Name: a quantitative cell migration assay for murine enteric neural progenitors
Uploaded: 2013-09-18T15:15:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Quantitative Cell Migration Assay for Murine Enteric Neural Progenitors at JoVE.com

我々は、画像処理と解析アドバイスデニスFlipoに感謝し、デビッド·W·シルバーサイズが実験室でGata4p [5キロバイト]-GFPマウスラインが生成されました。ピロンの実験室での研究はCIHR、NSERC、FRQSとFRQNTによって資金を供給される。

倫理声明マウスを含む実験は医学研究に使用される動物の世話や操作のための動物実験ガイドラインのカナダの評議会後に実施された。動物の操作を含むプロトコルはモントリオールのケベック大学の施設内倫理委員会によって承認された（化委員会Institutionnelデ·保護DES Animaux、参照番号0512-R3-650から0513）。 1。コラーゲンゲルの調製<p class="jove_conten...

<ol>
	<li>Bronner, M. E., Le Douarin, N. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+evolution+of+the+neural+crest:+An+overview.">Development and evolution of the neural crest: An overview.</a> Dev. Biol. 366 (1), 2-9 (2012).</li><li>Bergeron, K. F., Silversides, D. W., Pilon, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+developmental+genetics+of+Hirschsprung's+disease.">The developmental genetics of Hirschsprung's disease.</a> Clin. Genet. 83 (1), 15-22 (2013).</li><li>Obermayr, F., Hotta, R., Enomoto, H., Young, H. 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P., Silos-Santiago, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Renal+agenesis+and+the+absence+of+enteric+neurons+in+mice+lacking+GDNF.">Renal agenesis and the absence of enteric neurons in mice lacking GDNF.</a> Nature. 382 (6586), 70-73 (1996).</li><li>Baynash, A. G., Hosoda, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interaction+of+endothelin-3+with+endothelin-B+receptor+is+essential+for+development+of+epidermal+melanocytes+and+enteric+neurons.">Interaction of endothelin-3 with endothelin-B receptor is essential for development of epidermal melanocytes and enteric neurons.</a> Cell. 79 (7), 1277-1285 (1994).</li><li>Chalazonitis, A., Pham, T. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurotrophin-3+is+required+for+the+survival-differentiation+of+subsets+of+developing+enteric+neurons.">Neurotrophin-3 is required for the survival-differentiation of subsets of developing enteric neurons.</a> J. Neurosci. 21 (15), 5620-5636 (2001).</li><li>Goldstein, A. M., Brewer, K. C., Doyle, A. M., Nagy, N., Roberts, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BMP+signaling+is+necessary+for+neural+crest+cell+migration+and+ganglion+formation+in+the+enteric+nervous+system.">BMP signaling is necessary for neural crest cell migration and ganglion formation in the enteric nervous system.</a> Mech. Dev. 122 (6), 821-833 (2005).</li><li>Jiang, Y., Liu, M. T., Gershon, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Netrins+and+DCC+in+the+guidance+of+migrating+neural+crest-derived+cells+in+the+developing+bowel+and+pancreas.">Netrins and DCC in the guidance of migrating neural crest-derived cells in the developing bowel and pancreas.</a> Dev. Biol. 258 (2), 364-384 (2003).</li><li>Ramalho-Santos, M., Melton, D. A., McMahon, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hedgehog+signals+regulate+multiple+aspects+of+gastrointestinal+development.">Hedgehog signals regulate multiple aspects of gastrointestinal development.</a> Development. 127 (12), 2763-2772 (2000).</li><li>Natarajan, D., Marcos-Gutierrez, C., Pachnis, V., de Graaf, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Requirement+of+signaling+by+receptor+tyrosine+kinase+RET+for+the+directed+migration+of+enteric+nervous+system+progenitor+cells+during+mammalian+embryogenesis.">Requirement of signaling by receptor tyrosine kinase RET for the directed migration of enteric nervous system progenitor cells during mammalian embryogenesis.</a> Development. 129 (22), 5151-5160 (2002).</li><li>Young, H. M., Hearn, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GDNF+Is+a+chemoattractant+for+enteric+neural+cells.">GDNF Is a chemoattractant for enteric neural cells.</a> Dev. Biol. 229 (2), 503-516 (2001).</li><li>Amiel, J., Sproat-Emison, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hirschsprung+disease,+associated+syndromes+and+genetics:+a+review.">Hirschsprung disease, associated syndromes and genetics: a review.</a> J. Med. Genet. 45 (1), 1-14 (2008).</li><li>Pilon, N., Raiwet, D., Viger, R. S., Silversides, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+pre-+and+post-gastrulation+expression+of+Gata4+within+cells+of+the+inner+cell+mass+and+migratory+neural+crest+cells.">Novel pre- and post-gastrulation expression of Gata4 within cells of the inner cell mass and migratory neural crest cells.</a> Dev. Dyn. 237 (4), 1133-1143 (2008).</li><li>Nagy, N., Goldstein, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelin-3+regulates+neural+crest+cell+proliferation+and+differentiation+in+the+hindgut+enteric+nervous+system.">Endothelin-3 regulates neural crest cell proliferation and differentiation in the hindgut enteric nervous system.</a> Dev. Biol. 293 (1), 203-217 (2006).</li><li>Nagy, A., Gertsenstein, M., Vintersen, K., Behringer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Manipulating the mouse embryo: a laboratory manual. , 209-250 (2003).</li><li>Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NIH+Image+to+ImageJ:+25+years+of+image+analysis.">NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis.</a> Nat. Methods. 9, 671-675 (2012).</li><li>Byth, K. F., Thomas, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=AZD5438,+a+potent+oral+inhibitor+of+cyclin-dependent+kinases+1,+2,+and+9,+leads+to+pharmacodynamic+changes+and+potent+antitumor+effects+in+human+tumor+xenografts.">AZD5438, a potent oral inhibitor of cyclin-dependent kinases 1, 2, and 9, leads to pharmacodynamic changes and potent antitumor effects in human tumor xenografts.</a> Mol. Cancer Ther. 8 (7), 1856-1866 (2009).</li></ol>

