Name: a quantitative cell migration assay for murine enteric neural progenitors
Uploaded: 2013-09-18T15:15:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Quantitative Cell Migration Assay for Murine Enteric Neural Progenitors at JoVE.com

Vi tackar Denis Flipo för bildbehandling och analys rådgivning, och David W. Silver i vars laboratorium för Gata4p [5kb]-GFP mus linje genererades. Forskning i Pilon laboratorium finansieras av CIHR, NSERC, FRQS och FRQNT.

Ethics uttalande Experiment med möss utfördes efter kanadensiska Rådet Animal Care riktlinjer för vård och hantering av djur som används i medicinsk forskning. Protokoll som innebär manipulation av djur godkändes av institutionella etiska kommittén vid University of Quebec i Montreal (Comité Institutionnel de Protection des Animaux, referensnummer 0512-R3-650 till 0513). 1. Beredning av kollagengeler Arbete på sterilt sätt unde...

<ol>
	<li>Bronner, M. E., Le Douarin, N. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+evolution+of+the+neural+crest:+An+overview.">Development and evolution of the neural crest: An overview.</a> Dev. Biol. 366 (1), 2-9 (2012).</li><li>Bergeron, K. F., Silversides, D. W., Pilon, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+developmental+genetics+of+Hirschsprung's+disease.">The developmental genetics of Hirschsprung's disease.</a> Clin. Genet. 83 (1), 15-22 (2013).</li><li>Obermayr, F., Hotta, R., Enomoto, H., Young, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+developmental+disorders+of+the+enteric+nervous+system.">Development and developmental disorders of the enteric nervous system.</a> Nat. Rev. Gastroenterol. Hepatol. 10 (1), 43-57 (2012).</li><li>Sasselli, V., Pachnis, V., Bursn, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+enteric+nervous+system.">The enteric nervous system.</a> Dev. Biol. 366 (1), 64-73 (2012).</li><li>Sanchez, M. P., Silos-Santiago, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Renal+agenesis+and+the+absence+of+enteric+neurons+in+mice+lacking+GDNF.">Renal agenesis and the absence of enteric neurons in mice lacking GDNF.</a> Nature. 382 (6586), 70-73 (1996).</li><li>Baynash, A. G., Hosoda, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interaction+of+endothelin-3+with+endothelin-B+receptor+is+essential+for+development+of+epidermal+melanocytes+and+enteric+neurons.">Interaction of endothelin-3 with endothelin-B receptor is essential for development of epidermal melanocytes and enteric neurons.</a> Cell. 79 (7), 1277-1285 (1994).</li><li>Chalazonitis, A., Pham, T. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurotrophin-3+is+required+for+the+survival-differentiation+of+subsets+of+developing+enteric+neurons.">Neurotrophin-3 is required for the survival-differentiation of subsets of developing enteric neurons.</a> J. Neurosci. 21 (15), 5620-5636 (2001).</li><li>Goldstein, A. M., Brewer, K. C., Doyle, A. M., Nagy, N., Roberts, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BMP+signaling+is+necessary+for+neural+crest+cell+migration+and+ganglion+formation+in+the+enteric+nervous+system.">BMP signaling is necessary for neural crest cell migration and ganglion formation in the enteric nervous system.</a> Mech. Dev. 122 (6), 821-833 (2005).</li><li>Jiang, Y., Liu, M. T., Gershon, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Netrins+and+DCC+in+the+guidance+of+migrating+neural+crest-derived+cells+in+the+developing+bowel+and+pancreas.">Netrins and DCC in the guidance of migrating neural crest-derived cells in the developing bowel and pancreas.</a> Dev. Biol. 258 (2), 364-384 (2003).</li><li>Ramalho-Santos, M., Melton, D. A., McMahon, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hedgehog+signals+regulate+multiple+aspects+of+gastrointestinal+development.">Hedgehog signals regulate multiple aspects of gastrointestinal development.</a> Development. 127 (12), 2763-2772 (2000).</li><li>Natarajan, D., Marcos-Gutierrez, C., Pachnis, V., de Graaf, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Requirement+of+signaling+by+receptor+tyrosine+kinase+RET+for+the+directed+migration+of+enteric+nervous+system+progenitor+cells+during+mammalian+embryogenesis.">Requirement of signaling by receptor tyrosine kinase RET for the directed migration of enteric nervous system progenitor cells during mammalian embryogenesis.</a> Development. 129 (22), 5151-5160 (2002).</li><li>Young, H. M., Hearn, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GDNF+Is+a+chemoattractant+for+enteric+neural+cells.">GDNF Is a chemoattractant for enteric neural cells.</a> Dev. Biol. 229 (2), 503-516 (2001).</li><li>Amiel, J., Sproat-Emison, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hirschsprung+disease,+associated+syndromes+and+genetics:+a+review.">Hirschsprung disease, associated syndromes and genetics: a review.</a> J. Med. Genet. 45 (1), 1-14 (2008).</li><li>Pilon, N., Raiwet, D., Viger, R. S., Silversides, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+pre-+and+post-gastrulation+expression+of+Gata4+within+cells+of+the+inner+cell+mass+and+migratory+neural+crest+cells.">Novel pre- and post-gastrulation expression of Gata4 within cells of the inner cell mass and migratory neural crest cells.</a> Dev. Dyn. 237 (4), 1133-1143 (2008).</li><li>Nagy, N., Goldstein, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelin-3+regulates+neural+crest+cell+proliferation+and+differentiation+in+the+hindgut+enteric+nervous+system.">Endothelin-3 regulates neural crest cell proliferation and differentiation in the hindgut enteric nervous system.</a> Dev. Biol. 293 (1), 203-217 (2006).</li><li>Nagy, A., Gertsenstein, M., Vintersen, K., Behringer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Manipulating the mouse embryo: a laboratory manual. , 209-250 (2003).</li><li>Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NIH+Image+to+ImageJ:+25+years+of+image+analysis.">NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis.</a> Nat. Methods. 9, 671-675 (2012).</li><li>Byth, K. F., Thomas, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=AZD5438,+a+potent+oral+inhibitor+of+cyclin-dependent+kinases+1,+2,+and+9,+leads+to+pharmacodynamic+changes+and+potent+antitumor+effects+in+human+tumor+xenografts.">AZD5438, a potent oral inhibitor of cyclin-dependent kinases 1, 2, and 9, leads to pharmacodynamic changes and potent antitumor effects in human tumor xenografts.</a> Mol. Cancer Ther. 8 (7), 1856-1866 (2009).</li></ol>

