg katalogen inneholder avbildes volum, viser de relative orienteringer av aksene (med hensyn til en referanse høyrehendt koordinatsystem) og voksel størrelse. </li><li> Lansere den første delen av sømmen. Programvaren vil beregne relativ forskyvning mellom par av stabler, og finne en samlet optimal placement for alle de stabler sammen (figur 5b). </li><li> Velg å lagre sydd volum i single-oppløsning eller i multi-oppløsning format. Sistnevnte gjør det mulig for multi-oppløsning visualisering med TeraManager plugin. I begge tilfeller, hvis for høyere oppløsning er større enn noen få gigabyte, også velge multi-stack redning modalitet og angi størrelsen på individuelle substacks. Dette vil muliggjøre effektiv tilgang til de lagrede data. </li><li> Lansere den andre delen av sømmen. Programvaren vil fusjonere de sammenstilte stabler, og lagre dem i enten single-eller multi-stack modus (Tall 5c og 5d). På slutten lukke TeraStitcher plugin. </li><li> Laste TeraManager plugin. Velg mappen med multi-oppløsning volum multi-stablet, og indikerer voxel størrelse og økser orientering. Volumet vil bli lastet på minimum oppløsning. </li><li> Hvis du vil zoome til en høyere oppløsning, velg et landemerke ved hjelp av høyreklikk modality av Vaa3D og zoomer inn ved hjelp av musehjulet. Alternativt kan du direkte velge ROI for å zoome inn med en høyre-klikk, eller angi koordinatene til volumet av interesse. </li><li> Hvis du vil zoome tilbake til lavere oppløsning, bare bruk musehjulet. </li></ol>

