Name: a quantitative cell migration assay for murine enteric neural progenitors
Uploaded: 2013-09-18T15:15:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Quantitative Cell Migration Assay for Murine Enteric Neural Progenitors at JoVE.com

Мы благодарим Дениса Флипо для обработки и анализа изображений советом, и Дэвид У. Silversides в лаборатории которого был создан Gata4p [5kb]-GFP мыши линии. Исследования в лаборатории Пилон финансируется CIHR, NSERC, FRQS и FRQNT.

Заявление Этика Опыты с мышами проводились следующие Канадского совета руководящих принципов по уходу за животными для ухода и манипуляции животных, используемых в медицинских исследованиях. Протоколы с участием манипуляции животных были утверждены комитетом институ?...

<ol>
	<li>Bronner, M. E., Le Douarin, N. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+evolution+of+the+neural+crest:+An+overview.">Development and evolution of the neural crest: An overview.</a> Dev. Biol. 366 (1), 2-9 (2012).</li><li>Bergeron, K. F., Silversides, D. W., Pilon, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+developmental+genetics+of+Hirschsprung's+disease.">The developmental genetics of Hirschsprung's disease.</a> Clin. Genet. 83 (1), 15-22 (2013).</li><li>Obermayr, F., Hotta, R., Enomoto, H., Young, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+developmental+disorders+of+the+enteric+nervous+system.">Development and developmental disorders of the enteric nervous system.</a> Nat. Rev. Gastroenterol. Hepatol. 10 (1), 43-57 (2012).</li><li>Sasselli, V., Pachnis, V., Bursn, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+enteric+nervous+system.">The enteric nervous system.</a> Dev. Biol. 366 (1), 64-73 (2012).</li><li>Sanchez, M. P., Silos-Santiago, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Renal+agenesis+and+the+absence+of+enteric+neurons+in+mice+lacking+GDNF.">Renal agenesis and the absence of enteric neurons in mice lacking GDNF.</a> Nature. 382 (6586), 70-73 (1996).</li><li>Baynash, A. G., Hosoda, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interaction+of+endothelin-3+with+endothelin-B+receptor+is+essential+for+development+of+epidermal+melanocytes+and+enteric+neurons.">Interaction of endothelin-3 with endothelin-B receptor is essential for development of epidermal melanocytes and enteric neurons.</a> Cell. 79 (7), 1277-1285 (1994).</li><li>Chalazonitis, A., Pham, T. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurotrophin-3+is+required+for+the+survival-differentiation+of+subsets+of+developing+enteric+neurons.">Neurotrophin-3 is required for the survival-differentiation of subsets of developing enteric neurons.</a> J. Neurosci. 21 (15), 5620-5636 (2001).</li><li>Goldstein, A. M., Brewer, K. C., Doyle, A. M., Nagy, N., Roberts, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BMP+signaling+is+necessary+for+neural+crest+cell+migration+and+ganglion+formation+in+the+enteric+nervous+system.">BMP signaling is necessary for neural crest cell migration and ganglion formation in the enteric nervous system.</a> Mech. Dev. 122 (6), 821-833 (2005).</li><li>Jiang, Y., Liu, M. T., Gershon, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Netrins+and+DCC+in+the+guidance+of+migrating+neural+crest-derived+cells+in+the+developing+bowel+and+pancreas.">Netrins and DCC in the guidance of migrating neural crest-derived cells in the developing bowel and pancreas.</a> Dev. Biol. 258 (2), 364-384 (2003).</li><li>Ramalho-Santos, M., Melton, D. A., McMahon, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hedgehog+signals+regulate+multiple+aspects+of+gastrointestinal+development.">Hedgehog signals regulate multiple aspects of gastrointestinal development.</a> Development. 127 (12), 2763-2772 (2000).</li><li>Natarajan, D., Marcos-Gutierrez, C., Pachnis, V., de Graaf, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Requirement+of+signaling+by+receptor+tyrosine+kinase+RET+for+the+directed+migration+of+enteric+nervous+system+progenitor+cells+during+mammalian+embryogenesis.">Requirement of signaling by receptor tyrosine kinase RET for the directed migration of enteric nervous system progenitor cells during mammalian embryogenesis.</a> Development. 129 (22), 5151-5160 (2002).</li><li>Young, H. M., Hearn, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GDNF+Is+a+chemoattractant+for+enteric+neural+cells.">GDNF Is a chemoattractant for enteric neural cells.</a> Dev. Biol. 229 (2), 503-516 (2001).</li><li>Amiel, J., Sproat-Emison, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hirschsprung+disease,+associated+syndromes+and+genetics:+a+review.">Hirschsprung disease, associated syndromes and genetics: a review.</a> J. Med. Genet. 45 (1), 1-14 (2008).</li><li>Pilon, N., Raiwet, D., Viger, R. S., Silversides, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+pre-+and+post-gastrulation+expression+of+Gata4+within+cells+of+the+inner+cell+mass+and+migratory+neural+crest+cells.">Novel pre- and post-gastrulation expression of Gata4 within cells of the inner cell mass and migratory neural crest cells.</a> Dev. Dyn. 237 (4), 1133-1143 (2008).</li><li>Nagy, N., Goldstein, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelin-3+regulates+neural+crest+cell+proliferation+and+differentiation+in+the+hindgut+enteric+nervous+system.">Endothelin-3 regulates neural crest cell proliferation and differentiation in the hindgut enteric nervous system.</a> Dev. Biol. 293 (1), 203-217 (2006).</li><li>Nagy, A., Gertsenstein, M., Vintersen, K., Behringer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Manipulating the mouse embryo: a laboratory manual. , 209-250 (2003).</li><li>Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NIH+Image+to+ImageJ:+25+years+of+image+analysis.">NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis.</a> Nat. Methods. 9, 671-675 (2012).</li><li>Byth, K. F., Thomas, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=AZD5438,+a+potent+oral+inhibitor+of+cyclin-dependent+kinases+1,+2,+and+9,+leads+to+pharmacodynamic+changes+and+potent+antitumor+effects+in+human+tumor+xenografts.">AZD5438, a potent oral inhibitor of cyclin-dependent kinases 1, 2, and 9, leads to pharmacodynamic changes and potent antitumor effects in human tumor xenografts.</a> Mol. Cancer Ther. 8 (7), 1856-1866 (2009).</li></ol>

