Name: deriving the time course of glutamate clearance with a deconvolution analysis of astrocytic transporter currents
Uploaded: 2013-08-07T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Deriving the Time Course of Glutamate Clearance with a Deconvolution Analysis of Astrocytic Transporter Currents at JoVE.com

Detta arbete stöddes av National Institute of neurologiska sjukdomar och stroke Interna forskningsprogram (NS002986). AS skrev manus och genomfört deconvolution analysen. JSD utvecklade den första versionen av deconvolution analys och kommenterade texten.

Ett. Slice Förberedelser <ol><li> Bered 500 ml skivning / lagring lösning innehållande (i mM): 119 NaCl, 2,5 KCl, 0,5 CaCl2, 1,3 MgSO 4 · 7H 2 O, 4 MgCl2, 26,2 NaHCOs 3, en NaH 2 PO 4, och 22 glukos, 320 mOsm, pH 7,4 </li><li> Använd en 250 ml bägare för att förbereda en nedsänkning kammare för skivor, fyll det med 200 ml skivning / lagringslösning, värma den i ett vattenbad vid 34 ° C och bubbla det med 95% O 2, 5% CO...

<ol>
	<li>Ventura, R., Harris, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+relationships+between+hippocampal+synapses+and+astrocytes.">Three-dimensional relationships between hippocampal synapses and astrocytes.</a> J. Neurosci. 19, 6897-6906 (1999).</li><li>Witcher, M. R., Kirov, S. A., Harris, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasticity+of+perisynaptic+astroglia+during+synaptogenesis+in+the+mature+rat+hippocampus.">Plasticity of perisynaptic astroglia during synaptogenesis in the mature rat hippocampus.</a> Glia. 55, 13-23 (2007).</li><li>Danbolt, N. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glutamate+uptake.">Glutamate uptake.</a> Prog. Neurobiol. 65, 1-105 (2001).</li><li>Herman, M. A., Jahr, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+glutamate+concentration+in+hippocampal+slice.">Extracellular glutamate concentration in hippocampal slice.</a> J. Neurosci. 27, 9736-9741 (2007).</li><li>Arnth-Jensen, N., Jabaudon, D., Scanziani, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cooperation+between+independent+hippocampal+synapses+is+controlled+by+glutamate+uptake.">Cooperation between independent hippocampal synapses is controlled by glutamate uptake.</a> Nat. Neurosci. 5, 325-331 (2002).</li><li>Barbour, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+evaluation+of+synapse+independence.">An evaluation of synapse independence.</a> J. Neurosci. 21, 7969-7984 (2001).</li><li>Rusakov, D. A., Kullmann, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extrasynaptic+glutamate+diffusion+in+the+hippocampus:+ultrastructural+constraints,+uptake,+and+receptor+activation.">Extrasynaptic glutamate diffusion in the hippocampus: ultrastructural constraints, uptake, and receptor activation.</a> J. Neurosci. 18, 3158-3170 (1998).</li><li>Zerangue, N., Kavanaugh, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flux+coupling+in+a+neuronal+glutamate+transporter.">Flux coupling in a neuronal glutamate transporter.</a> Nature. 383, 634-637 (1038).</li><li>Eliasof, S., Jahr, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retinal+glial+cell+glutamate+transporter+is+coupled+to+an+anionic+conductance.">Retinal glial cell glutamate transporter is coupled to an anionic conductance.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 93, 4153-4158 (1996).</li><li>Wadiche, J. I., Amara, S. G., Kavanaugh, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ion+fluxes+associated+with+excitatory+amino+acid+transport.">Ion fluxes associated with excitatory amino acid transport.</a> Neuron. 15, 721-728 (1995).