我々のex vivoでの外植片培養技術を正確GDNFの存在下で腸溶性NCCの移行の可能性を定量化するために使用することができる方法を示す。このような正確な定量が大幅に以前に11,12,15を説明するように、厚さ200μmのビブラトーム腸のセクションを使用しての代わりに、おおよその大きさの大部分によって容易になる。確かに、これは、私たちは再現性の高い環境でのセルの合理的な?...

神経堤細胞（NCC）は、胚発生の間に多くのデリバティブを形成している脊椎動物に特有の過渡的な細胞型である。この細胞集団は、非神経外胚葉1に隣接して、神経板の境界で生じる。神経胚形成の間に、神経板の曲げ成形神経管の背側縁に沿って、NCCが配置されます。 NCCは、その後分離し、離れて神経管からの移行、上皮間葉転移を受ける。 NCCは、彼らが全体の腸管神経系（ENS）、腸の壁に埋め込まれた神経の神経節の相互接続されたネットワークを形成し、消化管を含む様々な胚の構造を、植民地化。最近2,3日のように、多くの遺伝子がこの複雑な構造の開発に携わってきました。 ENSのほとんどは（ つまり、将来の後脳/脊髄の境界付近）迷走神経管からのNCC発信の小さなプールに由来している4。これらの神経前駆細胞は、マウスでは胎生（E）9.0を中心に前腸に到達してから、全体胚性腸にコロニーを形成するのに約e15.0までの消化管間葉内で尾側に移行します。結腸の神経前駆細胞の小サブセットはまた、最大盲腸4と反対方向に後方腸に侵入仙骨NCCによって提供される。迷走神経と仙骨の両方NCCは、ENSの完全な形成を確実にするために、複数の移行、増殖、生存および分化を促進する手がかりが必要になります。 GDNF（グリア細胞由来神経栄養因子）、エンドセリン-3、ニューロトロフィン3、BMPは（骨形成タンパク質）、ネトリン：この点では、動物モデル - - 特に遺伝子改変マウスは、いくつかの不可欠な細胞外リガンドの同定に尽力されてきただけでなく、ソニックとインディアンヘッジホッグ（ShhおよびIhhは）5月10日 。これらのうち、（トランスフェクション中に再配列）チロシンキナーゼ膜貫通受容体を介したシグナル伝達RET GDNFは番目として認識される胚性腸へと内魅力とNCCの指導のための電子の最も重要な経路。 GDNFは消化管間葉から分泌され、RET 11,12を表現腸NCCに直接化学誘引である時空間的に制御rosrrocaudal勾配を形成している。 他の機能の中でも、ENSは、腸壁内の平滑筋との相互作用を介して、消化管内での移動を規制する。ヒルシュスプルング病における腸結果の末端領域の神経の神経節が存在しない場合：影響を受けたセグメントの強壮収縮が詰まり、消化された材料の上流に蓄積し、腸や腹部の大規模な膨満につながる。ヒルシュスプルング病は、およそ1 5000での出生数を発生します。腸溶NCCの吻側 - 尾側移行パターンは、ヒルシュスプルング病の病因に主要な寄与因子であると考えられている。コロン、NCCの移行のソースから最も遠いとBの最後の部分植民地化されるowelは、ENS形成における欠陥の影響を最も受けている。腸溶NCC遊走におけるその重要な役割に応じて、GDNF / RETシグナル伝達の破壊は、ヒルシュスプルング病13の主既知の遺伝的原因である。 [5キロバイト]-GFP 14 Gata4p命名- -回遊NCCは、緑色蛍光タンパク質（GFP）で標識された良好なNCCとENSの発達を研究するために、我々は、トランスジェニックマウス系統を生成した。我々は次に、現在では、GDNFのような種々の成長因子の存在下で腸溶性NCC移行電位の正確な定量化を可能にする他のグループ11,12,15によって発表された研究から適合ex vivoでの細胞遊走アッセイを、完成。