Мы покажем, как наш бывший естественных техника культура эксплант можно использовать для точного количественного кишечно NCC миграционный потенциал в присутствии GDNF. Такое точное количественное значительно облегчается с помощью 200 мкм-толстые секции Vibratome кишки вместо большие ку?...

Клетки нервного гребня (NCC) являются переходным типом клеток уникальным для позвоночных, которая формирует множество производных во время развития эмбриона. Это популяция клеток возникает на границе нервной пластинки, рядом с не-нейронных эктодермы 1. Во время нейруляции, изгиб нервной пластинки мест NCC вдоль верхнего края формирующегося нервной трубки. Затем НКК пройти переход эпителиально-мезенхимальных, разделения и миграции от нервной трубки. NCC колонизируют различные эмбриональные структуры, в том числе желудочно-кишечного тракта, где они образуют весь кишечно нервную систему (ENS), взаимосвязанной сети нейронной ганглиев, встроенного в стенку кишечника. Совсем недавно, отзывы 2,3, многие гены были вовлечены в разработку этой сложной структуры. Большую часть ENS происходит от небольшой пул NCC происходящих из блуждающего нервной трубки (т.е. вокруг предполагаемой границы заднего мозга / спинного мозга) 4.Эти нервные клетки-предшественники достичь передней кишки вокруг эмбриональный день (е) 9,0 у мышей, а затем мигрируют каудально в кишечнике мезенхимы до примерно e15.0 не колонизировать весь эмбриональных кишечник. Несовершеннолетний подмножество толстой нейронных клеток-предшественников также обеспечивается сакральной NCC, который вторгнуться заднюю кишку в противоположном направлении до слепой кишки 4. Оба блуждающего и крестцового NCC требуют несколько миграция-, нераспространения, выживание-и дифференциация способствующих сигналы, чтобы обеспечить полное формирование ENS. В связи с этим, модели животных - особенно генетически модифицированные мыши - играют важную роль в выявлении нескольких существенных внеклеточных лигандов: GDNF (глиальных клеток нейротрофический фактор), эндотелина-3, нейротрофин-3, БМП (костные морфогенетические белки), Netrin , а также Соник и индийская Ежик (Тсс и Ihh) 5-10. Из них GDNF сигнализации через трансмембранный рецептор RET тирозинкиназы (переставить во трансфекции) признан йэ наиболее важным путем для привлечения и руководством НКК в и в эмбриональной кишки. GDNF секретируется кишечника мезенхимы и образует пространственно-временной контролируемый rosrrocaudal градиент, непосредственно chemoattractive к кишечной NCC, которые выражают РЭТ 11,12. Среди других функций, ЭНС регулирует движение в желудочно-кишечном тракте через его взаимодействие с гладкой мускулатуры в стенке кишечника. Отсутствие нервной ганглиев в концевой области результатов кишечника при болезни Гиршпрунга: тоническое сокращение пораженного сегмента приводит к закупорке, вверх по течению накопления сброженного материала и массивной живота кишки и брюшной полости. Болезнь Гиршпрунга происходит примерно один из 5000 живорожденных. Ростро-каудальном миграция картина кишечной NCC, как полагают, является основным фактором, способствующим этиологии болезни Гиршпрунга. Толстой кишки, удалена от источника миграции NCC и последнюю часть бOwel подвергшихся колонизации, является наиболее восприимчивы к дефектам в формировании ENS. В соответствии с его решающую роль в кишечной миграции NCC, нарушение GDNF / RET сигнализации является основным известным генетическая причина болезни Гиршпрунга 13. Чтобы лучше изучить NCC и развитие ENS, мы получили трансгенной линии мыши - по имени Gata4p [5kb]-GFP 14 - в которых миграционный NCC помечены зеленого флуоресцентного белка (GFP). Мы рядом усовершенствовал Экс Vivo миграции клеток анализа, адаптированный из опубликованных работ других групп 11,12,15, что теперь позволяет точное количественное определение кишечной NCC миграционного потенциала в присутствии различных факторов роста, таких как GDNF.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>DMEM powder</td>
			<td>Wisent</td>
			<td>219-010-XK</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaHCO3</td>