<ol>
	<li>Lichtman, J. W., Denk, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+big+and+the+small:+challenges+of+imaging+the+brain's+circuits.">The big and the small: challenges of imaging the brain's circuits.</a> Science. 334, 618-623 (2011).</li><li>Mayerich, D., Abbott, L., McCormick, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Knife-edge+scanning+microscopy+for+imaging+and+reconstruction+of+three-dimensional+anatomical+structures+of+the+mouse+brain.">Knife-edge scanning microscopy for imaging and reconstruction of three-dimensional anatomical structures of the mouse brain.</a> J. Microsc. 231, 134-143 (2008).</li><li>Li, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Micro-optical+sectioning+tomography+to+obtain+a+high-resolution+atlas+of+the+mouse+brain.">Micro-optical sectioning tomography to obtain a high-resolution atlas of the mouse brain.</a> Science. 330, 1404-1408 (2010).</li><li>Gong, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Continuously+tracing+brain-wide+long-distance+axonal+projections+in+mice+at+a+one-micron+voxel+resolution.">Continuously tracing brain-wide long-distance axonal projections in mice at a one-micron voxel resolution.</a> Neuroimage. 74, 87-98 (2013).</li><li>Ragan, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serial+two-photon+tomography+for+automated+ex+vivo+mouse+brain+imaging.">Serial two-photon tomography for automated ex vivo mouse brain imaging.</a> Nat. Methods. 9, 255-258 (2012).</li><li>Keller, P. J., Dodt, H. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light+sheet+microscopy+of+living+or+cleared+specimens.">Light sheet microscopy of living or cleared specimens.</a> Curr. Opin. Neurobiol. 22, 138-143 (2012).</li><li>Erturk, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+imaging+of+solvent-cleared+organs+using+3DISCO.">Three-dimensional imaging of solvent-cleared organs using 3DISCO.</a> Nat. Protoc. 7, 1983-1995 (2012).</li><li>Dodt, H. U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultramicroscopy:+three-dimensional+visualization+of+neuronal+networks+in+the+whole+mouse+brain.">Ultramicroscopy: three-dimensional visualization of neuronal networks in the whole mouse brain.</a> Nat. Methods. 4, 331-336 (2007).</li><li>Silvestri, L., Bria, A., Sacconi, L., Iannello, G., Pavone, F. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Confocal+light+sheet+microscopy:+micron-scale+neuroanatomy+of+the+entire+mouse+brain.">Confocal light sheet microscopy: micron-scale neuroanatomy of the entire mouse brain.</a> Opt. Express. 20, 20582-20598 (2012).</li><li>Becker, K., Jahrling, N., Saghafi, S., Weiler, R., Dodt, H. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+clearing+and+dehydration+of+GFP+expressing+mouse+brains.">Chemical clearing and dehydration of GFP expressing mouse brains.</a> PLoS One. 7, e33916 (2012).</li><li>Bria, A., Iannello, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TeraStitcher+-+A+Tool+for+Fast+Automatic+3D-Stitching+of+Teravoxel-Sized+Microscopy+Images.">TeraStitcher - A Tool for Fast Automatic 3D-Stitching of Teravoxel-Sized Microscopy Images.</a> BMC Bioinformatics. 13, 316 (2012).</li><li>Peng, H., Ruan, Z., Long, F., Simpson, J. H., Myers, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=V3D+enables+real-time+3D+visualization+and+quantitative+analysis+of+large-scale+biological+image+data+sets.">V3D enables real-time 3D visualization and quantitative analysis of large-scale biological image data sets.</a> Nat. Biotechnol. 28, 348-353 (2010).</li><li>Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole+animal+perfusion+fixation+for+rodents.">Whole animal perfusion fixation for rodents.</a> J. Vis. Exp. (65), e3564 (2012).</li><li>Hama, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scale:+a+chemical+approach+for+fluorescence+imaging+and+reconstruction+of+transparent+mouse+brain.">Scale: a chemical approach for fluorescence imaging and reconstruction of transparent mouse brain.</a> Nat. Neurosci. 14, 1481-1488 (2011).</li><li>Booth, M. J., Neil, M. A. A., Wilson, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aberration+correction+for+confocal+imaging+in+refractive-index-mismatched+media.">Aberration correction for confocal imaging in refractive-index-mismatched media.</a> J. Microsc. 192, 90-98 (1998).</li><li>Huisken, J., Swoger, J., Del Bene, F., Wittbrodt, J., Stelzer, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+sectioning+deep+inside+live+embryos+by+selective+plane+illumination+microscopy.">Optical sectioning deep inside live embryos by selective plane illumination microscopy.</a> Science. 305, 1007-1009 (2004).</li><li>Keller, P. J., Schmidt, A. D., Wittbrodt, J., Stelzer, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconstruction+of+zebrafish+early+embryonic+development+by+scanned+light+sheet+microscopy.">Reconstruction of zebrafish early embryonic development by scanned light sheet microscopy.</a> Science. 322, 1065-1069 (2008).</li><li>Jahrling, N., Becker, K., Schonbauer, C., Schnorrer, F., Dodt, H. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+reconstruction+and+segmentation+of+intact+Drosophila+by+ultramicroscopy.">Three-dimensional reconstruction and segmentation of intact Drosophila by ultramicroscopy.</a> Front Syst. Neurosci. 4, 1 (2010).</li></ol>

Forfatterne hevder at de ikke har noen konkurrerende finansielle interesser.