</li><li>Wadiche, J. I., Kavanaugh, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macroscopic+and+microscopic+properties+of+a+cloned+glutamate+transporter/chloride+channel.">Macroscopic and microscopic properties of a cloned glutamate transporter/chloride channel.</a> J. Neurosci. 18, 7650-7661 (1998).</li><li>Bergles, D. E., Jahr, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synaptic+activation+of+glutamate+transporters+in+hippocampal+astrocytes.">Synaptic activation of glutamate transporters in hippocampal astrocytes.</a> Neuron. 19, 1297-1308 (1997).</li><li>Diamond, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deriving+the+glutamate+clearance+time+course+from+transporter+currents+in+CA1+hippocampal+astrocytes:+transmitter+uptake+gets+faster+during+development.">Deriving the glutamate clearance time course from transporter currents in CA1 hippocampal astrocytes: transmitter uptake gets faster during development.</a> J. Neurosci. 25, 2906-2916 (2005).</li><li>Scimemi, A., Tian, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+transporters+regulate+glutamate+clearance,+NMDA+receptor+activation,+and+synaptic+plasticity+in+the+hippocampus.">Neuronal transporters regulate glutamate clearance, NMDA receptor activation, and synaptic plasticity in the hippocampus.</a> J. Neurosci. 29, 14581-14595 (2009).</li><li>Zuo, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isoflurane+enhances+glutamate+uptake+via+glutamate+transporters+in+rat+glial+cells.">Isoflurane enhances glutamate uptake via glutamate transporters in rat glial cells.</a> Neuroreport. 12, 1077-1080 (2001).</li><li>Barbour, B., Brew, H., Attwell, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrogenic+uptake+of+glutamate+and+aspartate+into+glial+cells+isolated+from+the+salamander+(Ambystoma)+retina.">Electrogenic uptake of glutamate and aspartate into glial cells isolated from the salamander (Ambystoma) retina.</a> J. Physiol. 436, 169-193 (1991).</li><li>Bergles, D. E., Tzingounis, A. V., Jahr, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+coupled+and+uncoupled+currents+during+glutamate+uptake+by+GLT-1+transporters.">Comparison of coupled and uncoupled currents during glutamate uptake by GLT-1 transporters.</a> J. Neurosci. 22, 10153-10162 (2002).</li><li>Diamond, J. S., Jahr, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synaptically+released+glutamate+does+not+overwhelm+transporters+on+hippocampal+astrocytes+during+high-frequency+stimulation.">Synaptically released glutamate does not overwhelm transporters on hippocampal astrocytes during high-frequency stimulation.</a> J. Neurophysiol. 83, 2835-2843 (2000).</li><li>Benediktsson, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+activity+regulates+glutamate+transporter+dynamics+in+developing+astrocytes.">Neuronal activity regulates glutamate transporter dynamics in developing astrocytes.</a> Glia. 60, 175-188 (2012).</li><li>Hires, S. A., Zhu, Y., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+measurement+of+synaptic+glutamate+spillover+and+reuptake+by+linker+optimized+glutamate-sensitive+fluorescent+reporters.">Optical measurement of synaptic glutamate spillover and reuptake by linker optimized glutamate-sensitive fluorescent reporters.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 4411-4416 (2008).</li><li>Scimemi, A., Meabon, J., Woltjer, R. L., Sullivan, J. M., Diamond, J. S., Cook, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amyloid&#946;1-42+slows+clearance+of+synaptically-released+glutamate+by+mislocalizing+astrocytic+GLT-1.">Amyloid&#946;1-42 slows clearance of synaptically-released glutamate by mislocalizing astrocytic GLT-1.</a> J. Neurosci. 33, 5312-5318 (2013).</li></ol>