Vi visar hur våra ex vivo Explantation kultur teknik kan användas för att exakt kvantifiera enter NCC migrationspotentialen i närvaro av GDNF. Sådana exakta kvantifiering underlättas i hög grad genom att använda 200 nm-tjocka vibratome tarmsektioner i stället för stora bitar av ungefärlig storlek, som tidigare beskrivits 11,12,15. I själva verket kan vi genom att arbeta med ett rimligt antal celler i en mycket reproducerbar inställning. Att notera, den likformiga fördelningen av fluores...

Neurallistceller (NCC) är en övergående celltyp unik för ryggradsdjur som bildar många derivat under embryoutveckling. Denna cellpopulation uppkommer vid gränsen av det neurala plattan, som gränsar till icke-neural ektoderm 1. Under neurulation, böjning av de neurala platt ställen NCC längs den dorsala kanten av formnings neuralröret. NCC genomgår sedan en epitelial-mesenkymala övergång, segregerande och migrera bort från neuralrörsdefekter. NCC kolonisera olika embryonala strukturer, bland annat mag-tarmkanalen där de bildar hela det enteriska nervsystemet (ENS), ett sammanlänkat nätverk av neurala ganglierna inbäddad i tarmväggen. Så sent omdömet 2,3 har många gener som varit inblandade i utvecklingen av denna invecklade struktur. De flesta av ENS kommer från en liten pool av NCC har sitt ursprung från den vagala neuralrörsdefekter (dvs. runt den blivande hindbrain / ryggmärgen gränsen) 4.Dessa neurala stamceller når framtarmen kring embryonala dag (e) 9.0 i möss och sedan vandrar kaudalt i tarmen mesenkymet tills ca e15.0 att kolonisera hela embryonala tarmarna. En mindre delmängd av colonic neurala stamceller ges också av sakral NCC, som invaderar den bakre tarmen i motsatt riktning upp till cekum 4. Både vagala och sakrala NCC kräver flera migration-, spridning-, överlevnad-och differentieringsfrämjande ledtrådar för att garantera fullständig bildandet av ENS. I detta avseende djurmodeller - särskilt genetiskt modifierade möss - har varit avgörande för att identifiera flera viktiga extracellulära ligander: GDNF (gliacell-neurotrofa faktor), endotelin-3, neurotrofin-3, BMP (benmorfogena proteiner), Netrin , samt Sonic och indiska Hedgehog (Shh och Ihh) 5-10. Av dessa är GDNF signalering via tyrosinkinas membranreceptor RET (ordnas under transfektion) erkänd som the mest kritiska vägen för attraktion och ledning av NCC och inom den embryonala tarmen. GDNF utsöndras av tarmens mesenkym och bildar en spatiotemporally kontrollerad rosrrocaudal gradient som är direkt chemoattractive till enterisk NCC, som uttrycker RET 11,12. Bland andra funktioner, ENS reglerar rörligheten inom mag-tarmkanalen genom dess interaktion med glatta muskulaturen i tarmväggen. Frånvaro av neurala ganglierna i terminala regionen i tarmen leder till Hirschsprungs sjukdom: tonisk kontraktion av den påverkade segment leder till blockering, uppströms ackumulering av digererat material och massiv uttänjning av tarmen och magen. Hirschsprungs sjukdom inträffar ungefär en i 5.000 levande födda. Den rostro-caudal migrationsmönster enter NCC tros vara den främsta bidragande faktorn till etiologin av Hirschsprungs sjukdom. Tjocktarmen, längst bort från källan att migrera NCC och sista delen av bowel att koloniseras, är mest mottagliga för defekter i ENS formation. I enlighet med sin avgörande roll i enter NCC migration, är störningar i GDNF / RET signalering den viktigaste kända genetiska orsaken till Hirschsprungs sjukdom 13. För att bättre studera NCC och ENS utveckling, vi genererat en transgen mus linje - som heter Gata4p [5kb]-GFP 14 - där flyttande NCC är märkta med grönt fluorescerande protein (GFP). Vi fulländade bredvid ett ex vivo cellmigrationsassay, anpassat från publicerade verk av andra grupper 11,12,15, som nu ger en exakt kvantifiering av enter NCC migrationspotentialen i närvaro av olika tillväxtfaktorer, såsom GDNF.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>DMEM powder</td>
			<td>Wisent</td>
			<td>219-010-XK</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaHCO3</td>
			<td>Bioshop</td>
			<td>SOB999</td>
