Name: a quantitative cell migration assay for murine enteric neural progenitors
Uploaded: 2013-09-18T15:15:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Quantitative Cell Migration Assay for Murine Enteric Neural Progenitors at JoVE.com

Agradecemos Denis Flipo para o conselho de processamento e análise de imagem, e David W. Silversides em cujo laboratório a linha de rato Gata4p [5kb]-GFP foi gerada. Pesquisas em laboratório Pilon é financiado pelo CIHR, NSERC, FRQS e FRQNT.

Declaração de Ética Experimentos envolvendo camundongos foram realizadas seguindo Conselho Canadense de diretrizes de cuidados com animais para o cuidado e manipulação de animais utilizados em pesquisas médicas. Protocolos que envolvem a manipulação de animais foram aprovados pelo comitê de ética institucional da Universidade do Quebec em Montreal (Comité Institutionnel de Proteção des Animaux; número de referência 0512-R3-650-0513). 1. Preparação de ...

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	<li>Bronner, M. E., Le Douarin, N. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+evolution+of+the+neural+crest:+An+overview.">Development and evolution of the neural crest: An overview.</a> Dev. Biol. 366 (1), 2-9 (2012).</li><li>Bergeron, K. F., Silversides, D. W., Pilon, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+developmental+genetics+of+Hirschsprung's+disease.">The developmental genetics of Hirschsprung's disease.</a> Clin. Genet. 83 (1), 15-22 (2013).</li><li>Obermayr, F., Hotta, R., Enomoto, H., Young, H. 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J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GDNF+Is+a+chemoattractant+for+enteric+neural+cells.">GDNF Is a chemoattractant for enteric neural cells.</a> Dev. Biol. 229 (2), 503-516 (2001).</li><li>Amiel, J., Sproat-Emison, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hirschsprung+disease,+associated+syndromes+and+genetics:+a+review.">Hirschsprung disease, associated syndromes and genetics: a review.</a> J. Med. Genet. 45 (1), 1-14 (2008).</li><li>Pilon, N., Raiwet, D., Viger, R. S., Silversides, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+pre-+and+post-gastrulation+expression+of+Gata4+within+cells+of+the+inner+cell+mass+and+migratory+neural+crest+cells.">Novel pre- and post-gastrulation expression of Gata4 within cells of the inner cell mass and migratory neural crest cells.</a> Dev. Dyn. 237 (4), 1133-1143 (2008).</li><li>Nagy, N., Goldstein, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelin-3+regulates+neural+crest+cell+proliferation+and+differentiation+in+the+hindgut+enteric+nervous+system.">Endothelin-3 regulates neural crest cell proliferation and differentiation in the hindgut enteric nervous system.</a> Dev. Biol. 293 (1), 203-217 (2006).</li><li>Nagy, A., Gertsenstein, M., Vintersen, K., Behringer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Manipulating the mouse embryo: a laboratory manual. , 209-250 (2003).</li><li>Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NIH+Image+to+ImageJ:+25+years+of+image+analysis.">NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis.</a> Nat. Methods. 9, 671-675 (2012).</li><li>Byth, K. F., Thomas, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=AZD5438,+a+potent+oral+inhibitor+of+cyclin-dependent+kinases+1,+2,+and+9,+leads+to+pharmacodynamic+changes+and+potent+antitumor+effects+in+human+tumor+xenografts.">AZD5438, a potent oral inhibitor of cyclin-dependent kinases 1, 2, and 9, leads to pharmacodynamic changes and potent antitumor effects in human tumor xenografts.</a> Mol. Cancer Ther. 8 (7), 1856-1866 (2009).</li></ol>

Nós mostramos como nosso ex vivo explante técnica de cultura pode ser usada para quantificar com precisão entérico potencial de migração NCC na presença de GDNF. Essa quantificação precisa é muito facilitada usando 200 seções vibratome intestino m de espessura em vez de grandes pedaços de tamanho aproximado, como descrito anteriormente 11,12,15. Na verdade, isso nos permite trabalhar com um número razoável de células em um ambiente altamente reprodutível. De nota, a distribuição un...