Här beskriver vi en experimentell metod för att få elektrofysiologiska inspelningar från astrocyter, en analytisk protokoll för att isolera glutamat transportör strömmar i astrocyter och en matematisk metod för att härleda tidsförloppet av glutamat clearance från astrocytiska transportör strömmar. Framgången av analysen bygger på förmågan att erhålla högkvalitativa inspelningar patch clamp från astrocyter och om riktigheten av de passande algoritmer som används för att ...

Astrocytes är en av de mest förekommande celltyper i hjärnan med stjärnformade morfologi och fina utsprång membran som sträcker sig genom hela neuropil och nå angränsande synaptic kontakter 1,2. De astrocyter &#39;cellmembranet är tätt packat med glutamat transportör molekyler 3. Under fysiologiska förhållanden, glutamat transportörer binder snabbt glutamat på den extracellulära sidan av membranet och överföra den till cellens cytoplasma. Genom att göra så, transportörerna upprätthålla låg den basala koncentrationen av glutamat i det extracellulära rummet 4. Glutamat transportörer i fina astrocytiska processer intill retande synapser är idealiskt positionerade för att binda glutamat frigörs under synaptiska händelser som den diffunderar bort från den synaptiska spalten. Genom att göra så, transportörerna begränsar också glutamat spillover mot peri-och extra-synaptiska regioner och på angränsande synapser, minskar den rumsliga spridningen av excitatoriska signalerer i hjärnan 5-7. Glutamat transporter är en electrogenic process stökiometriskt kopplad till rörelsen av 3 Na + och 1 H + längs sin elektrokemiska gradient och disk-transport av en K + 8. Glutamat transporter förknippas med (men inte stökiometriskt kopplad till) en anjonisk konduktans genomsläpplig för SCN - (tiocyanat)&gt; NO 3 - (nitrat) ≈ CIO 4 - (klorat)&gt; I -&gt; Br -&gt; Cl -&gt; F -, inte till CH 3 SO 3 - (metansulfonat) och C 6 H 11 O 7 - (glukonat) 9-11. Båda strömmar (stökiometrisk och icke-stökiometrisk) kan spelas in genom att erhålla hel-cell patch-clamp inspelningar från astrocyter, visuellt identifierats enligt Dodt belysning eller infrarött differential interferens kontrast (IR-DIC) i Acute hjärnsnitt 12. Den stökiometriska komponenten i den nuvarande förknippas med glutamat transport över membranet kan isoleras med hjälp av CH 3 SO 3 - eller C 6 H 11 O 7 - baserade intracellulära lösningar och kan framkallas av flash-uncaging glutamat på astrocyter 13,14, eller genom att aktivera glutamatfrisättning från angränsande synapser, antingen elektriskt 12 eller med en riktad optogenetic kontroll. Tidsförloppet för den stökiometriska komponenten av transportören strömmen formas av livslängden för glutamat koncentrationsprofilen på astrocytiska membran (dvs. glutamat clearance), kinetik glutamat transportörer, de passiva membran egenskaper astrocyter, och under synaptiska stimulering, vid synchronicity av glutamatfrisättning över de aktiverade synapser 13. Här beskriver vi i detalj: (1) en experimentell caoach att isolera den stökiometriska komponenten av glutamat transportör strömmar från hela-cell patch-clamp inspelningar från astrocyter med akut mus hippocampus skivor som exempel experimentell beredning, (2) ett analytiskt tillvägagångssätt att härleda tidsförloppet av glutamat clearance från dessa inspelningar 13 14. Dessa metoder kan användas för att registrera och analysera glutamat transportör strömmar från astrocyter i varje region i det centrala nervsystemet.

<table border="1">
		<tbody>
		 <tr>
			<td>Material Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalogue Number</td>
			<td>Comments </td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>CGP52432</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>1246</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>(R,S)-CPP</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>173</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>DPCPX</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>439</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>LY341495 disodium salt</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>4062</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>MSOP</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>803</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>NBQX disodium salt</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>1044</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>D,L-TBOA</td>
			<td>Tocis</td>
			<td>1223</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Picrotoxin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P1675</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>MNI-L-glutamate</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>1490</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Alexa 594</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A10438</td>
			<td>Optional</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Matrix electrodes</td>
			<td>Frederick Haer Company</td>
			<td>MX21AES(JD3)</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Borosilicate glass capillaries</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>PG10165-4</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Dual-stage glass micro-pipette puller</td>
			<td>Narishige</td>
			<td>PC-10</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Loctite 404 instant adhesive</td>
			<td>Ted Pella</td>
			<td>46551</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Xe lamp</td>
			<td>Rapp OptoElectronic</td>
			<td>FlashMic</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Igor Pro 6</td>
			<td>Wavemetrics</td>
			<td></td>
			<td></td>
		 </tr>
		</tbody>
 </table>

deriving the time course of glutamate clearance with a deconvolution analysis of astrocytic transporter currents

Den högsta tätheten av glutamat transportörer i hjärnan finns i astrocyter. Glutamat transportörer par rörelse glutamat över membranet med co-transport av 3 Na + och 1 H + och disk-transport av 1 K +. Den stökiometriska ström som genereras av transporter kan övervakas med hel-cell patch-clamp inspelningar från astrocyter. Tidsförloppet för den inspelade strömmen formas av tidsförloppet av glutamat koncentration profilen som astrocyter utsätts, kinetiken av glutamat transportörer, och de passiva electrotonic egenskaper astrocytic membran. Här beskriver vi de experimentella och analytiska metoder som kan användas för att spela in glutamat transportör strömmar i astrocyter och isolera tidsförloppet för glutamat godkännande från alla andra faktorer som formar vågformen av astrocytiska transportör strömmar. De metoder som beskrivs här kan användas för att uppskatta livstid of flash-uncaged och synaptically-utsläppt glutamat vid astrocytiska membran i varje region i centrala nervsystemet vid hälsa och sjukdom.

Framgången för det analytiska tillvägagångssätt som här beskrivs kritiskt beroende erhålla högkvalitativa elektrofysiologiska inspelningar av transportörer strömmar från astrocyter i varje region i det centrala nervsystemet. I akuta mus hippocampus skivor, kan astrocyter lätt identifieras enligt Dodt belysning eller IR-DIC grund av deras småcellig kropp (Ø = 10 um) och framstående kärnan (figur 1). Deras utmärkande stjärnformade morfologi kan uppskattas med epifluorescence, konfokal, e...