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>DMEM powder</td>
			<td>Wisent</td>
			<td>219-010-XK</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaHCO3</td>
			<td>Bioshop</td>
			<td>SOB999</td>
			<td>Biotechnology grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Steriflip vacuum filtration system (0.22 micron)</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>SCGP00525</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicilin-Streptomycin solution, 100x</td>
			<td>Wisent</td>
			<td>450-201-EL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>Wisent</td>
			<td>095-150</td>
			<td>High quality grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagen I</td>
			<td>BD biosciences</td>
			<td>354236</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOH</td>
			<td>Bioshop</td>
			<td>SHY700</td>
			<td>Diluted from 10 N stock then sterile-filtered</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GDNF</td>
			<td>Cedarlane</td>
			<td>CLCYT305</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon 24-well Plate</td>
			<td>BD biosciences</td>
			<td>353047</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting scissors</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>089515</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Petri dish</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89000-306</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P5493</td>
			<td>Cell culture grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>M125</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #5 Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11251-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Bioshop</td>
			<td>AGA001</td>
			<td>Biotechnology grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical blade</td>
			<td>Feather</td>
			<td>21</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>All Purpose Instant Krazy Glue Pen</td>
			<td>Krazy Glue</td>
			<td>KG824</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HM 650V Vibrating-Blade Microtome</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>920110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P6148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D9564</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a quantitative cell migration assay for murine enteric neural progenitors

神経堤細胞（NCC）は、背側神経管に由来し、開発脊椎動物の胚全体で広範囲に移動し、一過性および多能細胞集団である。末梢グリアおよびニューロンを提供することに加えて、NCCはメラノサイトだけでなく、頭蓋顔面骨格の大部分を生成します。 NCC遊走および分化は、神経管に沿った軸方向の原点と地域の異なる細胞外の合図への曝露との組み合わせによって制御される。細胞外のリガンドのような貢献は、腸神経系（ENS）、ローカルに（特に）を制御する神経核の複雑な相互接続されたネットワーク腸の筋肉の動きや腸の運動を形成する際に特に顕著である。尾ファッションに吻側に - - 将来の腸の全長にENSのほとんどが植民地化するために長い旅に着手するNCCの小さな初期プールに由来している。知られているいくつかのシグナル伝達経路のうち、腸NCCのコロニー形成に影響を与え、GDNF / RETシグナル伝達は、最も重要なものとして認識されている。確かに、消化管間葉によるRETリガンドGDNFの時空間的に制御された分泌は、胚性腸へと内誘引およびRET発現腸NCCの指導のために主に責任があります。ここでは、GDNFを含む様々な成長因子の存在下で腸溶性NCC移行電位の正確な定量化を可能にする蛍光標識されたNCCを有するトランスジェニックマウス系統を利用して、ex vivoでの細胞遊走アッセイを記載している。

以下の結果は、ここで記載された技術（ 図1）で得られるものの代表である。増殖因子の使用（ すなわち、GDNF）は、腸の外植片からコラーゲンゲル（ 図2）にGFPを発現する腸溶性NCCの遊走を刺激する。一部の細胞は、成長因子の非存在下で外植片から出てくるが、これらは主にGFP-標識されず、パッシブエントリーを表す。この組織はまだ頻繁に蛍光細胞によ?...