Células da crista neural (NCC) são um tipo de célula transitória única de vertebrados que forma muitos derivados durante o desenvolvimento do embrião. Esta população de células surge na fronteira da placa neural, ao lado ectoderma não-neural 1. Durante neurulação, curvatura da placa neural NCC lugares ao longo do bordo dorsal do tubo neural formando. NCC então sofrer uma transição epitelial-mesenquimal, segregar e migrar para longe do tubo neural. NCC colonizar várias estruturas embrionárias, incluindo o tracto digestivo onde formam todo o sistema nervoso entérico (ENS), uma rede interligada de gânglios neurais embutido na parede do intestino. Como recentemente revisou de 2,3, muitos genes foram envolvidos no desenvolvimento desta estrutura intrincada. A maior parte do ENS é derivado de uma pequena piscina de NCC proveniente do tubo neural vagal (ou seja, em torno do potencial limite rombencéfalo / medula espinal) 4.Estes progenitores neurais chegar ao intestino anterior em torno do dia embrionário (e) 9,0 em ratos e depois migrar caudalmente dentro do mesênquima intestino até aproximadamente e15.0 para colonizar todo o intestino embrionárias. Um subconjunto menor de células progenitoras neurais cólon também é fornecida por sacral NCC, que invadem o intestino posterior na direcção oposta até ao ceco 4. Ambos vagal e sacral NCC requerem múltiplos migração, proliferação, sobrevivência e-sinais de promoção de diferenciação para garantir a formação completa do ENS. A este respeito, os modelos animais - especialmente ratos geneticamente modificados - têm sido fundamentais para a identificação de vários ligandos extracelulares essenciais: GDNF (factor neurotrófico derivado de células gliais),,, (proteínas morfogenéticas do osso) BMPs neurotrofina-3 endotelina-3, Netrin , assim como Sonic e indiano Hedgehog (Shh e Ihh) 5-10. Destes, o GDNF a sinalização através de RET receptor transmembranar da tirosina quinase (Rearranged durante a transfecção), é reconhecido como the caminho mais crítico para a atração e orientação do NCC e para dentro do intestino embrionário. O GDNF é secretada pelo mesênquima intestino e forma um gradiente rosrrocaudal espaço-temporalmente controlado, que é directamente quimioatratante para entérico NCC, que expressam RET 11,12. Entre outras funções, o ENS regula o movimento no interior do tracto digestivo através da sua interacção com o músculo liso na parede intestinal. Ausência de gânglios neural na região terminal dos resultados intestinais na doença de Hirschsprung: a contração tônica do segmento afetado leva ao bloqueio, a acumulação a montante do material digerido e distensão maciça do intestino e abdômen. Doença de Hirschsprung ocorre cerca de um em 5.000 nascidos vivos. O padrão de migração rostro-caudal de entérico NCC é acreditado para ser o principal fator de contribuição à etiologia da doença de Hirschsprung. O cólon, mais afastada da fonte de migrar NCC e última porção de bowel a ser colonizada, é mais suscetível a defeitos na formação ENS. De acordo com o seu papel crucial na migração NCC entérico, a interrupção da sinalização GDNF / RET é a principal causa genética conhecida da doença de Hirschsprung 13. Para melhor estudar NCC e desenvolvimento ENS, geramos uma linha de camundongo transgênico - chamado Gata4p [5kb]-GFP 14 - em que migratório NCC são rotulados com Proteína Fluorescente Verde (GFP). A seguir, aperfeiçoou um ensaio ex vivo, a migração celular, adaptado a partir de trabalhos publicados por outros grupos 11,12,15, que agora permite a quantificação precisa do potencial de migração entérico NCC na presença de vários factores de crescimento, tais como o GDNF.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>DMEM powder</td>
			<td>Wisent</td>
			<td>219-010-XK</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaHCO3</td>
			<td>Bioshop</td>
			<td>SOB999</td>
			<td>Biotechnology grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Steriflip vacuum filtration system (0.22 micron)</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>SCGP00525</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicilin-Streptomycin solution, 100x</td>
			<td>Wisent</td>
			<td>450-201-EL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>Wisent</td>
			<td>095-150</td>
			<td>High quality grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagen I</td>
			<td>BD biosciences</td>
			<td>354236</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOH</td>
			<td>Bioshop</td>
			<td>SHY700</td>
			<td>Diluted from 10 N stock then sterile-filtered</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GDNF</td>
			<td>Cedarlane</td>
			<td>CLCYT305</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon 24-well Plate</td>
			<td>BD biosciences</td>
			<td>353047</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting scissors</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>089515</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Petri dish</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89000-306</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P5493</td>
			<td>Cell culture grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>M125</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #5 Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11251-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Bioshop</td>
			<td>AGA001</td>
			<td>Biotechnology grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical blade</td>
			<td>Feather</td>
			<td>21</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>All Purpose Instant Krazy Glue Pen</td>
			<td>Krazy Glue</td>
			<td>KG824</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HM 650V Vibrating-Blade Microtome</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>920110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P6148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D9564</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a quantitative cell migration assay for murine enteric neural progenitors