CLSM kombinert med kjemisk clearing representerer et kraftig verktøy for å studere nevroanatomi av hele mus hjerner merket med fluorescerende prober, enten proteiner eller syntetiske fargestoffer. Siden lyset slippes utenfor fokusplanet er blokkert av en fysisk romlig filter, er høy kontrast bildebehandling mulig også i tykke prøver, og samtidig opprettholde den høye bildefrekvens som er typisk for lys ark arkitektur. Den viktigste saken for å forholde seg til når du bruker de beskrevne metodene er å øke den kontrasten. Faktisk er det tilgjengelige signal reduseres både ved kjemiske og optiske faktorer. Fra kjemisk synspunkt, kan clearing prosedyrer basert på organisk løsemiddel slukke utslipp fra fluoriserende proteiner og andre fluorescerende fargestoffer 7. Filtrering av oppløsningsmidlet for å fjerne peroksyder, som beskrevet av Becker et al. 10, gjør det mulig å opprettholde et godt nivå av fluorescens også i løsemiddelerte vev. Published vannbaserte avregningsmetoder 14 ikke reduserer fluorescens effektivitet, men resultere i dårligere gjennomsiktighet når du arbeider med hele murine hjerner, i hvert fall med lineære optiske teknikker. På den annen side, i øyeblikket er det ingen kommersielle mål med lang arbeidsavstand korrigert for høy brytningsindeks (n ≈ 1,56) clearing løsninger som brukes. Således brytningsindeksen mismatch mellom mediet hvori prøven er neddykket, og utformingen av en av målet gir opphav til sterke sfæriske aberrasjoner. Foruten å redusere oppløsningen av mikroskopet, slike avvik fører til en reduksjon av bildeintensitet og kontrast, da lys blir spredt på et større område. Mulige løsninger på dette problemet inkluderer bruk av adaptiv optikk 15 og / eller statiske asfæriske correctors. Enhver forbedring i bildekontrast og intensitet lett påvirker også avbildningshastighet, siden en korteretegration tid per bilde kan velges. I det øyeblikk CLSM har råd til en avbildningshastighet på omtrent 10 mikrometer 6 3 / sek, med en kameraeksponeringstiden på 100 msek 9.. Ved denne hastigheten tar det 1-3 dager for å avbilde et hele musehjerne, avhengig av prøvens størrelse. Selv om ingen signifikant reduksjon i bildekvalitet er observert gjennom en slik lang bildebehandling økt, hovedsakelig på grunn av den iboende lav fotobleking av lys ark belysning 6, den lange tiden som er nødvendig for å image et enkelt muse hjernen kan i praksis redusere anvendelsen av CLSM. En 10-gangers økning i systemeffektivitet, kombinert med bruk av en høyhastighetskamera for deteksjon, vil redusere bilde tid til flere timer, slik at en rutinemessig bruk av den beskrevne protokoll. Til tross for alle de ovennevnte begrensninger, CLSM bildebehandling koblet til kjemisk rengjøring av vev tillatelser til å rekonstruere hele mus hjerner med mikron-skala oppløsning på mindre enn enuke. Andre optiske metoder for hele hjernen bildebehandling råd til høyere oppløsning enn CLSM, men til prisen av lengre forberedelse og / eller bilde tid 2-4, eller av en sparsom z prøvetaking fem. Metodene som beskrives i denne artikkelen, kan anvendes i kombinasjon med forskjellige strategier for fluorescerende merking: transgene dyr som uttrykker fluorescerende proteiner i valgte undergrupper, neuronale viral transfeksjon, intraparenchymal fargestoff injeksjon, etc. I praksis kan alle flekker strategier foranstående dyreoffer er kompatible med CLSM . Faktisk har post-mortem fluorescerende merking av hele mus hjerner ikke blitt vist til nå, uansett, hvis en slik type flekker ville være mulig i nær fremtid, antall prøver som kan bli rekonstruert med CLSM vil bli mye større, potensielt inkludert menneskelige hjerne vev. I konklusjonen, konfokal lys ark mikroskopi brukes i kombinasjon med tissaksøke clearing og multi-oppløsning data management kan tillate forskere å rekonstruere og analysere makroskopiske prøver med oppløsning i micron skala, med teknologiske tiltak som er godt på hånden av de fleste laboratorier. Potensielle anvendelser av CLSM er selvfølgelig ikke begrenset til nevrovitenskap, men spenner over alle forskningsfelt hvor lys ark mikroskopi har allerede blitt brukt, som embryogenese 16,17 og anatomi av små dyr 18.