			<td>Biotechnology grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Steriflip vacuum filtration system (0.22 micron)</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>SCGP00525</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicilin-Streptomycin solution, 100x</td>
			<td>Wisent</td>
			<td>450-201-EL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>Wisent</td>
			<td>095-150</td>
			<td>High quality grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagen I</td>
			<td>BD biosciences</td>
			<td>354236</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOH</td>
			<td>Bioshop</td>
			<td>SHY700</td>
			<td>Diluted from 10 N stock then sterile-filtered</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GDNF</td>
			<td>Cedarlane</td>
			<td>CLCYT305</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon 24-well Plate</td>
			<td>BD biosciences</td>
			<td>353047</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting scissors</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>089515</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Petri dish</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89000-306</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P5493</td>
			<td>Cell culture grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>M125</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #5 Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11251-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Bioshop</td>
			<td>AGA001</td>
			<td>Biotechnology grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical blade</td>
			<td>Feather</td>
			<td>21</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>All Purpose Instant Krazy Glue Pen</td>
			<td>Krazy Glue</td>
			<td>KG824</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HM 650V Vibrating-Blade Microtome</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>920110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P6148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D9564</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a quantitative cell migration assay for murine enteric neural progenitors

Neurallistceller (NCC) är en övergående och multicellpopulation som härstammar från den dorsala neuralröret och vandrar mycket i hela utvecklings ryggradsdjur embryot. Förutom att ge perifera glia och nervceller, NCC genererar melanocyter samt de flesta av kranio-och ansiktsskelett. NCC migration och differentiering styrs av en kombination av deras axiella ursprung längs neuralröret och deras exponering för regionalt distinkta extracellulära signaler. Sådant bidrag cellulära ligander är särskilt tydligt under bildandet av det enteriska nervsystemet (ENS), ett komplext sammankopplade nätverk av neurala ganglierna som lokalt styr (bland annat) gut muskelrörelser och intestinal motilitet. Merparten av ILE är härledd från en liten initial pool av NCC att genomföra en lång resa för att kolonisera - i en rostralt till kaudalt fashion - hela längden av den blivande tarmen. Bland flera signalvägar som är kända förpåverka enter NCC kolonisering, är GDNF / RET signalering erkänd som den viktigaste. Faktum är spatiotemporally kontrollerad utsöndring av RET liganden GDNF av tarmen mesenkymet huvudansvarig för attraktion och vägledning av RET-uttryckenter NCC och inom den embryonala tarmen. Här beskriver vi en ex vivo cell migration assay, med användning av en transgen mus linje besitter fluorescensmärkt NCC, som tillåter exakt kvantifiering av magsaftresistent NCC migrationspotentialen i närvaro av olika tillväxtfaktorer, inklusive GDNF.

Följande resultat är representativt för vad som kan uppnås med den teknik som beskrivs här (se figur 1). Användningen av tillväxtfaktorer (dvs. GDNF) stimulerar migrering av GFP-uttryck enterisk NCC ur tarm explantatet och in i kollagen-gel (Figur 2). Även om vissa celler kommer ut från explantatet i frånvaro av tillväxtfaktorer, dessa är oftast inte GFP-märkta och representerar passivt inträde. Det är nödvändigt att ta bort tarm bit från kollagengelen för at...

