Name: a quantitative cell migration assay for murine enteric neural progenitors
Uploaded: 2013-09-18T15:15:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Quantitative Cell Migration Assay for Murine Enteric Neural Progenitors at JoVE.com

Damos las gracias a Denis Flipo consejo de procesamiento de imágenes y análisis, y David W. Silversides en cuyo laboratorio se generó la línea de ratón Gata4p [5 kb]-GFP. La investigación en el laboratorio Pilon es financiado por CIHR, NSERC, FRQS y FRQNT.

Declaración de Ética Los experimentos con ratones se realizaron siguiendo Consejo Canadiense de Cuidado de Animales Directrices para el cuidado y la manipulación de los animales utilizados en la investigación médica. Protocolos que implican la manipulación de los animales fueron aprobados por el comité de ética institucional de la Universidad de Quebec en Montreal (Comité de Protección Institutionnel des Animaux; número de referencia 0512-R3-650-0513). 1. P...

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	<li>Bronner, M. E., Le Douarin, N. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+evolution+of+the+neural+crest:+An+overview.">Development and evolution of the neural crest: An overview.</a> Dev. Biol. 366 (1), 2-9 (2012).</li><li>Bergeron, K. F., Silversides, D. W., Pilon, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+developmental+genetics+of+Hirschsprung's+disease.">The developmental genetics of Hirschsprung's disease.</a> Clin. Genet. 83 (1), 15-22 (2013).</li><li>Obermayr, F., Hotta, R., Enomoto, H., Young, H. 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P., Silos-Santiago, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Renal+agenesis+and+the+absence+of+enteric+neurons+in+mice+lacking+GDNF.">Renal agenesis and the absence of enteric neurons in mice lacking GDNF.</a> Nature. 382 (6586), 70-73 (1996).</li><li>Baynash, A. G., Hosoda, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interaction+of+endothelin-3+with+endothelin-B+receptor+is+essential+for+development+of+epidermal+melanocytes+and+enteric+neurons.">Interaction of endothelin-3 with endothelin-B receptor is essential for development of epidermal melanocytes and enteric neurons.</a> Cell. 79 (7), 1277-1285 (1994).</li><li>Chalazonitis, A., Pham, T. 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D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Netrins+and+DCC+in+the+guidance+of+migrating+neural+crest-derived+cells+in+the+developing+bowel+and+pancreas.">Netrins and DCC in the guidance of migrating neural crest-derived cells in the developing bowel and pancreas.</a> Dev. Biol. 258 (2), 364-384 (2003).</li><li>Ramalho-Santos, M., Melton, D. A., McMahon, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hedgehog+signals+regulate+multiple+aspects+of+gastrointestinal+development.">Hedgehog signals regulate multiple aspects of gastrointestinal development.</a> Development. 127 (12), 2763-2772 (2000).</li><li>Natarajan, D., Marcos-Gutierrez, C., Pachnis, V., de Graaf, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Requirement+of+signaling+by+receptor+tyrosine+kinase+RET+for+the+directed+migration+of+enteric+nervous+system+progenitor+cells+during+mammalian+embryogenesis.">Requirement of signaling by receptor tyrosine kinase RET for the directed migration of enteric nervous system progenitor cells during mammalian embryogenesis.</a> Development. 129 (22), 5151-5160 (2002).</li><li>Young, H. M., Hearn, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GDNF+Is+a+chemoattractant+for+enteric+neural+cells.">GDNF Is a chemoattractant for enteric neural cells.</a> Dev. Biol. 229 (2), 503-516 (2001).</li><li>Amiel, J., Sproat-Emison, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hirschsprung+disease,+associated+syndromes+and+genetics:+a+review.">Hirschsprung disease, associated syndromes and genetics: a review.</a> J. Med. Genet. 45 (1), 1-14 (2008).</li><li>Pilon, N., Raiwet, D., Viger, R. S., Silversides, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+pre-+and+post-gastrulation+expression+of+Gata4+within+cells+of+the+inner+cell+mass+and+migratory+neural+crest+cells.">Novel pre- and post-gastrulation expression of Gata4 within cells of the inner cell mass and migratory neural crest cells.</a> Dev. Dyn. 237 (4), 1133-1143 (2008).</li><li>Nagy, N., Goldstein, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelin-3+regulates+neural+crest+cell+proliferation+and+differentiation+in+the+hindgut+enteric+nervous+system.">Endothelin-3 regulates neural crest cell proliferation and differentiation in the hindgut enteric nervous system.</a> Dev. Biol. 293 (1), 203-217 (2006).</li><li>Nagy, A., Gertsenstein, M., Vintersen, K., Behringer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Manipulating the mouse embryo: a laboratory manual. , 209-250 (2003).</li><li>Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NIH+Image+to+ImageJ:+25+years+of+image+analysis.">NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis.</a> Nat. Methods. 9, 671-675 (2012).</li><li>Byth, K. F., Thomas, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=AZD5438,+a+potent+oral+inhibitor+of+cyclin-dependent+kinases+1,+2,+and+9,+leads+to+pharmacodynamic+changes+and+potent+antitumor+effects+in+human+tumor+xenografts.">AZD5438, a potent oral inhibitor of cyclin-dependent kinases 1, 2, and 9, leads to pharmacodynamic changes and potent antitumor effects in human tumor xenografts.</a> Mol. Cancer Ther. 8 (7), 1856-1866 (2009).</li></ol>