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A Quantitative Cell Migration Assay for Murine Enteric Neural Progenitors

我々は、様々な成長因子の存在下での腸溶神経堤細胞の遊走電位の正確な定量を可能にex vivoで細胞遊走アッセイを提示する。

マウス腸の神経前駆細胞の定量細胞遊走アッセイ

Neural crest cells (NCC) are a transient and multipotent cell population that originates from the dorsal neural tube and migrates extensively throughout ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

A Thin-skull Window Technique for Chronic Two-photon In vivo Imaging of Murine Microglia in Models of Neuroinflammation

A Thin-skull Window Technique for Chronic Two-photon In vivo Imaging of Murine Microglia in Models of Neuroinflammation

慢性二光子用薄型頭蓋骨のウィンドウテクニック in vivoで</em神経炎症のモデルのマウスミクログリアの>イメージング

Traditionally in neuroscience, in vivo two photon imaging of the murine central nervous system has either involved the use of open-skull1,2 or ...

Establishing Embryonic Mouse Neural Stem Cell Culture Using the Neurosphere Assay

ニューロスフェアのアッセイを使用してマウス胎児神経幹細胞培養の確立

In mammalians, stem cells acts as a source of undifferentiated cells to maintain cell genesis and renewal in different tissues and organs during the life ...

Neural-Colony Forming Cell Assay: An Assay To Discriminate Bona Fide Neural Stem Cells from Neural Progenitor Cells

神経コロニー形成細胞アッセイ：神経前駆細胞から善意の神経幹細胞を区別するアッセイ

The neurosphere assay (NSA) is one of the most frequently used methods to isolate, expand and also calculate the frequency of neural stem cells (NSCs). ...

Analysis of Trunk Neural Crest Cell Migration using a Modified Zigmond Chamber Assay

修正Zigmondチャンバーアッセイを使用してトランク神経冠細胞移動の解析

Neural crest cells (NCCs) are a transient population of cells present in vertebrate development that emigrate from the dorsal neural tube (NT) after ...

Reproducible Mouse Sciatic Nerve Crush and Subsequent Assessment of Regeneration by Whole Mount Muscle Analysis

ホールマウントマッスル分析による再現性のあるマウスの坐骨神経クラッシュと再生のその後の評価

Regeneration in the peripheral nervous system (PNS) is widely studied both for its relevance to human disease and to understand the robust regenerative ...

Analysis of Neural Crest Migration and Differentiation by Cross-species Transplantation

クロス種の移植による神経堤の移行および分化の解析

Avian embryos provide a unique platform for studying many vertebrate developmental processes, due to the easy access of the embryos within the egg. ...

The Neuroblast Assay: An Assay for the Generation and Enrichment of Neuronal Progenitor Cells from Differentiating Neural Stem Cell Progeny Using Flow Cytometry

神経芽細胞アッセイ：フローサイトメトリーを用いて神経幹細胞の子孫を差別から神経前駆細胞の生成と濃縮のためのアッセイ

Neural stem cells (NSCs) can be isolated and expanded in large-scale, using the neurosphere assay and differentiated into the three major cell types of ...

Isolation and Culture of Neural Crest Cells from Embryonic Murine Neural Tube

胎児マウス神経管から神経堤細胞の単離および培養

The embryonic neural crest (NC) is a multipotent progenitor population that originates at the dorsal aspect of the neural tube, undergoes an epithelial to ...

An Optimized Procedure for Fluorescence-activated Cell Sorting (FACS) Isolation of Autonomic Neural Progenitors from Visceral Organs of Fetal Mice

An Optimized Procedure for Fluorescence-activated Cell Sorting FACS Isolation of Autonomic Neural Progenitors from Visceral Organs of Fetal Mice

蛍光活性化細胞選別（FACS）胎児マウスの内臓からの自律神経前駆細胞の分離用に最適化された手順

During development neural crest (NC)-derived neuronal progenitors migrate away from the neural tube to form autonomic ganglia in visceral organs like the ...

A Galvanotaxis Assay for Analysis of Neural Precursor Cell Migration Kinetics in an Externally Applied Direct Current Electric Field

外部から印加された直流電界における神経前駆細胞の移行動態の解析のための走電性アッセイ

The discovery of neural stem and progenitor  cells (collectively termed neural precursor cells) (NPCs) in the adult  mammalian brain has led to a body of ...