Sammenlignet med vår forståelse av molekylære og cellulære mekanismene bak hjernens funksjon, ser vår kunnskap om fin neuroanatomy fortsatt i sin barndom en. Faktisk, vi mangler fortsatt omfattende kart over plasseringen av nevronale somata eller langtrekkende anslag i hele hjernen. Egentlig er mange teknologiske innsats viet til rekonstruere musen hjernen med mikroskopisk oppløsning. Optiske metoder basert på serie seksjonering av harpiks-embedded prøver, som Knife-Edge Scanning Mikros (KESM) 2, Micro-Optical Seksjonering Tomography (MOST) 3 og fluorescens-MOST (fMOST) 4, kan gi sub-micron tredimensjonal oppløsning avbildning av hele mus hjerner. Imidlertid er den totale tiden som er nødvendig for utarbeidelse og avbildning av en enkelt prøve av rekkefølgen på flere uker, noe som begrenser den praktiske anvendelsen av slike metoder. En annen teknikk basert på serie seksjonering (men uten klister embedding), Serial To-Photon tomografi (STP) 5, gir høy tredimensjonal oppløsning bildebehandling. Imidlertid har denne teknikken er påvist i hele mus hjerner bare med en svært sparsom prøvetaking, samle en seksjon hver 50 mikrometer fem, og så vidt vi vet STP ikke har produsert enda en full-sampling rekonstruksjon av en murine hjerne. En avansert optisk metode for å rekonstruere hele prøvene i tre dimensjoner i høy hastighet er lett ark mikros 6.. I denne optiske ordningen prøven er belyst med et tynt ark av lys og fluorescensemisjonen samles langs en akse perpendikulær på belysningsplanet. På denne måten bare i-fokus fluorophores er spent og det er mulig å oppnå optisk seksjonering i bredt felt konfigurasjon, noe som garanterer høy bildefrekvens. Når dette kombineres til å avskjære protokoller basert på substitusjon av vann med en brytningsindekstilpassende væske 7, har lys ark mikros blitt påførtmakroskopiske prøver, som hele mus hjerner åtte. Men prøven-indusert lysspredning, noe som påvirker selv ryddet prøver, forringer lys ark fører til eksitasjon av ut-av-fokus fluoroforene som legger en samlet uskarphet til de oppkjøpte bildene. For å selektivt samle bare i-fokus fotoner, vi nylig kombinert lys ark belysning til en confocal deteksjon ordningen ni. I konfokal lys ark mikroskopi (CLSM), er ute av fokus og spredte fotoner avvist av en lineær romlig filter (slit) før deteksjon (Figur 1). For å oppnå konfokal drift i lys ark-arkitektur, blir lys som produseres ved hjelp av en skannelinje, og en de-skannesystem i registreringsbanen skaper et statisk bilde av magnetisering avsøkningslinjen ved stedet for slissen. En tredje skannesystem rekonstruerer et todimensjonalt bilde på kameraets sensor. CLSM gir en 100% kontrastoppladning i ryddet mushjerner med hensyn til konvensjonelle lys ark mikroskopi, og samtidig opprettholde en 10 Hz bildefrekvens. Med CLSM er det mulig å rekonstruere hele mus hjerner med oppløsning av 2 mikrometer i XY og 9 mikrometer i Z, og med tilstrekkelig kontrast å skjelne enkelt fluorescensmerkede neuroner. I denne artikkelen beskriver vi den eksperimentelle rørledningen for å rekonstruere en musehjerne med CLSM. Aldehyd-fast mus hjerner er dehydrert i en gradert serie av peroksyd-fritt tetrahydrofuran og deretter tømt i peroksyd-fri dibenzyl-eter (figur 2), etter den protokoll som er utviklet av Becker et al. 10. Den erte prøven blir deretter omhyggelig montert på en tippet plate og plassert i bildekammer av en skreddersydd konfokal lys ark mikroskop. Prøven kan monteres direkte ved å dyppe den på en spiss på platen (figur 3a), alternativt kan limes på en plate av erte agarosegel (figur3b) eller plassert i hulrommet i et begerglass fremstilt av erte agarosegel (figur 3c). En optisk tomografi av hele hjernen blir deretter utført, så mange parallelle tilstøtende stabler er anskaffet for å dekke hele hjernen volum (figur 4). En pre-tomografi sampling, som frembringer en grov kart av prøven stilling og form, garanterer at avbildning utføres bare i volumet okkupert av prøven. De tomografi stabler senere blir sydd sammen med skreddersydd programvare og lagret i en multi-oppløsning hierarkisk ordning 11. Mus hjerner kan etter hvert bli utforsket med prototypal multi-oppløsning Google Maps-lignende visualiseringsprogramvare. Begge disse programvareinstrumenter er integrert som plugins i åpen kildekode-plattform Vaa3D 12. Vi endelig vise representative bilder av mus hjerner for å vise mulighetene den beskrevne eksperimentell rørledningen i å studere fin murine neuroanatomy.