Mostramos cómo nuestro vivo técnica de cultivo ex explante se puede utilizar para cuantificar con precisión entérica potencial de migración NCC en presencia de GDNF. Dicha cuantificación exacta es facilitada en gran medida por el uso de 200 micras de espesor secciones intestinales vibratome lugar de grandes piezas de tamaño aproximado, como se describe anteriormente 11,12,15. De hecho, esto nos permite trabajar con un número razonable de las células en un entorno altamente reproduci...

Células de la cresta neural (CCN) son un tipo de célula transitoria única de vertebrados que forma muchos derivados durante el desarrollo embrionario. Surge Esta población de células en la frontera de la placa neural, adyacente al ectodermo no neurales 1. Durante la neurulación, la flexión de los lugares placa neural NCC lo largo del borde dorsal del tubo neural formando. NCC luego se someten a una transición epitelio-mesenquimal, segregar y migrar lejos del tubo neural. NCC colonizar diversas estructuras embrionarias, incluyendo el tracto digestivo donde forman todo el sistema nervioso entérico (ENS), una red interconectada de los ganglios nerviosos incrustado en la pared intestinal. Tan recientemente revisado 2,3, muchos genes han sido implicados en el desarrollo de esta intrincada estructura. La mayor parte de la ENS se deriva de un pequeño grupo de NCC procedente del tubo neural vagal (es decir, en torno al límite prospectivo posterior del cerebro / médula espinal) 4.Estos progenitores neurales llegan al intestino anterior alrededor del día embrionario (e) 9.0 en ratones y luego migran caudalmente en el mesénquima intestinal hasta aproximadamente e15.0 colonizar todo el intestino embrionarias. Un subconjunto menor de progenitores neurales de colon también es proporcionada por sacra NCC, que invaden el intestino posterior en la dirección opuesta hasta el ciego 4. Tanto vagal y sacral NCC requiere múltiples migración, proliferación, supervivencia y diferenciación de las señales promotoras para asegurar la formación completa de la ENS. En este sentido, los modelos animales - especialmente ratones genéticamente modificados - han sido fundamentales para la identificación de varios ligandos extracelulares esenciales: GDNF (factor neurotrófico derivado de células gliales), la endotelina-3, la neurotrofina-3, (proteínas morfogenéticas óseas) BMP, Netrina , así como Sonic y erizo indio (Shh y Ihh) 5-10. De éstos, el GDNF señalización a través de la RET receptor transmembrana tirosina quinasa (Reordenación durante la transfección) se reconoce como the vía más importante para la atracción y la orientación de NCC y dentro del intestino embrionario. GDNF es secretada por el mesénquima intestino y forma un gradiente de rosrrocaudal espaciotemporalmente controlado que es directamente quimioatrayentes para entérico NCC, que expresan RET 11,12. Entre otras funciones, la ENS regula el movimiento en el tracto digestivo a través de su interacción con el músculo liso de la pared intestinal. Ausencia de los ganglios de los nervios en la región terminal de los resultados del intestino en la enfermedad de Hirschsprung: contracción tónica del segmento afectado conduce a la obstrucción, la acumulación de aguas arriba del material digerido y distensión masiva del intestino y el abdomen. La enfermedad de Hirschsprung ocurre aproximadamente uno de cada 5.000 nacidos vivos. Se cree que el patrón de migración rostro-caudal del entérica NCC siendo el principal factor que contribuye a la etiología de la enfermedad de Hirschsprung. El colon, más alejado de la fuente de la migración de NCC y última porción del bowel ser colonizado, es más susceptible a defectos en la formación ENS. De acuerdo con su papel crucial en la migración NCC entérica, la alteración de la señalización de GDNF / RET es la principal causa genética conocida de la enfermedad de Hirschsprung 13. Para un mejor estudio de NCC y desarrollo ENS, hemos generado una línea de ratones transgénicos - llamado Gata4p [5 kb]-GFP 14 - en la que NCC migratoria están etiquetados con la proteína verde fluorescente (GFP). A continuación perfeccionado un ensayo ex vivo la migración celular, adaptado a partir de los trabajos publicados por otros grupos 11,12,15, que ahora permite la cuantificación precisa de entérica potencial de migración NCC en la presencia de varios factores de crecimiento, tales como el GDNF.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>DMEM powder</td>
			<td>Wisent</td>
			<td>219-010-XK</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaHCO3</td>
			<td>Bioshop</td>
			<td>SOB999</td>
			<td>Biotechnology grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Steriflip vacuum filtration system (0.22 micron)</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>SCGP00525</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicilin-Streptomycin solution, 100x</td>
			<td>Wisent</td>
			<td>450-201-EL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>Wisent</td>
			<td>095-150</td>
			<td>High quality grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagen I</td>
			<td>BD biosciences</td>
			<td>354236</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOH</td>
			<td>Bioshop</td>
			<td>SHY700</td>
			<td>Diluted from 10 N stock then sterile-filtered</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GDNF</td>
			<td>Cedarlane</td>
			<td>CLCYT305</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon 24-well Plate</td>
			<td>BD biosciences</td>
			<td>353047</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting scissors</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>089515</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Petri dish</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89000-306</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P5493</td>
			<td>Cell culture grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>M125</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #5 Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11251-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Bioshop</td>
			<td>AGA001</td>
			<td>Biotechnology grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical blade</td>
			<td>Feather</td>
			<td>21</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>All Purpose Instant Krazy Glue Pen</td>
			<td>Krazy Glue</td>
			<td>KG824</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HM 650V Vibrating-Blade Microtome</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>920110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P6148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D9564</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a quantitative cell migration assay for murine enteric neural progenitors