			<td>Bioshop</td>
			<td>SOB999</td>
			<td>Biotechnology grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Steriflip vacuum filtration system (0.22 micron)</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>SCGP00525</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicilin-Streptomycin solution, 100x</td>
			<td>Wisent</td>
			<td>450-201-EL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>Wisent</td>
			<td>095-150</td>
			<td>High quality grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagen I</td>
			<td>BD biosciences</td>
			<td>354236</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOH</td>
			<td>Bioshop</td>
			<td>SHY700</td>
			<td>Diluted from 10 N stock then sterile-filtered</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GDNF</td>
			<td>Cedarlane</td>
			<td>CLCYT305</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon 24-well Plate</td>
			<td>BD biosciences</td>
			<td>353047</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting scissors</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>089515</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Petri dish</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89000-306</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P5493</td>
			<td>Cell culture grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>M125</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #5 Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11251-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Bioshop</td>
			<td>AGA001</td>
			<td>Biotechnology grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical blade</td>
			<td>Feather</td>
			<td>21</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>All Purpose Instant Krazy Glue Pen</td>
			<td>Krazy Glue</td>
			<td>KG824</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HM 650V Vibrating-Blade Microtome</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>920110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P6148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D9564</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a quantitative cell migration assay for murine enteric neural progenitors

Клетки нервного гребня (NCC) являются временными и мультипотентны клеточная популяция, которая происходит от дорсальной части нервной трубки и мигрирует широко во всех развивающихся эмбрионов позвоночных. В дополнение к предоставлению периферийные глии и нейронов, NCC генерировать меланоциты, а также большую часть черепно-лицевого скелета. NCC миграция и дифференциация контролируется сочетанием их осевой происхождения вдоль нервной трубки и степень их подверженности региональном различных внеклеточных сигналов. Такой вклад внеклеточных лигандов особенно очевидно во время формирования кишечной нервной системы (ENS), сложной взаимосвязанной сети нейронной ганглиев, что локально управляет (среди прочего) движения кишечника мышц и моторики кишечника. Большая часть ENS происходит от малого начального пула NCC, что предпринять долгое путешествие, чтобы колонизировать - в ростральнее хвостового моды - по всей длине предполагаемого кишечнике. Среди нескольких сигнальных путей, известныхвлиять кишечно NCC колонизации, GDNF / сигнализации РЭТ признан самым важным. Действительно, пространственно-временной контролируется секреция РЭТ лиганда GDNF в кишечнике мезенхимы является главным ответственным за привлечение и руководством RET-выражения кишечной NCC к и в эмбриональной кишки. Здесь мы описываем экс виво анализа миграции клеток, что делает использование трансгенной линии мышей, обладающего флуоресцентно меченого NCC, которая позволяет точную количественную оценку кишечной NCC миграционного потенциала в присутствии различных факторов роста, в том числе GDNF.

Следующие результаты являются репрезентативными что могут быть получены с методикой, описанной здесь (рис. 1). Использование факторов роста (т.е. GDNF) стимулирует миграцию GFP-экспрессирующих кишечно NCC из кишечника эксплантата и в гель коллагена (рис. 2). Хотя некотор...