<table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td>Name of Reagent/Material</td>
 <td>Company</td>
 <td>Catalog Number</td>
 <td>Comments</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Phosphate Buffered Saline Tablets</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>P4417_100TAB</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Paraformaldehyde</td>
 <td>Agar Scientific</td>
 <td>R1018</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Peroxide-free Tetrahydrofuran</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>186562</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Aluminum oxide activated, basic, Brockmann I</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>199443</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Dibenzyl ether</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>108014</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Butylated hydroxytoluene</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>W218405 </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Agarose Type III-A, High EEO</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>A9793</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Acrylic glue</td>
 <td>Bostik</td>
 <td>D2498</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Vaa3D software</td>
 <td>open source</td>
 <td></td>
 <td>freely downloadable from <a href="http://www.vaa3d.org/" target="_blank">http://www.vaa3d.org/</a> </td>
 </tr>
 </tbody>
</table>

micron-scale resolution optical tomography of entire mouse brains with confocal light sheet microscopy

Forstå arkitekturen i hjernen hos pattedyr ved encellede oppløsning er en av de viktigste spørsmålene i nevrovitenskap. Men kartlegging neuronal soma og prognoser gjennom hele hjernen er fortsatt utfordrende for bildebehandling og datahåndteringsteknologier. Faktisk, makroskopiske volumer må rekonstrueres med høy oppløsning og kontrast i en rimelig tid, produsere datasett i Terabyte serien. Vi har nylig demonstrert en optisk metode (konfokal lys ark mikroskopi, CLSM) i stand til å skaffe mikron-skala rekonstruksjon av hele mus hjerner merket med forbedret grønt fluorescerende protein (EGFP). Kombinere lys ark belysning og confocal deteksjon, tillater CLSM dypt bildebehandling inne makroskopiske ryddet prøvene med høy kontrast og hastighet. Her beskriver vi den komplette eksperimentell rørledningen for å få omfattende og lesbar bilder av hele mus hjerner merket med fluorescerende proteiner. Clearing og monterings procedures er beskrevet, sammen med fremgangsmåten for å utføre en optisk tomografi på sin hele volumet ved å anskaffe mange parallelle tilstøtende stabler. Vi viste bruken av åpen kildekode skreddersydde programvareverktøy som gjør det mulig søm av flere stabler og multi-oppløsning data navigasjon. Til slutt illustreres vi noen eksempel på hjernekart: cerebellum fra en L7-GFP transgen mus, i hvilken alle Purkinje celler er selektivt merkes, og hele hjernen fra en thy1-GFP-M-mus, karakterisert ved et vilkårlig tynt neuronal merking.