Watch this Scientific Journal Video about Deriving the Time Course of Glutamate Clearance with a Deconvolution Analysis of Astrocytic Transporter Currents at JoVE.com

Deriving the Time Course of Glutamate Clearance with a Deconvolution Analysis of Astrocytic Transporter Currents

Vi beskriver en analysmetod för att uppskatta livslängden för glutamat vid astrocytiska membran från elektrofysiologiska inspelningar av glutamat transportör strömmar i astrocyter.

Härledning tidsförloppet för Glutamat Räkenskapsavslutning en Deconvolution Analys av astrocytisk Transporter Currents

The highest density of glutamate transporters in the brain is found in astrocytes. Glutamate transporters couple the movement of glutamate across the ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Isolation of Sensory Neurons of Aplysia californica for Patch Clamp Recordings of Glutamatergic Currents

Isolation of Sensory Neurons of Aplysia californica for Patch Clamp Recordings of Glutamatergic Currents

Isolering av sensoriska neuroner av<em&gt; Aplysia californica</em&gt; För Patch Clamp Inspelningar av glutamaterg Currents

The marine gastropod mollusk Aplysia californica has a venerable  history as a model of nervous system function, with particular significance in  studies ...

Fast Micro-iontophoresis of Glutamate and GABA: A Useful Tool to Investigate Synaptic Integration

Snabb Micro-iontophoresis av glutamat och GABA: Ett användbart verktyg för att undersöka Synaptic Integration

One of the fundamental interests in neuroscience is to understand the integration of excitatory and inhibitory inputs along the very complex structure of ...

Inducing Plasticity of Astrocytic Receptors by Manipulation of Neuronal Firing Rates

Induktion Plasticitet hos astrocytiska Receptorer genom manipulering av neuron priser

Close to two decades of research has established that astrocytes in situ and in vivo express numerous G protein-coupled receptors (GPCRs) that can be ...

Multi-photon Intracellular Sodium Imaging Combined with UV-mediated Focal Uncaging of Glutamate in CA1 Pyramidal Neurons

Multi-foton Intracellular Natrium Imaging Kombinerat med UV-medierad Focal uncaging av glutamat i CA1 pyramidala nervceller

Multi-photon fluorescence microscopy has enabled the analysis of morphological and physiological parameters of brain cells in the intact tissue with high ...

3-D Imaging and Analysis of Neurons Infected In Vivo with Toxoplasma gondii

3-D Imaging and Analysis of Neurons Infected In Vivo with Toxoplasma gondii

3-D Imaging och analys av nervceller Infekterade<em&gt; In Vivo</em&gt; Med<em&gt; Toxoplasma gondii</em

Toxoplasma gondii is an obligate, intracellular parasite with a broad host range, including humans and rodents. In both humans and rodents, Toxoplasma ...

Peering at Brain Polysomes with Atomic Force Microscopy

Peering på Brain polysomer med atomkraftsmikroskopi

The translational machinery, i.e., the polysome or polyribosome, is one of the biggest and most complex cytoplasmic machineries in cells. Polysomes, ...

Using Enzyme-based Biosensors to Measure Tonic and Phasic Glutamate in Alzheimer's Mouse Models

Använda enzymbaserade biosensorer för att mäta tonic och phasic glutamat i Alzheimers musmodeller

Neurotransmitter disruption is often a key component of diseases of the central nervous system (CNS), playing a role in the pathology underlying ...

A Protocol for the Administration of Real-Time fMRI Neurofeedback Training

Ett protokoll för den Administration av Real-Time fMRI Neurofeedback träning

Neurologic disorders are characterized by abnormal cellular-, molecular-, and circuit-level functions in the brain. New methods to induce and control ...

Live Images of GLUT4 Protein Trafficking in Mouse Primary Hypothalamic Neurons Using Deconvolution Microscopy

Levande bilder av GLUT4 Protein människohandel mus primära hypotalamus nervceller använder Deconvolution mikroskopi

Type 2 diabetes mellitus (T2DM) is a global health crisis which is characterized by insulin signaling impairment and chronic inflammation in peripheral ...

Focal Macropatch Recordings of Synaptic Currents from the Drosophila Larval Neuromuscular Junction

Focal Macropatch Recordings of Synaptic Currents from the Drosophila Larval Neuromuscular Junction

Focal Macropatch inspelningar av Synaptic strömmar från den Drosophila Larval neuromuskulära förbindelsen

Drosophila neuromuscular junction (NMJ) is an excellent model system to study glutamatergic synaptic transmission. We describe the technique of focal ...