Células da crista neural (NCC) é uma população de células multipotentes transitória e que se origina a partir do tubo neural dorsal e migra extensivamente em todo o embrião de vertebrados em desenvolvimento. Além de proporcionar a glia e os neurónios periféricos, NCC gerar melanócitos, bem como a maior parte do esqueleto crânio-faciais. A migração e diferenciação NCC é controlada por uma combinação da sua origem axial ao longo do tubo neural e sua exposição a estímulos extracelulares regionalmente distintas. Tal contribuição de ligandos extracelulares é especialmente evidente durante a formação do sistema nervoso entérico (ENS), uma rede de complexo interligado de gânglios neurais que controla localmente (entre outras coisas) o movimento do músculo do intestino e motilidade intestinal. A maior parte do ENS é derivado a partir de um pequeno conjunto inicial de NCC que empreender um longo percurso, a fim de colonizar - num rostral para caudal moda - todo o comprimento do intestino prospectivo. Entre as várias vias de sinalização conhecidosinfluenciar colonização NCC entérico, GDNF / sinalização RET é reconhecido como o mais importante. Na verdade, a secreção de espaço-temporalmente controlada do RET ligante GDNF pelo mesênquima intestino é o principal responsável para a atração e orientação de expressar-RET entérico NCC para e dentro do intestino embrionário. Aqui, nós descrevemos um ensaio ex vivo, a migração de células, fazendo uso de uma linha de ratinho transgénico possuindo marcado por fluorescência NCC, que permite a quantificação precisa do potencial de migração entérico NCC na presença de vários factores de crescimento, incluindo o GDNF.

Os seguintes resultados são representativos do que pode ser obtida com a técnica descrita aqui (Figura 1). O uso de factores de crescimento (isto é, de GDNF) estimula a migração dos entérico NCC fora do explante intestinal e no gel de colagénio-expressando GFP (Figura 2). Embora algumas células sair do explante, na ausência de factores de crescimento, estes não são mais marcadas com GFP e representam entrada passiva. É necessário remover a fatia intestinal a partir...

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A Quantitative Cell Migration Assay for Murine Enteric Neural Progenitors

Apresenta-se um ensaio de migração de células ex vivo que permite a quantificação precisa do potencial de migração de células de crista neural entérico na presença de vários factores de crescimento.

Um ensaio de migração celular quantitativo para murinos progenitores neurais entéricas

Neural crest cells (NCC) are a transient and multipotent cell population that originates from the dorsal neural tube and migrates extensively throughout ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

A Thin-skull Window Technique for Chronic Two-photon In vivo Imaging of Murine Microglia in Models of Neuroinflammation

A Thin-skull Window Technique for Chronic Two-photon In vivo Imaging of Murine Microglia in Models of Neuroinflammation

A Técnica de Janela crânio-fino para Crônica de dois fótons In vivo Imaging da Microglia murino em Modelos de Neuroinflammation

Traditionally in neuroscience, in vivo two photon imaging of the murine central nervous system has either involved the use of open-skull1,2 or ...