Células de la cresta neural (CCN) son una población de células multipotentes transitoria y que se origina en el tubo neural dorsal y migra extensamente por todo el embrión de los vertebrados en desarrollo. Además de proporcionar la glía y neuronas periféricas, NCC generar los melanocitos, así como la mayor parte del esqueleto cráneo-facial. NCC la migración y la diferenciación está controlada por una combinación de su origen axial a lo largo del tubo neural y su exposición a las señales extracelulares regionalmente distintas. Tal contribución de ligandos extracelulares es especialmente evidente durante la formación del sistema nervioso entérico (ENS), una compleja red interconectada de los ganglios nerviosos que controla localmente (entre otras cosas) el movimiento del músculo intestinal y la motilidad intestinal. La mayor parte de la ENS se deriva de un pequeño grupo inicial de NCC que emprenda un largo viaje con el fin de colonizar - en una rostral caudal a la moda - la longitud completa del intestino prospectivo. Entre varias vías de señalización que se sabe queinfluir en la colonización entérica NCC, GDNF señalización / RET es reconocido como el más importante. De hecho, la secreción espaciotemporalmente controlada del ligando RET GDNF por el mesénquima intestinal es el principal responsable de la atracción y la orientación de RET-expresando entérica NCC hacia y dentro del intestino embrionario. Aquí, se describe un ensayo ex vivo la migración celular, haciendo uso de una línea de ratón transgénico que posee la etiqueta fluorescente NCC, que permite la cuantificación precisa de entérica potencial de migración NCC en la presencia de varios factores de crecimiento, incluyendo el GDNF.

Los siguientes resultados son representativos de lo que se puede obtener con la técnica descrita aquí (Figura 1). El uso de factores de crecimiento (es decir, GDNF) estimula la migración de expresión de GFP-entérica NCC fuera del explante intestinal y en el gel de colágeno (Figura 2). Aunque algunas células salen del explante en ausencia de factores de crecimiento, éstos en su mayoría no son GFP-etiquetados y representan la entrada pasiva. Es necesario quitar la rebana...