Watch this Scientific Journal Video about A Quantitative Cell Migration Assay for Murine Enteric Neural Progenitors at JoVE.com

A Quantitative Cell Migration Assay for Murine Enteric Neural Progenitors

Vi presenterar en ex vivo cellmigrationsassay som tillåter exakt kvantifiering av magsaftresistent neural crest cell migration potentialen i närvaro av olika tillväxtfaktorer.

En kvantitativ cellmigrationsassay för Murina Enter Neural stamfäder

Neural crest cells (NCC) are a transient and multipotent cell population that originates from the dorsal neural tube and migrates extensively throughout ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

A Thin-skull Window Technique for Chronic Two-photon In vivo Imaging of Murine Microglia in Models of Neuroinflammation

A Thin-skull Window Technique for Chronic Two-photon In vivo Imaging of Murine Microglia in Models of Neuroinflammation

En tunn-skalle Fönster Teknik för kronisk två-photon In vivo Imaging av murina mikroglia i modeller av Neuroinflammation

Traditionally in neuroscience, in vivo two photon imaging of the murine central nervous system has either involved the use of open-skull1,2 or ...

Establishing Embryonic Mouse Neural Stem Cell Culture Using the Neurosphere Assay

Etablera Embryonala Mus Neurala Kultur Stem Cell Använda Neurosphere analys

In mammalians, stem cells acts as a source of undifferentiated cells to maintain cell genesis and renewal in different tissues and organs during the life ...

Neural-Colony Forming Cell Assay: An Assay To Discriminate Bona Fide Neural Stem Cells from Neural Progenitor Cells

Neural-kolonibildande Cell-analys: en analys att diskriminera Bona Fide neuronala stamceller från neurala stamceller

The neurosphere assay (NSA) is one of the most frequently used methods to isolate, expand and also calculate the frequency of neural stem cells (NSCs). ...

Analysis of Trunk Neural Crest Cell Migration using a Modified Zigmond Chamber Assay

Analys av Trunk neurallist cellmigration med en modifierad Zigmond Chamber analys

Neural crest cells (NCCs) are a transient population of cells present in vertebrate development that emigrate from the dorsal neural tube (NT) after ...

Reproducible Mouse Sciatic Nerve Crush and Subsequent Assessment of Regeneration by Whole Mount Muscle Analysis

Reproducerbar Mouse ischiasnerv krossa och påföljande bedömningen av Regeneration av Whole Mount Muscle Analys

Regeneration in the peripheral nervous system (PNS) is widely studied both for its relevance to human disease and to understand the robust regenerative ...

Analysis of Neural Crest Migration and Differentiation by Cross-species Transplantation

Analys av Neural Crest migration och differentiering av Cross-arter Transplantation

Avian embryos provide a unique platform for studying many vertebrate developmental processes, due to the easy access of the embryos within the egg. ...

The Neuroblast Assay: An Assay for the Generation and Enrichment of Neuronal Progenitor Cells from Differentiating Neural Stem Cell Progeny Using Flow Cytometry

Den Neuroblast Analys: En analys för generering och anrikning av neuronala progenitorceller från Skilja Neural Stem Cell Progeny med hjälp av flödescytometri

Neural stem cells (NSCs) can be isolated and expanded in large-scale, using the neurosphere assay and differentiated into the three major cell types of ...

Isolation and Culture of Neural Crest Cells from Embryonic Murine Neural Tube

Isolering och odling av neurallistceller från embryonala Murine Neural Tube

The embryonic neural crest (NC) is a multipotent progenitor population that originates at the dorsal aspect of the neural tube, undergoes an epithelial to ...

An Optimized Procedure for Fluorescence-activated Cell Sorting (FACS) Isolation of Autonomic Neural Progenitors from Visceral Organs of Fetal Mice

An Optimized Procedure for Fluorescence-activated Cell Sorting FACS Isolation of Autonomic Neural Progenitors from Visceral Organs of Fetal Mice

Ett optimerat förfarande för fluorescens-aktiverad cellsortering (FACS) Isolering av autonom neural progenitorer från viscerala organ för Fetala Möss

During development neural crest (NC)-derived neuronal progenitors migrate away from the neural tube to form autonomic ganglia in visceral organs like the ...

A Galvanotaxis Assay for Analysis of Neural Precursor Cell Migration Kinetics in an Externally Applied Direct Current Electric Field

En Galvanotaxis analys för analys av neurala Migration prekursorcell Kinetik i en extern Applied likström Electric Field

The discovery of neural stem and progenitor  cells (collectively termed neural precursor cells) (NPCs) in the adult  mammalian brain has led to a body of ...