Neurociência

Establishing Embryonic Mouse Neural Stem Cell Culture Using the Neurosphere Assay

Estabelecer embrionárias de rato Cultura de Células-tronco neurais utilizando o ensaio Neurosphere

In mammalians, stem cells acts as a source of undifferentiated cells to maintain cell genesis and renewal in different tissues and organs during the life ...

Neural-Colony Forming Cell Assay: An Assay To Discriminate Bona Fide Neural Stem Cells from Neural Progenitor Cells

Neurais Colony-Forming Assay Cell: um ensaio para Discriminar Bona Fide células-tronco neurais de células progenitoras neurais

The neurosphere assay (NSA) is one of the most frequently used methods to isolate, expand and also calculate the frequency of neural stem cells (NSCs). ...

Analysis of Trunk Neural Crest Cell Migration using a Modified Zigmond Chamber Assay

Análise de Tronco de Migração da crista neural celular usando uma modificação Zigmond Ensaio Câmara

Neural crest cells (NCCs) are a transient population of cells present in vertebrate development that emigrate from the dorsal neural tube (NT) after ...

Reproducible Mouse Sciatic Nerve Crush and Subsequent Assessment of Regeneration by Whole Mount Muscle Analysis

Reprodutível mouse esmagamento do nervo ciático e subsequente avaliação de Regeneração por Análise Whole Mount muscular

Regeneration in the peripheral nervous system (PNS) is widely studied both for its relevance to human disease and to understand the robust regenerative ...

Analysis of Neural Crest Migration and Differentiation by Cross-species Transplantation

Análise de migração da crista neural e Diferenciação por Cross-espécies de Transplantes

Avian embryos provide a unique platform for studying many vertebrate developmental processes, due to the easy access of the embryos within the egg. ...

The Neuroblast Assay: An Assay for the Generation and Enrichment of Neuronal Progenitor Cells from Differentiating Neural Stem Cell Progeny Using Flow Cytometry

O Ensaio neuroblasto: um ensaio para a Geração e Enriquecimento de células progenitoras neuronais de Diferenciando Progeny Neural Stem Cell utilizando citometria de fluxo

Neural stem cells (NSCs) can be isolated and expanded in large-scale, using the neurosphere assay and differentiated into the three major cell types of ...

Isolation and Culture of Neural Crest Cells from Embryonic Murine Neural Tube

Isolamento e cultivo de células da crista neural do tubo neural embrionário murino

The embryonic neural crest (NC) is a multipotent progenitor population that originates at the dorsal aspect of the neural tube, undergoes an epithelial to ...

An Optimized Procedure for Fluorescence-activated Cell Sorting (FACS) Isolation of Autonomic Neural Progenitors from Visceral Organs of Fetal Mice

An Optimized Procedure for Fluorescence-activated Cell Sorting FACS Isolation of Autonomic Neural Progenitors from Visceral Organs of Fetal Mice

Um procedimento otimizado para fluorescência-ativado Isolamento classificação celular (FACS) da Autônomo progenitores neurais a partir de vísceras de ratos fetais

During development neural crest (NC)-derived neuronal progenitors migrate away from the neural tube to form autonomic ganglia in visceral organs like the ...

A Galvanotaxis Assay for Analysis of Neural Precursor Cell Migration Kinetics in an Externally Applied Direct Current Electric Field

Um Ensaio Galvanotaxis para Análise de Precursores Neurais Cinética migração celular em um campo aplicado externamente Corrente Contínua Elétrica

The discovery of neural stem and progenitor  cells (collectively termed neural precursor cells) (NPCs) in the adult  mammalian brain has led to a body of ...