Watch this Scientific Journal Video about A Quantitative Cell Migration Assay for Murine Enteric Neural Progenitors at JoVE.com

A Quantitative Cell Migration Assay for Murine Enteric Neural Progenitors

Мы представляем Экс Vivo клеточную миграцию анализа, который позволяет точное количественное определение кишечной нервной миграции гребень клеток потенциала в присутствии различных факторов роста.

Количественный Анализ сотового мигрантах мышиных кишечных нейронных прародителей

Neural crest cells (NCC) are a transient and multipotent cell population that originates from the dorsal neural tube and migrates extensively throughout ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

A Thin-skull Window Technique for Chronic Two-photon In vivo Imaging of Murine Microglia in Models of Neuroinflammation

A Thin-skull Window Technique for Chronic Two-photon In vivo Imaging of Murine Microglia in Models of Neuroinflammation

Тонкие черепа Window Техника для Хронический Двухфотонное В естественных условиях Визуализация мышей микроглии в моделях Neuroinflammation

Traditionally in neuroscience, in vivo two photon imaging of the murine central nervous system has either involved the use of open-skull1,2 or ...

Establishing Embryonic Mouse Neural Stem Cell Culture Using the Neurosphere Assay

Создание эмбриональных Мышь нейронные культуры стволовых клеток Использование Neurosphere Пробирной

In mammalians, stem cells acts as a source of undifferentiated cells to maintain cell genesis and renewal in different tissues and organs during the life ...

Neural-Colony Forming Cell Assay: An Assay To Discriminate Bona Fide Neural Stem Cells from Neural Progenitor Cells

Neural-колония Формирование анализа клеточной: Пробирной различать Добросовестный нервные стволовые клетки из нервных клеток-предшественников

The neurosphere assay (NSA) is one of the most frequently used methods to isolate, expand and also calculate the frequency of neural stem cells (NSCs). ...

Analysis of Trunk Neural Crest Cell Migration using a Modified Zigmond Chamber Assay

Анализ Магистральные нейронной клеточной миграции Crest с использованием модифицированного Zigmond пробирной палаты

Neural crest cells (NCCs) are a transient population of cells present in vertebrate development that emigrate from the dorsal neural tube (NT) after ...

Reproducible Mouse Sciatic Nerve Crush and Subsequent Assessment of Regeneration by Whole Mount Muscle Analysis

Воспроизводимые мыши седалищного нерва и Давка Последующие оценки регенерации полного анализа горы мышц

Regeneration in the peripheral nervous system (PNS) is widely studied both for its relevance to human disease and to understand the robust regenerative ...

Analysis of Neural Crest Migration and Differentiation by Cross-species Transplantation

Анализ нейронной миграции Крест и дифференциация по межвидовой трансплантации

Avian embryos provide a unique platform for studying many vertebrate developmental processes, due to the easy access of the embryos within the egg. ...

The Neuroblast Assay: An Assay for the Generation and Enrichment of Neuronal Progenitor Cells from Differentiating Neural Stem Cell Progeny Using Flow Cytometry

Нейробластов Анализ: Анализ для создания и обогащения нейронов клетки-предшественники из Дифференцируя нейронных потомков стволовых клеток методом проточной цитометрии

Neural stem cells (NSCs) can be isolated and expanded in large-scale, using the neurosphere assay and differentiated into the three major cell types of ...

Isolation and Culture of Neural Crest Cells from Embryonic Murine Neural Tube

Выделение и культуры клеток нервного гребня из эмбриональных мышей нервной трубки

The embryonic neural crest (NC) is a multipotent progenitor population that originates at the dorsal aspect of the neural tube, undergoes an epithelial to ...

An Optimized Procedure for Fluorescence-activated Cell Sorting (FACS) Isolation of Autonomic Neural Progenitors from Visceral Organs of Fetal Mice

An Optimized Procedure for Fluorescence-activated Cell Sorting FACS Isolation of Autonomic Neural Progenitors from Visceral Organs of Fetal Mice

Оптимизирована процедура для флуоресцентной активированного сортировки клеток (FACS) Выделение вегетативной нервной прародителей из висцеральных органов плода мышей

During development neural crest (NC)-derived neuronal progenitors migrate away from the neural tube to form autonomic ganglia in visceral organs like the ...

A Galvanotaxis Assay for Analysis of Neural Precursor Cell Migration Kinetics in an Externally Applied Direct Current Electric Field

Гальванотаксис пробирного анализа нейронных клеток-предшественников Кинетика миграции извне постоянного тока электрическое поле

The discovery of neural stem and progenitor  cells (collectively termed neural precursor cells) (NPCs) in the adult  mammalian brain has led to a body of ...