Den beskrevne protokollen kan brukes til å rekonstruere med mikron-skala oppløsning enten hele mus hjerner eller skåret deler, uten behov for fysisk seksjonering. Som et representativt resultat, i figur 6 hele cerebellum fra en L7-GFP mus (postnatal dag 10) er vist. I dette dyret alle Purkinje nevroner er merket med EGFP. Hvis vi zoomer inn, kan den typiske bladstruktur av cerebellar cortex sees (fig. 7). Videre zoomer inn kan tydelig skille hver Purkinje celle soma (Figur 8). Den beskrevne protokollen kan dermed brukes til å screene nevronale romlige organiseringen i ulike neurodevelopment studier. Som en andre representant resultat, presenterer vi bilder fra innlagt hjernen til en voksen thy1-GFP-M mus. I denne transgent dyr EGFP er uttrykt i en vilkårlig tynt neuronal delsett. Den høyre halvdelen av hjernen er vist på figur 9. Som vizoome inn lenger og lenger (figurene 10 og 11), nerveprosesser blir synlig. Dette resultatet viser at den beskrevne protokollen tillater oppløsning imaging mikron-skala i hele voksen mus hjerner, åpner muligheten for å studere hel-hjerne anatomi ved cellular oppløsning i musemodeller av nevrodegenerative sykdommer. <img alt="Figur 1" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/50696/50696fig1.jpg" /> Figur 1. Optisk ordning av konfokal mikroskopi lys ark (CLSM). (A) ovenfra av anordningen, som viser magnetiseringsstrømmen pathway. Laser utslipp fra en 488 nm diode-pumpet solid state (DPSS) laser, etter utvidelse og collimation av en første teleskop, entrer en akustooptiske tunbare filter (AOTF) som regulerer stråleintensitet. Deretter kan en andre teleskop utvider strålen. En galvo speil vertikalt (langs y) skanner være<html> am, som blir fokusert av en linse inne i prøvekammeret. (b) Lateral riss av apparatet, som viser deteksjonsveien. Lett samlet inn av objektiv påvisning er vertikalt descanned av en galvo speil og fokusert av en linse, produsere et fast bilde av bevegelige eksitasjon linjen. Ved plasseringen av den faste bildet en lineær romlig filter (spalte) er plassert. Etter spalten, en galvo speil plassert inne i en 4f linsesystem rekonstruerer en to-dimensjonal bilde på brikken for en elektron multiplisere charge-coupled device (EM-CCD). En fluorescens båndpassfilter fjerner all eksitasjon strølys før deteksjon. Representative stråler av eksitasjon, deteksjon og båndpassfiltrert deteksjon lys er avbildet med blå, lyseblå og grønne stråler, henholdsvis. De brennvidder på alle objektiver faktisk brukes i mikroskopet er indikert. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/50696/50696fig1large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se større figur</a> . jove_content &quot;fo: keep-together.within-page =&quot; always &quot;&gt; <img alt="Fig. 2" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/50696/50696fig2.jpg" /> Figur 2. Prøve clearing. Formaldehyd-fast mus hjerner, hvilken er lagret i PBS 0,1 M ved 4 ° C (a), er dehydrert i en gradert serie av tetrahydrofuran (THF, b) og deretter tømt i 100% dibenzyl-eter (DBE , c). Dehydratiseringstrinnet forårsaker også en viss vev krymping. <img alt="Figur 3" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/50696/50696fig3.jpg" /> Fig. 3. Specimen montering for CLSM avbildning. Den klart hjernen kan være direkte kastet på tippet monteringsplaten (a), limt på et klart agarose-plate (b), eller satt inn i en tømt agarose begerglass (c). Figur 4. Tomography anskaffelse. De pre-tomografi rutineprøver et parallellepiped som inneholder hjernen (a) for å definere antallet og lengden av parallelle tilstøtende stabler for å bilde hele prøven (b). Etter tomografi, er sorte bilder genereres for å fullføre den virtuelle ervervet volumet til et parallellepiped (c). <img alt="Figur 5" fo:content-width="4in" src="/files/ftp_upload/50696/50696fig5.jpg" /> Figur 5. Volume søm. Den samlet bilde stabler delvis overlapper mellom hverandre (a), slik at deres presis justering med TeraStitcher plugin (b). Den plugin deretter fusjonerer de sammenstilte stabler i enten en enkelt-stablet (c) eller multi-stacked (d) multioppløsningsrepresentasjon. <img alt="Figur 6" fo:conteint-width="5in" src="/files/ftp_upload/50696/50696fig6.jpg" /> Figur 6. Hele lillehjernen av en P10 L7-GFP mus, der alle Purkinje nevroner er merket med EGFP. Scale bar, 1 mm. <img alt="Figur 7" fo:content-width="4in" src="/files/ftp_upload/50696/50696fig7.jpg" /> Figur 7. Zoom-in av en del av cerebellum vist i figur 6, som viser den typiske bladstruktur av lillehjernen cortex. Skala bar, 500 mikrometer. <img alt="Figur 8" fo:content-width="4in" src="/files/ftp_upload/50696/50696fig8.jpg" /> Figur 8. Ytterligere zoom-in av en del av cerebellum vist i figur 6.. Purkinje celler soma kan være klart skilleed. Scale bar, 200 mikrometer. <img alt="Figur 9" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/50696/50696fig9.jpg" /> Figur 9. Høyre halvdel av hjernen fra en voksen thy1-GFP-M mus, preget av en sparsom uspesifikk nevronale EGFP merking. Scale bar, 1 mm. <img alt="Fig. 10" fo:content-width="4in" src="/files/ftp_upload/50696/50696fig10.jpg" /> Figur 10. Zoom-in av en del av den halve i hjernen er vist i figur 9, som viser en del av hippocampus og cortex. Skala bar, 200 mikrometer. <img alt="Figur 11" fo:content-width="4in" src="/files/ftp_upload/50696/50696fig11.jpg" /> Figur 11. Ytterligere zoom-i av en del av den halve hjernen er vist i figur 9.. Flere neurites i cortex tydelig forskjell. Scale bar, 50 mikrometer.