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A Quantitative Cell Migration Assay for Murine Enteric Neural Progenitors

Se presenta un ensayo in vivo la migración ex célula que permite la cuantificación precisa de los nervios potencial de migración de células de la cresta entérica en la presencia de varios factores de crecimiento.

Un ensayo de migración celular cuantitativa para murinos entéricas Neuronales Progenitores

Neural crest cells (NCC) are a transient and multipotent cell population that originates from the dorsal neural tube and migrates extensively throughout ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

A Thin-skull Window Technique for Chronic Two-photon In vivo Imaging of Murine Microglia in Models of Neuroinflammation

A Thin-skull Window Technique for Chronic Two-photon In vivo Imaging of Murine Microglia in Models of Neuroinflammation

Una delgada del cráneo ventana Técnica para la crónica de dos fotones En vivo Imágenes de la microglía murina en los modelos de la neuroinflamación

Traditionally in neuroscience, in vivo two photon imaging of the murine central nervous system has either involved the use of open-skull1,2 or ...

Investigación

Neurociencias

Establishing Embryonic Mouse Neural Stem Cell Culture Using the Neurosphere Assay

El establecimiento de embriones de ratón con células madre neurales Cultura mediante el ensayo de neuroesfera

In mammalians, stem cells acts as a source of undifferentiated cells to maintain cell genesis and renewal in different tissues and organs during the life ...

Neural-Colony Forming Cell Assay: An Assay To Discriminate Bona Fide Neural Stem Cells from Neural Progenitor Cells

Neural formadoras de colonias ensayo de células: un ensayo para discriminar Bona Fide células troncales nerviosas de células progenitoras neurales

The neurosphere assay (NSA) is one of the most frequently used methods to isolate, expand and also calculate the frequency of neural stem cells (NSCs). ...

Analysis of Trunk Neural Crest Cell Migration using a Modified Zigmond Chamber Assay

El análisis de la migración de células troncales neurales Crest utilizando una versión modificada del ensayo Zigmond Cámara

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Reproducible Mouse Sciatic Nerve Crush and Subsequent Assessment of Regeneration by Whole Mount Muscle Analysis

Ratón reproducible aplastamiento del nervio ciático y posterior evaluación de la regeneración mediante el análisis de músculo entero Monte

Regeneration in the peripheral nervous system (PNS) is widely studied both for its relevance to human disease and to understand the robust regenerative ...

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Análisis de la migración de la cresta neural y la diferenciación de las especies cruzadas Trasplante

Avian embryos provide a unique platform for studying many vertebrate developmental processes, due to the easy access of the embryos within the egg. ...

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El ensayo neuroblasto: un ensayo para la generación y enriquecimiento de las células progenitoras neuronales de la diferenciación de la progenie de células madre neurales Usando citometría de flujo

Neural stem cells (NSCs) can be isolated and expanded in large-scale, using the neurosphere assay and differentiated into the three major cell types of ...

Isolation and Culture of Neural Crest Cells from Embryonic Murine Neural Tube

Aislamiento y cultivo de células de la cresta neural de embriones murinos del Tubo Neural

The embryonic neural crest (NC) is a multipotent progenitor population that originates at the dorsal aspect of the neural tube, undergoes an epithelial to ...

An Optimized Procedure for Fluorescence-activated Cell Sorting (FACS) Isolation of Autonomic Neural Progenitors from Visceral Organs of Fetal Mice

An Optimized Procedure for Fluorescence-activated Cell Sorting FACS Isolation of Autonomic Neural Progenitors from Visceral Organs of Fetal Mice

Un procedimiento optimizado para el activado por fluorescencia de células de clasificación (FACS) El aislamiento de progenitores neurales autónomas de los órganos viscerales de los fetos de ratones

During development neural crest (NC)-derived neuronal progenitors migrate away from the neural tube to form autonomic ganglia in visceral organs like the ...

A Galvanotaxis Assay for Analysis of Neural Precursor Cell Migration Kinetics in an Externally Applied Direct Current Electric Field

Un ensayo Galvanotaxis por análisis de la cinética precursoras neurales migración celular en un campo aplicado externamente directo Corriente Eléctrica

The discovery of neural stem and progenitor  cells (collectively termed neural precursor cells) (NPCs) in the adult  mammalian brain has led to a body of ...