Watch this Scientific Journal Video about Micron-scale Resolution Optical Tomography of Entire Mouse Brains with Confocal Light Sheet Microscopy at JoVE.com

Micron-scale Resolution Optical Tomography of Entire Mouse Brains with Confocal Light Sheet Microscopy

I denne artikkelen beskriver vi full eksperimentell prosedyre for å rekonstruere, med høy oppløsning, den fine hjernen anatomi fluorescensmerkede mus hjerner. Den beskrevne protokollen omfatter prøveopparbeidelse og clearing prøven monterings for bildebehandling, data post-prosessering og multi-skala visualisering.

Micron-skala Resolution Optical Tomography av hele mus hjerner med Confocal Lett Sheet Mikros

Understanding the architecture of mammalian  brain at single-cell resolution is one of the key issues of neuroscience.  However, mapping neuronal soma and ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Optical Recording of Suprathreshold Neural Activity with Single-cell and Single-spike Resolution

Optisk registrering av suprathreshold nevrale aktiviteten med encellede og single-spike oppløsning

Signaling of information in the vertebrate central nervous system is often carried by populations of neurons rather than individual neurons. Also ...

Optical Coherence Tomography: Imaging Mouse Retinal Ganglion Cells In Vivo

Optical Coherence Tomography: Imaging Mouse Retinal Ganglion Cells In Vivo

Optical Coherence tomografi: Bildebehandling musen Retinal Ganglion celler i Vivo

Structural changes in the retina are common manifestations of ophthalmic diseases. Optical coherence tomography (OCT) enables their identification in ...

Visualization of Motor Axon Navigation and Quantification of Axon Arborization In Mouse Embryos Using Light Sheet Fluorescence Microscopy

Visualisering Motor Axon navigasjon og kvantifisering av Axon Arborization i Mouse embryoer bruker lys ark fluorescens mikroskopi

Spinal motor neurons (MNs) extend their axons to communicate with their innervating targets, thereby controlling movement and complex tasks in ...

Retinal Vascular Reactivity as Assessed by Optical Coherence Tomography Angiography

Retinal vaskulær reaktivitet som vurdert av optisk coherence tomografi angiografi

The vascular supply to the retina has been shown to dynamically adapt through vasoconstriction and vasodilation to accommodate the metabolic demands of ...

Free-floating Immunostaining of Mouse Brains

Frittflytende immunostaining av musehjerner

Immunohistochemical staining of mouse brains is a routine technique commonly used in neuroscience to investigate central mechanisms underlying the ...

Characterization of Neuromuscular Junctions in Mice by Combined Confocal and Super-Resolution Microscopy

Karakterisering av nevromuskulære veikryss hos mus ved kombinert konfokal og superoppløsningsmikroskopi

Neuromuscular junctions (NMJs) are highly specialized synapses between lower motor neurons and skeletal muscle fibers that play an essential role in the ...

Registration of Calcium Transients in Mouse Neuromuscular Junction with High Temporal Resolution using Confocal Microscopy

Registrering av kalsiumtransienter i mus Neuromuscular Junction med høy temporal oppløsning ved bruk av konfokal mikroskopi

Estimation of the presynaptic calcium level is a key task in studying synaptic transmission since calcium entry into the presynaptic cell triggers a ...

Coherent Anti-Stokes Raman Spectroscopy (CARS) Application for Imaging Myelination in Brain Slices

Coherent Anti-Stokes Raman Spectroscopy CARS Application for Imaging Myelination in Brain Slices

Coherent Anti-Stokes Raman spektroskopi (CARS) Søknad om bildebehandling av myelinasjon i hjerneskiver

Coherent anti-Stokes Raman spectroscopy (CARS) is a technique classically employed by chemists and physicists to produce a coherent signal of signature ...

Whole-Brain Single-Cell Imaging and Analysis of Intact Neonatal Mouse Brains Using MRI, Tissue Clearing, and Light-Sheet Microscopy

Helhjerne enkeltcelleavbildning og analyse av intakte neonatale musehjerner ved bruk av MR, vevsrydding og lysarkmikroskopi

Tissue clearing followed by light-sheet microscopy (LSFM) enables cellular-resolution imaging of intact brain structure, allowing quantitative analysis of ...

Imaging the Aging Cochlea with Light-Sheet Fluorescence Microscopy

Avbildning av den aldrende cochlea med lysarkfluorescensmikroskopi

Deafness is the most common sensory impairment, affecting approximately 5% or 430 million people worldwide as per the World Health Organization1. Aging or ...